Titre de l'écran-titre (visionné le 5 juin 2023) / Les maladies neuromusculaires héréditaires n'ont généralement pas de traitement efficace à ce jour. Deux d'entre elles sont étudiées par le laboratoire, soit l'ataxie de Friedreich (FRDA) et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Il existe plusieurs modèles de souris pour la FRDA, mais aucun ne reflétait la dégénération progressive de la maladie au niveau locomoteur et cardiaque. Le but de mes travaux était donc de trouver et caractériser un modèle murin qui rendrait possible l'étude des effets d'un traitement de thérapie génique sur ces symptômes. Deux modèles de souris ont été comparés : 1) le YG8sR auquel un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) ciblant l'ARNm de la frataxine est injecté en IV pour tenter de réduire l'expression de cette protéine pour augmenter la sévérité des symptômes de la maladie et 2) le YG8-800 qui est un nouveau modèle prometteur possédant 800 répétitions de GAA. Le YG8-800 présente un phénotype qui modélise mieux l'évolution de la maladie chez l'humain avec une détérioration graduelle de la coordination corrélée à une diminution de la frataxine plus marquée. En effet, les souris YG8-800 font plus de fautes et nécessitent plus de temps pour traverser une poutre et T inversé ou dentée et restent suspendues moins longtemps sur une grille. Elles présentent aussi significativement moins de frataxine dans tous les organes étudiés que les souris YG8sR. Pour la DMD, le traitement étudié est la greffe de myoblastes qui consiste à injecter une suspension de myoblastes sains dans un muscle n'exprimant pas la dystrophine. Cette méthode vise à briser les fibres musculaires existantes pour y faire fusionner les cellules injectées et de ce fait apporter le matériel génétique pour synthétiser la dystrophine dans la fibre musculaire malade. En moyenne, le taux de survie à la procédure des cellules greffées est de 5% dans la littérature. L'expérience vise donc à optimiser les conditions de greffe pour augmenter la survie des myoblastes après la greffe. Le Célastrol est un composé reconnu pour son effet anti-inflammatoire et protecteur, il a donc été testé pour protéger les cellules. La première greffe indiquait une amélioration significative de la survie des cellules, mais la deuxième n'a pas reproduit cette tendance. D'autres expériences seront nécessaires pour déterminer si le Célastrol peut améliorer la survie des cellules greffées. / Hereditary neuromuscular diseases generally have no effective treatment to date. Two of them are being studied by my laboratory: Friedreich's ataxia (FRDA) and Duchenne muscular dystrophy (DMD). There are several mouse models for FRDA, but none reflected the progressive degeneration of the disease at the musculoskeletal and cardiac level. My goal was thus to find and characterize a model that will make it possible to study the effects of gene therapy treatments on these symptoms. I have compared two mouse models: 1) the YG8sR to which a short hairpin RNA (shRNA) targeting frataxin mRNA was i.v. injected to reduce the expression of frataxin to increase the severity of the symptoms and 2) the YG8-800, a promising new model with 800 GAA repeats. The YG8-800 has a phenotype that better reproduces the disease progression in humans with a gradual deterioration in coordination correlated due to a more pronounced frataxin reduction. In fact YG8-800 mice make more foot faults and need more time to cross the inverted T beam or notched beam. They also hang for a shorter time on the grid and contain significantly less frataxin in all studied organs than YG8sR mice. For DMD, the treatment studied was myoblast transplantation, which consisted of injecting a suspension of healthy myoblasts into a muscle that does not express dystrophin, the absent protein in DMD patients. This method aims to damage the existing muscle fibers to permit the fusion of the injected cells and thus provide the gene to express dystrophin in the diseased muscle fibers. On average, the procedure survival rate of transplanted cells is 5% in the literature. My experiment therefore aimed to improve the transplant conditions to increase myoblast survival. I have evaluated the protective effects of Celastrol is a compound known for its anti-inflammatory. The first transplant indicated a significant improvement of cell survival, but a second did not confirm this effect. Further experiments will be needed to determine if Celastrol can improve the survival of transplanted cells.

Cette thèse, consacrée aux myopathies inflammatoires, démontre le rôle dans les maladies auto-immunes des Toll-like récepteurs (TLRs), véritable passerelle entre immunité innée et adaptative, et plus spécifiquement dans le muscle, le rôle fondamental de la cellule musculaire elle-même. Après une présentation globale des myopathies inflammatoires et des différents aspects immunopathologiques, la réponse immunitaire adaptative est abordée en rapportant notamment dans le muscle des myopathies inflammatoires une accumulation de cellules dendritiques matures, et la présence des lymphocytes Th1 et Th17, avec un profil prépondérant Th1. L’implication de l’immunité innée est démontrée in vivo par l’expression musculaire des TLR3 et 7, et des C-type lectin récepteurs, spécifique des myopathies inflammatoires. In vitro, l’activation de la voie TLR3 induit la production par les cellules musculaires d’IL6, de la βchémokine CCL20, contribuant au recrutement et à la différentiation des cellules dendritiques et lymphocytes T, et de l’IFNβ qui participe à la surexpression des antigènes HLA de classe I. Les mécanismes de régulation impliquent une balance cytokinique Th1 et Th17. Finalement, l’importance des précurseurs musculaires immatures est soulignée. Contrairement au tissu musculaire normal, une surexpression des antigènes HLA de classe I, des TLRs, des auto-antigènes et de l’IFNβ, par les précurseurs musculaires immatures, est caractéristique des myopathies inflammatoires. Le rôle central de ces cellules musculaires immatures à potentiel de régénération pourrait expliquer un défaut de réparation associé au processus auto-immun de destruction musculaire. / This thesis, devoted to the inflammatory myopathies, is demonstrating the potential role in autoimmune disorders of Toll-like receptors (TLRs), gateway between innate and adaptive immune system, and more specifically in muscular diseases the fundamental role of muscle cell it-self. After the presentation of the general clinical features and the immunopathology of inflammatory myopathies, the adaptive immune response is the subject of the second part,demonstrating the abnormal accumulation of mature dendritic cells in myositis muscle, and the presence of Th1 and Th17 cells with a predominant Th1 profile. Innate immune system is next investigated, demonstrating the overexpression of TLR3 and 7 and of C-type lectin receptors characteristic of inflammatory myopathies. In vitro, stimulation of the TLR3 pathway in human myoblasts induces the production of IL6 and of the βchemokine CCL20, which in turn participate to the differentiation and the migration of T cells and dendritic cells, and of IFNβ which contributes to HLA class I up-regulation. The expression of TLR3 is differentially regulated by Th1 and Th17 cytokines. Finally, this work strongly implicates immature myoblast precursors in the pathogenesis of inflammatory myopathies. In contrast to normal muscle tissue, myositis tissue is characterized by the overexpression of HLA class I antigens, TLR3 and TLR7, myositis autoantigens, and IFNβ, all observed in immature myoblast precursors. By focusing damage onto those cells accomplishing repair, a feedforward loop of tissue damage is induced and could explain the defective repair in muscle in addition to the autoimmune attack.

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La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui se caractérise principalement par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques dont la cause est l’absence de dystrophine fonctionnelle dans les muscles. A ce jour, il n’existe toujours pas de traitement efficace contre ces maladies. Comme le plus grand gène connu chez l’Homme, la dystrophine code pour une protéine de 427kDa. La protéine connecte l’actine avec le DAPC (Dystrophin Associated Protein Complex) dans les muscles striés. Pour l’instant, il y a 3 hypothèses concernant le mécanisme du DMD. L’absence de la dystrophine peut supprimer le lien physique entre les protéines structurales de la membrane basale (laminines) et les protéines structurales du cytosquelette (filaments intermédiaires et actine), ou la distribution et la fonction des canaux ioniques, ou des voies de signalisation nécessaires à la survie du muscle. Caenorhabditis elegans ne possède qu’un homologue du gène de la dystrophine humaine, le gène dys-1. La protéine DYS-1 présente 37% d’homologie avec la dystrophine humaine. Le double mutant dys-1(cx18) ; hlh-1(cc561) présente une forte dégénérescence musculaire. Comme le sarcomère de C. elegans ressemble au sarcomère de mammifère, C. elegans est modèle pertinent d’étude la maladie. En vue de comprendre la raison du DMD chez les mammifères et chez les vers, le groupe L. SEGALAT a effectué des cribles pour identifier les molécules et les gènes qui peuvent supprimer la dégénérescence musculaire. On a trouvé un gène pkc-2 qui est capable de supprimer la dégénérescence musculaire chez C. elegans. La protéine PKC-2 est l’orthologue de la Protein Kinase C Alpha (PKC) humaine et appartient à la famille du serine/threonine protéine kinase. Afin d’étudier la fonction du gène pkc-2, on a analysé l’expression du gène avec les construits différents in vivo et a utilisé la technique de double-hybride dans la levure. De plus, le crible par EMS (éthane méthyle sulfonâtes) a identifié une molécule sérotonine (5-HT) qui est un neuromédiateur, et supprime partiellement la dégénérescence musculaire des doubles mutants dys-1; hlh-1. La sérotonine a aussi un effet fort sur le mutant pkc-2(ok328), puisqu’elle provoque un phénotype blister. Ça nous permet de rechercher le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. Le crible génétique peut contribuer à la connaissance du rôle pkc-2. […]. Elle sert aussi de plate-forme de voie de signalisation intracellulaire. L’identification de Y59A8A.3 propose la possibilité que pkc-2 modifie la filamin A par l’intermédiaire de la filamin A interacting protéine 1. Le crible génétique par EMS pour rechercher des suppresseurs de l’effet blister de la sérotonine sur les mutants pkc-2(ok328) a donné 8 candidats sur 5000 F1s : cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276. Les mutations ont été localisées sur les chromosomes par SNP mapping avec une souche de C. elegans très polymorphe, mais le temps a manqué pour leur identification exacte. L’expérience valide notre approche à étudier le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. En résumé, le but de la thèse était de rechercher la fonction du gène pkc-2 dans les mécanismes moléculaires conduisant à la nécrose musculaire en absence de dystrophine. Les résultats présentés dans la thèse apportent des réponses aux questions fondamentales sur pkc-2 et aussi demandent des expériences supplémentaires afin de élucider plus avant les mécanismes de la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked progressive muscle disease which is caused by mutations in the dystrophin gene. Until now, there is no effective therapy for DMD. As the largest gene in human beings, it produces a 427-kDa cytoskeleton protein: Dystrophin. Dystrophin links actin and dystrophin associated protein complex (DAPC) in muscles. Currently, there are 3 hypotheses to explain the mechanisms of DMD. They suggest that the absence of dystrophin could lead to periodic muscle cell membrane ruptures, or affect the distribution and function of ion channels, or perturb signal transduction pathways. In Caenorhabditis elegans, there is only one homologue of mammalian dystrophin gene named dys-1, and the nematode protein DYS-1 presents 37% similar to the human one. The double mutant dys-1; hlh-1 exhibits a severe progressive muscle degeneration. The protein composition of the sarcomere has been studied and it has revealed a high degree of similarity with mammalian sarcomere. These allow C. elegans be a relevant animal model to study DMD.To understand why the lack of dystrophin induces muscle degeneration in mammals and worms, and to find new drugs that might help in reducing muscle degeneration, L. Ségalat and his coworkers performed several screens for drugs and genes suppressing muscle degeneration. An interesting gene pkc-2 came out and was considered as a possible regulator in the process of muscle degeneration in C. elegans. The protein that is encoded by this gene in C. elegans is an orthologous of the human gene Protein Kinase C Alpha (PKC), which belongs to the family of serine/threonine specific protein kinases. To study the function of pkc-2, we generated different recombinant constructs, analyzed the expression pattern of pkc-2 with immunocytochemistry, and performed yeast two-hybrid to search for PKC-2 binding partners. In addition, a neurotransmitter serotonin (5-HT) was found by drug screening to be an active blocker of striated muscle degeneration. As C. elegans lacking PKC-2 displays a severe blister phenotype in exogenous 5-HT, studying the correlation between PKC-2 and 5-HT therefore seems to be an opportunity to explore the reasons of muscle degeneration. A genetic screen with EMS (ethane methyl sulfonate) to search serotonin resistant mutant in strain pkc-2 (ok328) would help us study further about the role of pkc-2.In this thesis, different clones myo3::pkc-2 and pkc-2::gfp were made to inject into wild-type animals. The results revealed that pkc-2 expressed intensely in neurons and pharynx, but was not found in body-wall muscles. Mutants dys-1;hlh-1 fed with pkc-2 RNAi did not reduce muscle degeneration statistically comparing to triple mutant pkc-2;dys-1;hlh-1. This indicated that PKC-2 may be dominantly acting in neurons. A yeast two-hybrid screen identified the gene Y59A8A.3, which is a homologue to mammalian filamin A interacting protein 1 isoform 3, as a binding partner of PKC-2. Filamin A is a cytoskeleton protein, anchoring various trans-membrane proteins to the actin cytoskeleton and may also function as an important signaling scaffold. The result suggested that PKC-2 may therefore modulate filamin A activity through the filamin interacting protein 1. Genetic screen by EMS presented 8 candidates named cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276, which were mapped on chromosomes by SNP mapping using a polymorphic C. elegans strain, but time was too short to identify these genes formally. The experiment also offered possibilities of searching links between PKC-2 and serotonin pathways.In summary, this work studied the gene pkc-2 in order to reveal the function of PKC-2 and its involvement in muscle degeneration. The present results answered some questions about pkc-2, and needed further researches to elucidate the in vivo role of PKC-2 protein and its interaction with other proteins in the mechanism of muscle dystrophy in C. elegans.

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Des mutations dans les gènes codant pour des myotubularines (MTM) sont responsables de maladies neuromusculaires telles que la XLCNM (MTM1) ou la CMT4 (MTMR2 & MTMR13). Les MTMs sont des phosphatases à phosphosinositides (PPIn), des messagers lipidiques essentiels pour la régulation spatio-temporelle de fonctions cellulaires vitales.La présence de 14 paralogues de MTMs chez l'Homme complique l'analyse de la fonction cellulaire d'un seul membre de la famille. La levure Saccharomyces cerevisiae, dont l'organisation cellulaire est comparable à une cellule humaine, ne compte en revanche qu'un seul homologue de MTM (YMR1), pour lequel nous disposons de mutants de délétion viables.L'expression de MTM1 sauvage ou mutants de patients dans la levure montre seules les myotubularines enzymatiquement actives induisent une morphologie anormale du compartiment lysosomal et un défaut du trafic membranaires endocytique.Nos résultats suggèrent que l'activité phosphatase de MTM1 ne serait pas à elle seule responsable de la XLCNM mais que d'autres mécanismes, tels que les interactions protéiques, pourraient prendre part au développement de la maladie.

La myopathie myotubulaire (XLMTM, OMIM 310400) est causée par des mutations dans le gêne MTM1 situé sur le chromosome X et apparaît à une fréquence de 1/50 000 naissances mâles. Les patients présentent une hypotonie et une faiblesse musculaire généralisées et de graves problèmes respiratoires à la naissance. En absence de traitement, les patients sont nombreux à décéder durant la première année de vie. Mon travail de thèse consiste à développer un traitement de thérapie génique pour la myopathie myotubulaire. L'injection intraveineuse du vecteur thérapeutique rAAV9-DES-Mtm1 chez le modèle murin de la myopathie myotubulaire permet d'obtenir de la protéine transgénique dans l'ensemble des muscles squelettiques de l'organisme. Un an après le traitement, les muscles malades retrouvent une morphologie normale et les souris sont en vie. La seconde partie porte sur l'évaluation des effets de la protéine MTMR2, un homologue de la myotubularine (MTM1), sur le muscle déficient en myotubularine, comme alternative à la thérapie génique avec MTM1. L'administration d'un vecteur AAV comportant le transgène MTMR2 dans le muscle malade améliore, partiellement, le phénotype musculaire. Ces résultats suggèrent que l'augmentation du niveau d'expression de MTMR2 dans le muscle malade pourrait être un traitement efficace. Enfin j'ai étudié le rôle de l'activité phosphatase de la myotubularine dans son action thérapeutique. J'ai comparé l'effet d'une forme inactive de myotubularine (MTMIC375S) à celui du transgène thérapeutique sur le muscle atteint de myopathie myotubulaire. Les résultats montrent que l'activité phosphatase de la myotubularine est nécessaire pour son activité thérapeutique.

La myopathie némaline (MN) est une maladie neuromusculaire rare représentant la forme la plus répandue de myopathie congénitale. Elle est caractérisée par une faiblesse musculaire et la présence de structures en forme de bâtonnets au sein de la fibre musculaire squelettique. Au cours des dix dernières années, le développement de plusieurs modèles murins de MN a permis de mettre en évidence in vitro plusieurs mécanismes physiopatholgiques responsables, au moins en partie, de la faiblesse musculaire associée à la MN. Ce projet était donc dédié à la caractérisation phénotypique in vivo de la fonction musculaire squelettique de quatre modèles murins de MN reproduisant des formes humaines légères et sévères. A l’aide d’un dispositif expérimental précédemment développé au laboratoire, la fonction musculaire squelettique a été évaluée de manière strictement noninvasive à l’aide des techniques d’imagerie de résonance magnétique (IRM) multimodale (Dixon, T2, imagerie du tenseur de diffusion (DTI)) et de spectroscopie de résonance magnétique du phosphore 31 (SRM-P31) associées à des mesures mécaniques. Nous avons démontré que les altérations observées in vivo ne sont pas nécessairement similaires à celles rapportées in vitro. La SRM-P31 nous a permis de mettre en évidence des altérations métaboliques uniquement pour les formes sévères. Une absence d’infiltration intramusculaire de tissu adipeux a également été observée à l’aide de l’IRM Dixon. Enfin, les techniques d’IRM T2 et de DTI nous ont permis de déterminer des biomarqueurs noninvasifs et quantitatifs qui pourraient, à terme, permettre d’évaluer la sévérité et/ou la progression de la maladie chez les patients atteints de MN. / Nemaline myopathy (NM) is the most common of the non-dystrophic congenital myopathies and is characterized by muscle weakness and accumulation of an electron dense material (rods) within the sarcomeric units. Over the past decade, the generation of mouse models of NM allowed to identify in vitro several physiopathological mechanisms involved, at least in part, in muscle weakness in NM. This project has been devoted to the in vivo phenotypic characterization of the skeletal muscle function of mouse models mimicking mild and severe human forms of NM. Skeletal muscle function was assessed on four mouse models of NM with an original and strictly noninvasive experimental setup designed and built in our laboratory allowing 31P-magnetic resonance spectroscopy (31P-MRS) and multimodal magnetic resonance imaging (MRI) investigations, including Dixon, T2 mapping and Diffusion Tensor Imaging (DTI). Our results suggest that in vitro alterations did not necessarily translate into similar changes in vivo. 31P-MRS illustrated an altered energy metabolism only for the mouse models mimicking severe form of NM. Our Dixon MRI investigations showed that fatty infiltration was negligible. Finally, T2 maps and DTI experiments provided relevant noninvasive and quantitative biomarkers for monitoring the severity and/or the progression of NM in patients.

La myopathie myotubulaire (XLMTM, OMIM 310400) est causée par des mutations dans le gêne MTM1 situé sur le chromosome X et apparaît à une fréquence de 1/50 000 naissances mâles. Les patients présentent une hypotonie et une faiblesse musculaire généralisées et de graves problèmes respiratoires à la naissance. En absence de traitement, les patients sont nombreux à décéder durant la première année de vie. Mon travail de thèse consiste à développer un traitement de thérapie génique pour la myopathie myotubulaire. L'injection intraveineuse du vecteur thérapeutique rAAV9-DES-Mtm1 chez le modèle murin de la myopathie myotubulaire permet d'obtenir de la protéine transgénique dans l'ensemble des muscles squelettiques de l'organisme. Un an après le traitement, les muscles malades retrouvent une morphologie normale et les souris sont en vie. La seconde partie porte sur l'évaluation des effets de la protéine MTMR2, un homologue de la myotubularine (MTM1), sur le muscle déficient en myotubularine, comme alternative à la thérapie génique avec MTM1. L'administration d'un vecteur AAV comportant le transgène MTMR2 dans le muscle malade améliore, partiellement, le phénotype musculaire. Ces résultats suggèrent que l'augmentation du niveau d'expression de MTMR2 dans le muscle malade pourrait être un traitement efficace. Enfin j'ai étudié le rôle de l'activité phosphatase de la myotubularine dans son action thérapeutique. J'ai comparé l'effet d'une forme inactive de myotubularine (MTMIC375S) à celui du transgène thérapeutique sur le muscle atteint de myopathie myotubulaire. Les résultats montrent que l'activité phosphatase de la myotubularine est nécessaire pour son activité thérapeutique. / Myotubular myopathy (XLMTM, OMlM 310400) is caused by mutations in the MTM1 gene located on the X chromosome and appeared at a frequency of 1/50 000 male births. Most of the patients arc affected by hypotonia and generalized muscular weakness as weIl as grave respiratory problems in the birth. In absence of an effective therapeutic treatment they are many to die during the first year of their life. My thesis work consists in developing a treatment of gene therapy for myotubular myopathy. The intravenous injection of the therapeutic vector rAAV9-DES-MTM1 into the murin model of the myotubular myopathy allows transgenic protein in the whole skeletal muscle of the body. The therapeutic protein cures the muscular phenotype rapidly after injection. At one year after treatment, the thick muscles still be cured, mice are alive and recovered a normal development. Then, I estimated the effects of the protein MTMR2, a counterpart of the myotubularine (MTM1), on muscles from mice devoid of myotubularin, as alternative at the gene therapy with MTM1. The administration of a vector AAV containing the transgene MTMR2 in the thick muscles improves, partially, the muscular phenotype. These results suggest that the increase of MTMR2 protein level MTMR2 thick muscle could be an effective treatment. Finally, I studied the role of myotubularin phosphatase activity on its therapeutic action, I compared the effect of an inactive shape of myotubularin (MTM1C375S) on muscle affected by myotubular myopathy as the effect of therapeutic transgene on the same muscle. The results show that the phosphatase activity of the myotubularin is necessary for its therapeutic activity.