Immunoglobulins are proteins produced by plasma cells and humans normally produce five different immunoglobulin classes of IgG, IgA, IgM, IgD and IgE. The basic function of the immunoglobulins is to counteract the invasion of pathogenic organisms by their antibody activity and to protect against its toxic products. The basic structure of the immunoglobulins is made up of two identical heavy chains and two light chains, kappa and lambda. In healthy subjects, normal plasma cell contents of the bone marrow are 1-3 %, in patients with multiple myeloma (MM), concentrations increase to over 90 % and are comprised of a malignant transplanted plasma cell clone. This clone of cells produces a kind of immunoglobulin that can be detected using various laboratory methods in both serum and urine. Analysis of free light immunoglobulin chains (kappa and lambda) in human serum occurs in the diagnosis and follow-up of MM and provides a simpler and faster alternative to daily urine collection for the analysis of light immunoglobulin chains in the urine. The purpose of the study was to carry out a method verification of free light chains in serum using an automated immunochemical instrument, BN Prospec II from Siemens, which uses the nephelometric measuring principle (antigen-antibody complex). The calibration concentrations of kappa and lambda assigned by Siemens were met. The method's stability and precision were measured by analyzing high and low controls for both analytes in each of the internal and total series. Within the series received CV 1,47 % for SL1 kappa and 2,57 % for SL2 kappa, and 1,77 % for SL1 lambda and 2,57 % for SL2 lambda. The total series was obtained CV 1,58 % for SL1 kappa and 2,81 % for SL2 kappa and CV 2,05 % for SL1 lambda and 2,30 % for SL2 lambda. The correctness of the method was studied through a patient comparison where 64 patient samples previously analyzed in Lund were analyzed in Kalmar. The study showed good precision and repeatability, the results of the patient comparison showed good correspondence with corresponding methods performed in Lund when the coefficient of determination for S-FLC-kappa was 0, 999 and 0, 958 for S-FLC-lambda. The conclusion is that analysis of free light chains in serum can be used in routine operation in the laboratory for clinical chemistry and transfusion medicine at the county hospital in Kalmar.

Försämrat immunförsvar och ökad risk att drabbas av bakterie- och virusinfektioner förekommer hos patienter med blodsjukdomarna multipelt myelom, Waldenströms makroglobulinemi samt hos vissa patienter med blodsjukdomen monoklonal gammopati av oklar signifikans. Infektionerna kräver ofta antibiotikabehandling och behandling med antivirala medel. I dagsläget är det svårt att förutsäga vilka av patienterna som kommer att drabbas av svåra och ibland livshotande infektioner. Därför ges många av patienterna förebyggande antibiotikabehandling. I studiens början sattes en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för detektion av antikroppar mot Moraxella catarrhalis upp. I studien undersöktes om antikroppstitrar i serum mot bakterien Moraxella catarrhalis var lägre hos patientgrupperna än hos friska kontrollpersoner i samma ålder och om variationer förekom mellan patientgrupperna samt hur kontrollgrupper i olika åldrar skiljde sig från varandra. Kontrollgrupperna som undersöktes var mellan 20-40 år, 40-60 år samt 60 år och äldre. Resultatet var att patienterna med multipelt myelom hade lägst antikroppstitrar, patienter med monoklonal gammopati av oklar signifikans hade något högre och patienter med Waldenströms makroglobulinemi hade ännu högre antikroppstitrar. Kontrollgruppen äldre än 60 år hade högre antikroppstitrar än både kontrollgruppen 20-40 år och 40-60 år. Lägst antikroppstitrar hade kontrollgrupp 40-60 år men ingen signifikant skillnad påvisades mellan kontrollgrupp 20-40 år och 40-60 år.

Introduktion Autolog stamcellstransplantation är idag en vanlig behandling vid myelom och högmaligna lymfom hos patienter <65 år utan omfattande komorbiditet. Behandlingen delas upp i fem faser: induktionsbehandling, stamcellsmobilisering, stamcellsskörd, konditionering med högdoscytostatika och stamcellsåtergivning/transplantation. Initialt behandlades alla patienter som genomgick autolog stamcellstransplantation inom slutenvården under den sista behandlingsfasen, det vill säga i samband med konditionering och stamcellsåtergivning. Sedan 1990-talet har man dock på många håll i världen övergått till poliklinisk vårdform för denna patientgrupp. Detta innebär att patienten genomgår stamcellstransplantationen inom slutenvården men efter detta behandlas som öppenvårdspatient med fasta återbesök på sin hemklinik under posttransplantfasen. Poliklinisk vårdform har visat sig vara en säker, uppskattad och kostnadseffektiv vårdform som inte medför större risker för patienten och som inte ökar mortalitet och/eller morbiditet i samband autolog stamcellstransplantation. Syfte Syftet med denna studie är att undersöka om det föreligger skillnad i grad av cytostatikarelaterat fördröjt illamående och kräkningar mellan patienter som vårdats polikliniskt jämfört med patienter som vårdats inneliggande på vårdavdelning efter autolog stamcellstransplantation. Metod Studiepopulationen utgörs av 91 patienter varav 33 vårdades polikliniskt och 58 vårdades inom slutenvården efter autolog stamcellstransplantation. Patienterna fyllde i en illamåendedagbok i samband med behandlingen varpå dessa analyserades utifrån variabler gällande cytostatikarelaterat fördröjt illamående och kräkningar. Resultat Resultatet visar att de polikliniserade patienterna mår generellt bättre än de icke- polikliniserade patienterna vad gäller cytostatikarelaterat fördröjt illamående och kräkningar. Sammanfattning Föreliggande studie indikerar ett positivt samband mellan poliklinisk vårdform och lägre incidens av cytostatikarelaterat fördröjt illamående och kräkningar hos patienter som genomgår autolog stamcellstransplantation. / Introduction Treatment for myeloma and lymphoma today typically involves autologous stem cell transplantation for patients <65 years without coexisting comorbidity. The treatment consists of five stages: induction treatment, stem cell mobilisation, stem cell harvest, conditioning with high dose chemotherapy and stem cell rescue (transplantation). Historically all patients treated with autologous stem cell transplantation received treatment as inpatients but this practice has since the 1990ies, due to for instance financial reasons, gradually shifted into an outpatient approach to this line of care. Thus, for the patient the outpatient approach entails myeloablative conditioning and stem cell transplantation as inpatient followed by post transplant care as outpatient part of the home clinic’s outpatient program. Outpatient care following autologous stem cell transplantation has proven to be a safe, highly appreciated and cost effective method of care without any adverse effects on behalf of the patients with regards to clinical outcome, mortality and/or comorbidity. Objectives The aim of this study is to ascertain whether or not there is a difference in degree of chemotherapy-induced delayed nausea and vomiting between an outpatient population and an inpatient population following autologous stem cell transplantation. Methods A total of 91 patients, 33 of whom were included in an outpatient program while remaining 58 were treated as regular inpatients, participated in the study. Patients each day filled out a diary with regards to nausea and emesis during the entire treatment phase. Submitted data was then analysed concerning parameters related to chemotherapy-induced delayed nausea and vomiting. Results The result shows that the outpatient population suffers less in general than the inpatient population in terms of chemotherapy-induced delayed nausea and vomiting. Conclusion To conclude, this study suggests a positive correlation between outpatient care following autologous stem cell transplantation and a lower incidence of chemotherapy-induced delayed nausea and vomiting.

Hintergrund: Während die Monotherapie mit Lenalidomid (Revlimid®) bei der Behandlung von rezidivierten/refraktären Patienten mit Multiplem Myelom (MM) bewährt ist, werden Kombinationstherapien mit Lenalidomid immer noch untersucht. In der vorliegenden Dosisfindungsstudie wurde eine Kombinationstherapie bestehend aus Lenalinomid, Bendamustin und Prednisolon (RBP) an Patienten mit fortgeschrittenem MM getestet. Methoden: Die erste Patientenkontrollgruppe erhielt eine Anfangsdosis Lenalidomid von 10 mg/d d1-21, Bendamustin von 60 mg/m²/d d1-2 und Prednisolon von 100 mg/d d1-4. Weitere Patientengruppen (jeweils 3-6 Personen) erhielten in Stufen eine steigende Lenalidomid-Dosis von 15, 20 sowie 25 mg und nach Erreichen von 25 mg Lenalidomid eine ansteigende Dosis Bendamustin von zunächst 60 mg/m² und dann 75 mg/m². Ergebnisse: 21 Patienten (jeweils 3 in den ersten drei Dosierungsstufen und jeweils 6 in den beiden letzten Dosierungsstufen) wurden in dieser Phase-I-Studie eingeschlossen. Alle Patienten erhielten mindestens 2 Zyklen der Therapie. Zwei Patienten entwickelten eine dosislimitierende Hämatotoxizität, ein Patient bei 25 mg/d Lenalidomid in Kombination mit 60 mg/m² Bendamustin und ein Patient in der höchsten Dosierungsstufe (25 mg/d Lenalidomid in Kombination mit 75 mg/m² Bendamustin). Die maximal tolerable Dosis wurde nicht erreicht. 16 Patienten (76%) sprachen nach mindestens zwei Zyklen RBP mit 1 sCR, 1 nCR, 5 VGPR und 9 RP an. Nach einer medianen Beobachtungszeit von 16 Monaten lag das PFS nach 18 Monaten bei 48% und OS bei 64%. Schlussfolgerung: RBP mit einer Dosis von 25 mg Lenalidomid (d 1-21) und 75 mg/m² Bendamustin (d 1-2) ist gut verträglich bei Patienten mit rezidiviertem/refraktärem MM.:Zusammenfassung II Abstract III Inhaltsverzeichnis IV Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis VII Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 1.1 Multiples Myelom 1 1.1.1 Terminologie 1 1.1.2 Epidemiologie 1 1.1.3 Ätiologie 2 1.1.4 Pathogenese 2 1.1.5 Klinik 3 1.1.5.1 Symptome des Skelettsystems 3 1.1.5.2 Anämiesymptome 3 1.1.5.3 Nierenbeteiligung 4 1.1.5.4 Infektionen 4 1.1.6 Diagnostik 5 1.1.6.1 Labordiagnostik 5 1.1.6.1.1 Myelomproteindiagnostik 5 1.1.6.1.2 Blutbild 6 1.1.6.1.3 Nierenwerte 6 1.1.6.1.4 ß2-Mikroglobulin 6 1.1.6.1.5 Knochenmarkdiagnostik 7 1.1.6.1.6 Knochenmarkmorphologie 7 1.1.6.1.7 Durchflusszytometrie 7 1.1.6.1.8 Zytogenetik 7 1.1.6.2 Radiologische Diagnostik 8 1.1.7 Diagnosekriterien, Differentialdiagnose, Klassifikation und Stadieneinteilung 9 1.2 Therapie 12 1.2.1 Konventionelle Chemotherapie 12 1.2.2 Neue Substanzen 13 1.2.2.1 Immunmodulatorische Substanzen 13 1.2.2.1.1 Thalidomid 13 1.2.2.1.2 Lenalidomid 14 1.2.2.1.3 Pomalidomid 14 1.2.2.2 Proteasom-Inhibitoren 15 1.2.2.2.1 Bortezomib 15 1.2.2.2.2 Carfilzomib 15 1.2.2.2.3 Ixazomib 16 1.2.2.3 HDAC-Inhibitoren 16 1.2.2.4 Monoklonale Antikörper 16 1.2.2.4.1 Daratumomab 17 1.2.2.4.2 Elotuzumab 17 1.2.3 Transplantationen 17 1.2.3.1 Autologe Stammzelltransplantation 17 1.2.3.2 Allogene Stammzelltransplantation 18 1.3 Zielstellung der Arbeit 19 2 Material und Methoden 21 2.1 Patienten 21 2.1.1 Einschlusskriterien 21 2.1.2 Ausschlusskriterien 23 2.2 Studiendesign 24 2.3 Behandlungsprotokoll 25 2.4 Definition des Therapieansprechens 26 2.5 Bestimmung der Therapieeffektivität und Toxizität 26 2.6 Statistische Methoden 27 3 Ergebnisse 28 3.1 Patientencharakteristika 28 3.2 Dosiseskalation 30 3.3 Remission und Überleben 31 3.4 Toxizität 34 4 Diskussion 36 Literaturverzeichnis 40 Erklärung über den Anteil an der Promotionsarbeit 51 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 52 Danksagung 53

Multiple myeloma is an incurable fatal neoplasm of plasma cells affecting mainly elderly people. There are many research laboratories in the world where multiple myeloma is studied. Permanent cell lines are indispensable tools for both basic and applied research. However, the establishment of new cell lines is difficult with poor success. We established 96 primary cultures of bone marrow samples from myeloma patients. Only one culture succeeded in permanet myeloma cell line. The novel plasmacytic cell line ÚHKT-893 was established from bone marrow sample of 57 years old female relapsed with multiple myeloma of IgGκ isotype. The cell line is however dependent on the continuous presence of interleukin-6 in culture media. ÚHKT-893 cells grow continuously already more than 1 year. The growth of cells was regularly monitored according to growth curves and by measurement of cell viability. Surface antigenic profile was repeatedly determined by flow cytometry. The simultaneous expression of both CD138 and CD38 surface molecules confirmed the plasma cell origin of cells. The establishment of the ÚHKT-893 myeloma cell line will extend the panel of existing myeloma cell lines as a new ex vivo model for the study of the etiology and pathogenesis of multiple myeloma. It will also provide the source of new...

Das multiple Myelom ist eine seltene maligne Knochenerkrankung bei insbesondere älteren Menschen. Dabei vermehren sich im Knochenmark in hohem Maße unkontrolliert entartete Plasmazellen. Diese Myelomzellen unterdrücken einerseits die Bildung von normalen Plasmazellen, andererseits wird das Gleichgewicht zwischen Knochenaufbau und –abbau empfindlich gestört, woraus eine erhöhte Knochenresorption resultiert. Neben den bisher angewandten Chemo- und Strahlentherapien gewinnen innovative Medikamente, wie Proteasominhibitoren und Bisphosphonate, in der Therapie an Bedeutung. Diese Medikamente reduzieren das Myelomzellwachstum und wirken hemmend auf den Knochenabbau. Durch das Auffüllen von durch Resorptionsprozesse geschädigten Knochendefekten mit wirkstoffbeladenen Calciumphosphatzementen (CPC) wird nicht nur der Knochen stabilisiert, sondern im Vergleich zur herkömmlichen oralen oder intravenösen Medikamentenverabreichung eine gezielte Freisetzung des Wirkstoffes direkt am Wirkort in wesentlich reduzierten Dosen ermöglicht. Durch die Kombination des Knochenzementes mit anderen effizienten Drug-Delivery-Systemen (DDS), wie z. B. Polymeren, kann eine optimale Anpassung der Wirkstofffreisetzung ermöglicht werden. Insbesondere haben sich bereits dendritische Polymere aufgrund ihrer globularen Struktur und Vielzahl an peripheren Funktionalitäten als besonders geeignete Wirkstoffträgersysteme herausgestellt. Bei der Anwendung im physiologischen System spielt insbesondere die Biokompatibilität dieser polymeren DDS eine entscheidende Rolle. Durch Modifizierung der peripheren Gruppen mit biokompatiblen Einheiten, wie Oligosacchariden oder Aminosäuren, kann die physiologische Verträglichkeit signifikant erhöht werden. Für die Behandlung des multiplen Myeloms am Knochen sollte in dieser Arbeit ein geeignetes dendritisches DDS auf Basis von hochverzweigtem Polyethylenimin (PEI) synthetisiert und charakterisiert werden. Das DDS sollte dabei verschiedene Anforderungen, wie eine hohe Wasserlöslichkeit und Biokompatibilität, erfüllen. Weiterhin sollten die mechanischen Eigenschaften des CPC nicht negativ beeinflusst werden und der Wirkstoff sollte effektiv vom DDS aufgenommen und kontrolliert aus dem generierten Komposit (Wirkstoff/DDS/CPC) freigesetzt werden. In der sogenannten N-Carboxyanhydrid (NCA)-Polymerisation wurden am PEI(5) (5 ≙ Mw 5 kDa) benzylgeschützte Polyglutaminsäure bzw. Polyasparaginsäureketten aufgepfropft. Durch hydrolytische Abspaltung der Schutzgruppen an den PBLG-Ketten von PEI(5)-PBLG-346 und PEI(5)-PBLA-346 erfolgte die Generierung der wasserlöslichen DDS PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PAsp-346. Die Charakterisierung der synthetisierten Kern-Schale-Architekturen PEI(5)-PBLG-346, PEI(5)-PBLA-346, PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PAsp-346 zeigte, dass nur wenige lange Polyaminosäureketten an wenigen primären und sekundären Aminogruppen des PEI(5) aufgebaut wurden. Aufgrund der noch freien primären und sekundären Aminogruppen am PEI(5) und den peripheren Aminogruppen an den Polyaminosäureketten wurden durch die Anbindung von Maltose- bzw. Laktoseeinheiten Kern-Schale-Architekturen mit einer binären Doppelschalenstrukturen erzeugt. Im Gegensatz zu reiner Polyglutaminsäure zeigten die mit Glutaminsäure modifizierten Polymerstrukturen PEI(5)-PGlu-346 und PEI(5)-PGlu-346-Mal interessante strukturelle Eigenschaften in wässriger Umgebung. Aufgrund des pH-abhängigen Ladungszustandes resultiert bei reinen Polyglutaminsäureketten normalerweise der typische Helix-Coil-Übergang. Dabei findet eine Konformationsumwandlung der α-helikalen Struktur zur ungeordneten Sekundärstruktur statt. Im Falle der PEI(5)-PGlu-346- und PEI(5) PGlu-346-Mal-Copolymere wurde jedoch keine α-helikale Konformation bei niedrigem pH-Wert nachgewiesen. Die PGlu-Ketten der wasserlöslichen Kern-Schale-Architekturen bildeten sowohl im sauren, als auch im basischen pH-Wertbereich eine ungeordnete Sekundärstruktur aus. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Kern-Schale-Architekturen in Abhängigkeit vom pH-Wert als isolierte Makromoleküle bzw. Aggregate mit unterschiedlich lang gestreckten Peptidketten vorliegen. Die Ursache dafür sind nicht-kovalente, intra- und intermolekular wirkende Kräfte. Zur Beurteilung der Kern-Schale-Architekturen als geeignete DDS wurde die Komplexierung des Proteasominhibitors Bortezomib (BZM) in die reinen Copolymere PEI(5)-PGlu-346, PEI(5)-PGlu-346-Mal und PEI(25)-Mal B (25 ≙ Mw 25 kDa, ohne Polyglutaminsäureketten) sowie deren Polyelektrolytkomplexe untersucht. Dabei wurden Copolymer/BZM- bzw. PEK/BZM-Komplexe in verschiedenen Verhältnissen hergestellt und die Komplexierungskapazität durch zeitabhängige Ultrafiltration UV/Vis-spektroskopisch ermittelt. Im Vergleich zu den glutaminsäuremodifizierten Copolymeren wurde durch PEI(25)-Mal B etwa doppelt so viel Wirkstoff in verschiedenen wässrigen Systemen aufgenommen. Der Grund dafür ist der größere PEI-Kern und die dementsprechend höhere Anzahl an peripheren Aminogruppen mit gebundenen Maltoseeinheiten. Die PEK zeigten im Vergleich zu den Copolymeren keine Verbesserung der Komplexierungskapazität. Um eine effektive Wirkstofffreisetzung für eine dosierte Langzeittherapie aus dem Kompositmaterial zu erhalten, ist eine stark verzögerte Freisetzung des Copolymers bzw. PEK selbst aus dem CPC notwendig. In Abhängigkeit von der Konzentration wurde für PEI(25)-Mal B eine geringere Freisetzung aus dem Copolymer/CPC- und PEK/CPC ermittelt. Aufgrund der nanoskaligen Dimension der polymeren Strukturen wird die Diffusion durch das offene CPC-Porensystem erschwert. Für die PEI(5)-PGlu-346, PEI(5)-PGlu-346-Mal und die zugehörigen PEK wurde hingegen keine messbare Freisetzung aus dem CPC nachgewiesen. Die Glutaminsäureeinheiten können Calciumionen komplexieren und beeinflussen dadurch die Keimbildung und das Wachstum der CaP-Phase. Die Copolymerstrukturen werden somit in den CPC integriert und können nur durch Abbau des schwerlöslichen Zementes freigesetzt werden. Bei den Untersuchungen der BZM-Freisetzung aus den BZM/Copolymer/CPC- und BZM/PEK/CPC-Kompositen kristallisierte sich BZM/PEI(5)-PGlu-346-Mal/CPC als effektivstes DDS heraus. Im Vergleich zum reinen BZM in CPC wurde nach 24 h nur etwa die Hälfte des Wirkstoffes aus dem Komposit freigesetzt. Weiterhin steigerte sich die Freisetzungsrate über den gesamten Zeitraum von 14 Tagen auf nur etwa 60 %. Aus dem BZM/CPC-Komposit wurden nach 14 Tagen mehr als 75 % BZM freigesetzt. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Michael Gelinsky vom Zentrum für Translationale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung (TU Dresden) wurde keine signifikante Änderung der Druckfestigkeit des CPC durch die Integration der glutaminsäuremodifizierten Copolymere festgestellt. Weiterhin wurde in in vitro-Untersuchungen mit osteogen stimulierten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) kein entscheidender Einfluss der in dieser Arbeit hergestellten PEI(5)-PGlu-346- und PEI(5)-PGlu-346-Mal-Copolymere auf die Proliferation der Zellen beobachtet. Zudem war bei beiden Copolymeren eine osteogene Differenzierung der hMSC zu knochenbildenden Osteoblasten nachweisbar, wobei PEI(5)-PGlu-346-Mal die Entwicklung der Stammzellen zu knochenbildenden Zellen sogar zu fördern scheint. Durch die Kombination von hochverzweigtem PEI mit Polyglutaminsäure und Maltose wurde in dieser Arbeit ein innovatives DDS für die kontrollierte und effektiv verzögerte Freisetzung von BZM aus CPC erzeugt, welches die einleitend erwähnten Anforderungen erfüllt. Das Copolymersystem weist eine hohe Biokompatibilität auf, ohne die mechanischen Eigenschaften des CPC zu verändern. Diese Arbeit hat daher einen entscheidenden Beitrag im Bereich der Wirkstofffreisetzung aus festen Materialien geliefert und bildet die Grundlage für zukünftige polymere DDS in CPC.

Das Knochenmarkmikromilieu produziert eine Reihe von unterschiedlichen Wachstumsfaktoren, die für das maligne Wachstum und die Medikamentenresistenz von Myelomzellen von grosser Bedeutung sind. Einer der wichtigsten Faktoren, der in manchen experimentellen Systemen sogar als essentiell für das Wachstum und Überleben von Myelomzellen beschrieben wurde, ist Interleukin-6. Aus diesem Grund könnte die Entwicklung von Substanzen, die die Wirkung von IL-6 oder dem IL-6 Rezeptor inhibieren von Bedeutung für die Therapie des Myeloms sein. In dieser Arbeit wurde die Wirkung des IL-6 Rezeptorantagonisten SANT7 auf das Überleben der IL-6 abhängigen Myelomzellinie INA-6 sowie primären Myelomzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von primären humanen Knochenmarkstromazellen (KMSZ) untersucht. Von besonderem Interesse war hierbei die Frage ob SANT7 die wachstumsinhibitorische Wirkung von Dexamethson (Dex) und All-Trans-Retinolsäure (ATRA) verstärken kann. Keine der drei Substanzen, SANT7 eingeschlossen, konnte bei alleiniger Applikation in Gegenwart von primären humanen KMSZ eine nennenswerte Wachstumsinhibition induzieren. Wenn jedoch Dex und ATRA mit SANT7 kombiniert wurden konnte sowohl in INA-6 als auch primären Myelomzellen eine starke Wachstumsinhibition erzielt werden. Dieser Effekt beruht sowohl auf Apoptose als auch eines Zellzyklusarrests. / The bone marrow microenvironment produces a number of different survival factors that are important for the malignant growth and drug resistance of multiple myeloma (MM) cells. One of the main factors reported to be essential for survival and growth of MM cells in some experimental systems is interleukin-6 (IL-6). Therefore, the development and testing of substances that interfere with IL-6 or IL-6 receptor (IL-6R) function might have a potential therapeutic value for the treatment of multiple myeloma. In this work the effect of the IL-6 receptor antagonist SANT7 on growth and survival of the IL-6 dependent MM cell lines INA-6 as well as primary MM cells in the presence or absence of bone marrow stromal cells (BMSC) was analyzed. Of particular interest was the question whether SANT7 might enhance the growth inhibitory effects of dexamethasone (Dex) and all-trans retinoic acid (ATRA). None of the drugs, when tested as a single substance, including SANT7, induced major growth inhibition if MM cells were co-cultured with primary human BMSCs. However, if Dex and ATRA were given in combination with SANT7 a strong growth inhibition was achieved in INA-6 and primary MM cells. This effect is due to cell cycle arrest and induction of apoptosis.

Das Multiple Myelom (MM) ist eine hämatologische Erkrankung, welche sich durch eine Akkumulation von malignen Plasmazellen im Knochenmark auszeichnet und eine gestörte Hämatopoiese und Osteolyse zur Folge hat. Komplexe molekulare Interaktionen zwischen MM-Zellen und der Mikroumgebung/Nische im Knochenmark (bone marrow microenvironment, BMM) führen zu einer Aktivierung von verschiedenen Wachstums-, Überlebens- und anti-apoptotischen Signalwegen, die zur Entstehung bzw. Wirkstoffresistenz von MM-Zellen beitragen. IL-6R/STAT3, Ras/MAPK und PI3K/Akt sind die drei wichtigsten Signalwege, die mit dem Wachstum und der Entwicklung des MM assoziiert sind. Auf der anderen Seite sind Myelomzellen insensitiv gegenüber einer Blockade des IL6R/STAT3-Signalweges bzw. des Ras/MAPK-Signalwegs in der Gegenwart von Knochenmarksstromazellen (bone marrow stroma cells, BMSCs), was die Entbehrlichkeit dieser beiden Signalwege unter Ko-Kultur-Bedingungen nahelegt. Interessanterweise aber induziert die gleichzeitige Unterbrechung der IL6R/STAT3 und Ras/MAPK Signalwege Apoptose in MM-Zellen. Ziel der Arbeit war die Identifizierung und Analyse von Zielgenen, die von beiden Signalwegen und nicht durch einen Signalweg alleine reguliert werden. Genexpressionsanalysen zeigten eine deutliche Herunterregulierung der Proteine Hsp90alpha und Hsp90beta nach einer gleichzeitigen Inhibition der IL6R/STAT3 und Ras/MAPK Signalwege. In Hinblick auf die zentrale Rolle von Hsp90 in der Tumorbiologie fokussiert sich die vorliegende Arbeit auf die Erforschung der Rolle von Hsp90 im Multiplen Myelom. Die siRNA-vermittelte Herunterregulation der Proteinexpression von Hsp90-Proteinen zeigte, daß das Ausschalten von HsP90alpha alleine nur zu einer moderaten Apoptoseinduktion in INA-6- und MM.1s-Zellen führte. Die gleichzeitige Herunterregulation von HsP90beta hingegen führte zu einer Verstärkung dieses Effektes und deutet darauf hin, daß beide Proteine miteinander kooperieren. Die pharmakologische Inhibition der Hsp90-Funktion mittels eines neuen Hsp90-Inhibitors (17-DMAG) führte zu einer Verringerung von phospho-ERK1/2, zur Degradation von STAT3 und zu einem verminderten Überleben von MM-Zellen. Die pro-apoptotischen Effekte der gestörten Hsp90-Funktion konnten weder durch BMSCs und Osteoklasten noch durch ECs (??) abgeschwächt werden, obwohl für ECs beschrieben wurde, daß sie zum Wachstum und Überleben von MM-Zellen beitragen können. Diese Beobachtungen deuten auf einen positiven Rückkopplungskreislauf zwischen HsP90alpha/beta und den wichtigsten Signalwegen hin, welcher das Überleben von MM-Zellen gewährleistet. Desweiteren zeigten immunhistologische Analysen, daß Hsp90-Proteine im Vergleich zu MGUS (??) bzw. normalen Plasmazellen in MM-Plasmazellen hochreguliert sind. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die essentielle Rolle von Hsp90-Proteinen für die Überlebensfähigkeit von MM-Zellen. Ein neuer Mechanismus der Hsp90-Regulation durch das Zusammenwirken der Signalwege IL6R/STAT3 und Ras/MAPK in MM-Zellen konnte gezeigt werden. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, daß ein positiver Rückkopplungskreislauf zwischen Hsp90-Proteinen und den wichtigsten Signalwegen existiert, welcher zum Wachstum und zur Entwicklung von MM-Zellen beiträgt. Die Inhibition der Hsp90-Funktion durch den pharmakologischen Inhibitor 17-DMAG führte zum Absterben von MM-Zellen und der pro-apoptotische Effekt der Hsp90-Depletion konnte nicht durch unterstützende BMM-Zellen aufgehoben werden. Diese Beobachtungen untermauern die multifunktionelle Rolle von Hsp90 in der MM-Biologie und zeigen die Wichtigkeit der Entwicklung neuer therapeutischer Wirkstoffe zur Inhibition der Hsp90-Funktion bei der Behandlung des MM. / Multiple myeloma (MM) is a haematological malignancy characterised by the accumulation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to impaired haematopoiesis and osteolytic bone destruction. Intricate molecular interactions between MM cells and the BMM activate a diverse set of growth, survival and anti-apoptotic signaling cascades that mediate tumor progression and drug resistance. IL-6R/STAT3, Ras/MAPK and PI3K/Akt are the three major signal transduction pathways that are associated with MM growth and progression. However, myeloma cells have shown independence from IL-6R/STAT3 blockade or insensitivity towards Ras/MAPK pathway inhibition in the presence of BMSCs, indicating the dispensability of both in co-culture conditions. Interestingly, concomitant disruption of both IL-6R/STAT3 and Ras/MAPK pathways was successful to drive MM cells into significant apoptosis. This study aimed to identify and analyse the downstream target genes that are regulated by both pathways and not by either pathway alone. Gene expression profiling revealed prominent downregulation of Hsp90alpha and Hsp90beta proteins after combined inhibition of the IL-6R/STAT3 and Ras/MAPK pathways. Owing to the important role played by Hsp90 in cancer biology, this study was narrowed down to investigate the role of Hsp90 in MM. Specific siRNA-mediated knockdown of Hsp90 proteins showed that although knockdown of Hsp90beta was sufficient to induce moderate apoptosis in INA-6 and MM.1s cells, the effect was more pronounced when both Hsp90 proteins were targeted, indicating co-operation between them. Pharmacological inhibition of Hsp90 function by using a novel Hsp90 inhibitor (17-DMAG) down-regulated the levels of pERK1/2 and led to degradation of STAT3 and decreased viability of MM cells. The pro-apoptotic effects of compromised Hsp90 function could not be alleviated by either BMSCs, OCs or ECs, which are well-known to support myeloma growth and survival. These observations point to the existence of a positive feedback loop consisting of Hsp90alpha/beta and major signaling pathways supporting MM cell survival. Furthermore, immunohistochemical analysis unveiled the up-regulated status of Hsp90 proteins in MM PCs as compared to MGUS or normal PCs. Taken together, the results of this study explain the critical contribution of Hsp90 proteins to MM cell survival. A novel mechanism of Hsp90 regulation by co-operation between the IL-6R/STAT3 and Ras/MAPK pathways was discovered in myeloma cells. There is also strong evidence of the existence of a positive feedback loop between Hsp90alpha/beta proteins and major signaling pathways supporting MM growth and progression. Inhibition of Hsp90 function by using the Hsp90 inhibitory drug 17-DMAG proved to be lethal for myeloma cells and the pro-apoptotic effects of Hsp90 blockade could not be reversed by the presence of cells from the supportive BMM. These observations highlight a multi-functional role of Hsp90 in MM biology and strongly strengthen the notion that therapeutic strategies targeting Hsp90 may open new perspectives for anti-myeloma drug development.

Die Hochdosischemotherapie stellt für Patienten unter 60 Jahren die Standardtherapie des multiplen Myeloms dar. Nach 600 Hochdosischemotherapiezyklen mit autologer peripherer Stammzelltransplantation zeigten sich erstmals Grundkrankheit, Alter und Zahl der transplantierten Stammzellen als unabhängige Einflußfaktoren für die Rate der dokumentierten Infektionen. Die Dauer der schweren Mukositis beeinflußte sowohl die Rate der Infektionen, als auch die therapieassoziierte Mortalität signifikant. Die Angiogenese im Knochenmark stellte bei Patienten mit multiplem Myelom einen unabhängigen Prognosefaktor für das Überleben dar. Myelom-Patienten wiesen im Vergleich zu gesunden Probanden eine signifikant erhöhte bFGF(basic fibroblast growth factor)-Konzentration im Serum auf. Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg der bFGF Konzentration parallel zur Progression der Erkrankung vom Stadium I bis zum Stadium III. Eine effektive Chemotherapie ging mit signifikanten Reduktionen der Serum-Konzentrationen von drei angiogen wirksamen Zytokinen VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF und HGF (hepatocyte growth factor) sowie der Angiogenese im Knochenmark einher. Die Induktion der Knochenresorption stellt eines der wichtigsten weiteren Charakteristika von malignen Plasmazellen dar. In einer vergleichenden Untersuchung zeigte sich, daß unter den Knochenstoffwechselparametern ICTP (carboxyterminales quervernetztes Typ I Kollagen Telopeptid), NTx (aminoterminales Kollagen Typ I Telopeptid) und DPD (Desoxypyridinolin) das erstgenannte sich am besten zur Kontrolle der Progression eignet und dieser Parameter auch einen signifikanten Prognosefaktor für die Überlebenszeit darstellt. Die Hinweise, daß eine frühzeitige Bisphosphonattherapie die Progression des multiplen Myeloms hemmen könnte, hat uns veranlaßt, die erste prospektiv randomisierte Studie einer Bisphosphonattherapie beim multiplen Myelom im Stadium I in Zusammenarbeit mit der Deutschen Studiengruppe Multiples Myelom zu initiieren. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit auf die prognostische Relevanz zytogenetischer und molekulargenetischer Befunde beim multiplen Myelom sowie auf die Möglichkeit immunphänotypischer Untersuchungen zur Differenzierung zwischen multiplem Myelom und monoklonaler Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS) eingegangen. / High-dose chemotherapy is the standard treatment for patients with multiple myeloma younger than 60 years. In 600 cycles of high-dose chemotherapy with autologous blood stem cell transplantation, we found that the type of the malignant disease, age and number of transplanted stem cells were independent prognostic factors for the rate of documented infections. The duration of severe mucositis was significantly associated both with the rate of infections and treatment-related mortality. The angiogenesis in bone marrow was found to be an independent prognostic factor for survival in patients with multiple myeloma. Myeloma patients had significantly elevated serum bFGF (basic fibroblast growth factor) levels in comparison to healthy controls. Serum bFGF levels increased parallel to the progression of multiple myeloma from stage I to stage III. Effective chemotherapy was associated with significant reductions in serum levels of three angiogenic cytokines VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF and HGF (hepatocyte growth factor) and the bone marrow angiogenesis. The induction of bone resorption is one of the most important characteristics of malignant plasma cells. In a comparative analysis of bone resorption parameters ICTP (carboxy-terminal telopeptide of type-I collagen), NTx (amino-terminal collagen type-I telopeptide) and DPD (deoxypyridinoline) we found that ICTP was the most suitable marker for the detection of progression in multiple myeloma and that ICTP was a significant prognostic factor for survival in this disease. The findings that an early start of a treatment with bisphosphonates might delay the progression of multiple myeloma has lead us to start the first prospective randomized trial of bisphosphonate treatment in stage I in collaboration with the German Study Group Multiple Myeloma. Furthermore the prognostic relevance of cytogenetic and moleculargenetic findings in multiple myeloma and the use of immunophenotypic analysis for the differentiation of multiple myeloma and monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) was discussed in this work.

Multiple myeloma and its aggressive variant, plasma cell leukemia, are still considered to be incurable diseases despite the progressive treatment approaches comprising novel drugs. This can be attributed to the presence of the bone marrow microenvironment which plays an important role in drug resistance of myeloma cells. Hematopoietic cell lines derived from hematologic malignancies are suitable models for the study of etiopathogenesis of these malignant diseases and for testing new potential drugs. Establishment of these cell lines is still considered to be coincidental and rare event. The first part of the thesis is focused on establishment and characterization of the cell line UHKT-944 derived from a patient with primary plasma cell leukemia, and on completion of characterization of the cell line UHKT-893 derived from a patient with multiple myeloma. Additional analysis of UHKT-893 cell line were performed including sequence analysis of IgVH gene rearrangements and cytogenetic analysis which contributed to more detailed characterization of this cell line. During cultivation of UHKT-944 cells, we monitored the cell growth and confirmed dependence on interleukin-6 (IL-6). Immunophenotype analysis revealed the presence of surface markers characteristic of malignant plasma cells. UHKT-944 cells...