Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T14:14:52Z No. of bitstreams: 2 Tese Bruna Santos da Silva.pdf: 5490209 bytes, checksum: 3f573d8e12cce7ecb3d65c6ed869ad1f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:14:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Bruna Santos da Silva.pdf: 5490209 bytes, checksum: 3f573d8e12cce7ecb3d65c6ed869ad1f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-07-30 / FACEPE CPqAM/FIOCRUZ / A indução da expressão gênica mediada pelo NF-B foi descrita na patogênese da doença hepática alcoólica (DHA). Dietilcarbamazina (DEC) é um fármaco derivado da piperazina com propriedades anti-inflamatórias. O presente estudo foi desenvolvido para avaliar o efeito de DEC na via do NF-B na inflamação hepática induzida pelo alcoolismo. Quarenta camundongos machos C57BL/6 foram divididos igualmente em quatro grupos: 1) grupo controle (C), que recebeu apenas água, 2) grupo tratado com DEC, que recebeu 50 mg/kg durante um período de 12 dias (DEC50), 3) o grupo alcoólico (EtOH), submetido ao consumo crônico de álcool e 4) o grupo alcoólico tratado com DEC (EtOH50), submetido ao consumo crônico de álcool e tratado com DEC. Fragmentos de fígado foram analisados por meio de microscopia de luz, imunohistoquímica e testes de western blot para avaliar vários mecanismos envolvidos na lesão hepática induzida pelo etanol, incluindo a peroxidação lipídica, marcadores inflamatórios e a ativação de fatores de transcrição. A análise histológica do grupo alcoólico mostrou dano hepatocelular evidente que foi reduzido no grupo alcóolico tratado com DEC. Os resultados da imunohistoquímica e do western blot mostraram expressão elevada de marcadores inflamatórios como MDA, TNF-, IL-1, COX-2 e iNOS nos hepatócitos do grupo EtOH. No entanto, pouca imunopositividade para estes marcadores foi detectada após tratamento com DEC. No grupo de EtOH a ativação do fator de transcrição NF-kB foi observada através de um aumento na expressão de ambos, NF-B e pNF-B, em hepatócitos. Esta expressão foi significativamente reduzida nos fígados do grupo EtOH50. A expressão da proteína IB foi medida para determinar se a ativação do NF-B seria resultado da degradação da IB. Observou-se que a expressão desta enzima era baixa no grupo EtOH, enquanto que os animais tratados com DEC tinha uma expressão elevada de IB. Os resultados do presente estudo indicam que a DEC atenua a lesão hepática alcoólica, em parte, pela inibição da ativação do NF-B e por suprimir a indução de genes dependentes do NF-B.

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Diversos estudos tem demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTM) são imbuídas de uma forte atividade imunossupressora in vitro, no entanto, os resultados de imunoterapias utilizando CTM têm sido variáveis até o momento. Nossa hipótese para tal variação são interações que devem ocorrer entre as CTM e fragmentos de patógenos circulantes nos pacientes, resultando na modulação da atividade imunossupressora. Para avaliar a ocorrência deste fenômeno em CTM de medula óssea, inicialmente foi avaliado a presença de diversos TLR através da marcação com anticorpos e posterior quantificação por citometria de fluxo, sendo observada a presença dos TLR2, TLR3, TLR4 e TLR9. No intuito de avaliar alterações no potencial imunossupressor, linfócitos T ativados e marcados a nível intracelular foram co-cultivados com CTM estimuladas com LPS, POLY IC e oligonucleotídeos com motivos CpG: DSP30, CpG-A e CpG-B, sendo sua proliferação quantificada por citometria de fluxo. Como resultados, foi observado que a estimulação com LPS e DSP30 levaram a perda e acentuação da capacidade supressora, respectivamente, enquanto o estímulo simultâneo com LPS e DSP30 resultou em sua manutenção. Tais modulações na imunossupressão foram corroboradas ao serem avaliadas modulações na expressão gênica, tendo em vista que o estímulo por LPS e DSP30 induziram no aumento da expressão de IL1 e TGF, respectivamente. Em seguida, foi avaliado o efeito das mesmas condições experimentais na indução a proliferação das CTM, ao ser mensurada alterações na quantidade de células em um equipamento de High content Screening (HCS). Como resultados, foi possível observar que somente o tratamento com DSP30 foi capaz de aumentar significativamente a quantidade de células, fenômeno corroborado ao ser mensurada a síntese de DNA, através da utilização de um produto comercial, seguido de análise por citometria de fluxo. No intuito de avaliar possíveis modulações na via NF-B, CTM estimuladas com LPS ou DSP30 foram sujeitas ao ensaio de imunoprecipitação de cromatina, utilizando anticorpos específicos a subunidades de RelA e RelB, sendo o DNA imunoprecipitado sujeito a PCR quantitativo com primers específicos para a regiões promotoras do gene VCAM-1. Como resultados, foi observado que o estímulo com LPS aumentou a atividade do RelA, enquanto não foram observados efeitos após o estímulo com DSP30. No entanto, o estímulo simultâneo com ambos os ligantes levou ao aumento de atividade de RelA e RelB. Ao serem avaliadas estas condições em um ensaio de imunofluorescência analisado em HCS, foi possível observar maiores níveis da proteína RelB no citoplasma das células tratadas com DSP30, sugerindo um aumento da sua formação. Apesar dos mecanismos moleculares subjacentes aos resultados observados ainda necessitarem de maior elucidação, nosso trabalho indica que a estimulação das CTM com DSP30 pode trazer benefícios no sentido de potencializar a imunossupressão e proliferação celular, além de impedir a perda da imunossupressão, decorrente da interação com LPS. Tais resultados poderão servir como diretrizes para o aprimoramento de imunoterapias utilizando CTM de medula óssea, principalmente em casos de pacientes com infecções por patógenos. / Several studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs ) are imbued with a strong immunosuppressive activity in vitro , however , the results of immunotherapies using CTM has been mixed so far. Our hypothesis for this variation are interactions that must occur between the CTM and fragments of circulating pathogens in patients , resulting in the modulation of the immunosuppressive activity. To evaluate the occurrence of this phenomenon in bone marrow MSCs was initially evaluated the presence of various TLR by staining with antibodies and subsequent quantification by flow cytometry , the presence of TLR2 , TLR3 , TLR4 and TLR9 was observed . To assess changes in the immunosuppressive , activated T lymphocytes and labeled intracellularly potential were co-cultured with MSC stimulated with LPS , poly IC and oligonucleotides with CpG motifs : DSP30 , CpG - A and CpG - B , and their proliferation measured by flow cytometry. As a result , it was observed that stimulation with LPS and DSP30 led to loss of stress and suppressing ability , respectively, while simultaneous stimulation with LPS and DSP30 resulted in maintenance. Such modulations in immunosuppression were corroborated when assessing modulations in gene expression , given that the stimulus induced by LPS and DSP30 in increased expression of TGFb and IL1 , respectively. Then , the effect of the same experimental conditions inducing proliferation of MTC to be measured changes in the amount of cells in a High Content Screening equipment (HCS ) was measured . As a result , it was observed that only the DSP30 treatment was able to significantly increase the amount of cells, phenomenon to be measured supported DNA synthesis through the use of a commercial product followed by analysis by flow cytometry . In order to evaluate possible modulations in NF-kB pathway , CTM stimulated with LPS or DSP30 were subjected to chromatin immunoprecipitation assay , using antibodies specific to subunits RelA and RelB , and the immunoprecipitated DNA subjected to quantitative PCR with primers specific to the promoter regions of VCAM-1 gene. As a result , it was observed that stimulation with LPS increased the activity of RelA , while effects were not observed after stimulation with DSP30 . However , simultaneous stimulation with both ligands led to increased activity of RelA and RelB . When these conditions are evaluated in an assay in HCS immunofluorescence analysis , we observed higher levels of RelB protein in the cytoplasm of cells treated with DSP30 , suggesting an increase in their formation. Although the molecular mechanisms underlying the observed results still require further elucidation , our work indicates that stimulation of MSC with DSP30 can bring benefits in terms of enhancing immunosuppression and cell proliferation , and prevent loss of immunosuppression resulting from the interaction with LPS . These results can serve as guidelines for the improvement of immunotherapies using CTM bone marrow , especially in cases of patients with infections caused by pathogens.

Diversos estudos tem demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTM) são imbuídas de uma forte atividade imunossupressora in vitro, no entanto, os resultados de imunoterapias utilizando CTM têm sido variáveis até o momento. Nossa hipótese para tal variação são interações que devem ocorrer entre as CTM e fragmentos de patógenos circulantes nos pacientes, resultando na modulação da atividade imunossupressora. Para avaliar a ocorrência deste fenômeno em CTM de medula óssea, inicialmente foi avaliado a presença de diversos TLR através da marcação com anticorpos e posterior quantificação por citometria de fluxo, sendo observada a presença dos TLR2, TLR3, TLR4 e TLR9. No intuito de avaliar alterações no potencial imunossupressor, linfócitos T ativados e marcados a nível intracelular foram co-cultivados com CTM estimuladas com LPS, POLY IC e oligonucleotídeos com motivos CpG: DSP30, CpG-A e CpG-B, sendo sua proliferação quantificada por citometria de fluxo. Como resultados, foi observado que a estimulação com LPS e DSP30 levaram a perda e acentuação da capacidade supressora, respectivamente, enquanto o estímulo simultâneo com LPS e DSP30 resultou em sua manutenção. Tais modulações na imunossupressão foram corroboradas ao serem avaliadas modulações na expressão gênica, tendo em vista que o estímulo por LPS e DSP30 induziram no aumento da expressão de IL1 e TGF, respectivamente. Em seguida, foi avaliado o efeito das mesmas condições experimentais na indução a proliferação das CTM, ao ser mensurada alterações na quantidade de células em um equipamento de High content Screening (HCS). Como resultados, foi possível observar que somente o tratamento com DSP30 foi capaz de aumentar significativamente a quantidade de células, fenômeno corroborado ao ser mensurada a síntese de DNA, através da utilização de um produto comercial, seguido de análise por citometria de fluxo. No intuito de avaliar possíveis modulações na via NF-B, CTM estimuladas com LPS ou DSP30 foram sujeitas ao ensaio de imunoprecipitação de cromatina, utilizando anticorpos específicos a subunidades de RelA e RelB, sendo o DNA imunoprecipitado sujeito a PCR quantitativo com primers específicos para a regiões promotoras do gene VCAM-1. Como resultados, foi observado que o estímulo com LPS aumentou a atividade do RelA, enquanto não foram observados efeitos após o estímulo com DSP30. No entanto, o estímulo simultâneo com ambos os ligantes levou ao aumento de atividade de RelA e RelB. Ao serem avaliadas estas condições em um ensaio de imunofluorescência analisado em HCS, foi possível observar maiores níveis da proteína RelB no citoplasma das células tratadas com DSP30, sugerindo um aumento da sua formação. Apesar dos mecanismos moleculares subjacentes aos resultados observados ainda necessitarem de maior elucidação, nosso trabalho indica que a estimulação das CTM com DSP30 pode trazer benefícios no sentido de potencializar a imunossupressão e proliferação celular, além de impedir a perda da imunossupressão, decorrente da interação com LPS. Tais resultados poderão servir como diretrizes para o aprimoramento de imunoterapias utilizando CTM de medula óssea, principalmente em casos de pacientes com infecções por patógenos. / Several studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs ) are imbued with a strong immunosuppressive activity in vitro , however , the results of immunotherapies using CTM has been mixed so far. Our hypothesis for this variation are interactions that must occur between the CTM and fragments of circulating pathogens in patients , resulting in the modulation of the immunosuppressive activity. To evaluate the occurrence of this phenomenon in bone marrow MSCs was initially evaluated the presence of various TLR by staining with antibodies and subsequent quantification by flow cytometry , the presence of TLR2 , TLR3 , TLR4 and TLR9 was observed . To assess changes in the immunosuppressive , activated T lymphocytes and labeled intracellularly potential were co-cultured with MSC stimulated with LPS , poly IC and oligonucleotides with CpG motifs : DSP30 , CpG - A and CpG - B , and their proliferation measured by flow cytometry. As a result , it was observed that stimulation with LPS and DSP30 led to loss of stress and suppressing ability , respectively, while simultaneous stimulation with LPS and DSP30 resulted in maintenance. Such modulations in immunosuppression were corroborated when assessing modulations in gene expression , given that the stimulus induced by LPS and DSP30 in increased expression of TGFb and IL1 , respectively. Then , the effect of the same experimental conditions inducing proliferation of MTC to be measured changes in the amount of cells in a High Content Screening equipment (HCS ) was measured . As a result , it was observed that only the DSP30 treatment was able to significantly increase the amount of cells, phenomenon to be measured supported DNA synthesis through the use of a commercial product followed by analysis by flow cytometry . In order to evaluate possible modulations in NF-kB pathway , CTM stimulated with LPS or DSP30 were subjected to chromatin immunoprecipitation assay , using antibodies specific to subunits RelA and RelB , and the immunoprecipitated DNA subjected to quantitative PCR with primers specific to the promoter regions of VCAM-1 gene. As a result , it was observed that stimulation with LPS increased the activity of RelA , while effects were not observed after stimulation with DSP30 . However , simultaneous stimulation with both ligands led to increased activity of RelA and RelB . When these conditions are evaluated in an assay in HCS immunofluorescence analysis , we observed higher levels of RelB protein in the cytoplasm of cells treated with DSP30 , suggesting an increase in their formation. Although the molecular mechanisms underlying the observed results still require further elucidation , our work indicates that stimulation of MSC with DSP30 can bring benefits in terms of enhancing immunosuppression and cell proliferation , and prevent loss of immunosuppression resulting from the interaction with LPS . These results can serve as guidelines for the improvement of immunotherapies using CTM bone marrow , especially in cases of patients with infections caused by pathogens.

Os linfócitos T regulatórios (Tregs) desempenham um papel essencial no controle da tolerância periférica, regulando a homeostase do sistema imune, e, por este motivo, são consideradas a população celular - com fenótipo regulatório - mais importante do sistema imune. Sob estímulos específicos, as Tregs podem ser geradas naturalmente no timo (nTregs), ou serem induzidas na periferia (pTreg) a partir de células T naive. É possível gerar Tregs in vitro (iTreg) a partir de células T CD4+ naive isoladas de sangue de cordão umbilical, suplementando a cultura com TGF-?, atRA e IL-2. Haja vista o grande potencial terapêutico das iTregs, a comunidade científica apresenta grande interesse no entendimento dos mecanismos envolvidos em sua geração. Os mais recentes trabalhos indicam um importante papel da via NF-?B na geração destas células, especialmente no que tange o componente c-Rel. Entretanto, na literatura, não existem dados suficientes sobre a avaliação dos genes potencialmente orquestrados por este fator. Permeado por todo este questionamento, o presente trabalho avalia a interação de c-Rel com as regiões promotoras do genoma, em células T naive e nas células iTregs geradas in vitro. Em adição, também avalia o efeito do silenciamento da proteína c-Rel no perfil de geração das iTregs. Para isso, foi utilizada a metodologia de imunoprecipitação de cromatina atrelada à técnica de PCR em tempo real com primers, que cobrem as regiões promotoras de alguns genes com papel importante na biologia de células T naive e de iTreg. Também foi avaliado a eficiência de transfecção de siRNA contra c-Rel e também do siRNA marcado com molécula fluorescente FITC em conjunto com diferentes concentrações e diferentes reagentes de transfecção, utilizando células Jurkat e T naive. Nossos resultados mostraram uma melhor eficiência de transfecção do siRNA FITC, considerando as células viáveis transfectadas, com os agentes DharmaFECT®1 (22,14%), DharmaFECT®4 (43,14%) e DMRIE-C (27,59%) em células Jurkat e DharmaFECT®1 (16,35%) e DMRIE-C (25,94%) em células T naive, nas maiores concentrações, entretanto não é muito eficiente para a avaliação do silenciamento proteico por qPCR. Além disso demonstramos que em uma pureza média de 80,46% de células Tnaive isoladas obtivemos a geração das iTregs (CD4+CD25+CD127-FOXP3+) com 98,42%, em média, na expressão do marcador FOXP3, e essas células iTregs apresentam maior ligação de cRel aos promotores de genes como IL2RA (CD25) (média de 8,26 vezes), CD69 (3,71 vezes), regiões do gene FOXP3 (região promotora (20,15 vezes), região CNS - kb1 (16,9 vezes), kb2 (17,2 vezes) e kb3 (23,29 vezes)) e do próprio Rel (8,12 vezes). Estes resultados evidenciam os potenciais mecanismos de regulação exercidos por c-Rel, durante o processo de geração das iTregs. / Regulatory T lymphocytes (Tregs) play an essential role in the control of peripheral tolerance, regulating the homeostasis of the immune system, and are considered the cellular population - with regulatory phenotype - most important of the immune system. Tregs can be generated naturally in the thymus (nTregs), or be induced at the periphery (pTreg) from naive T cells, in dependence of specifcs stimuli. In cell culture, supplemented with factors such as IL-2, TGF-? and atRA, it is possible to generate in vitro Tregs (iTreg) from naive CD4 + T cells isolated from umbilical cord blood. Knowing the great therapeutic potential of iTregs, the scientific community has shown great interest in understanding the mechanisms involved in this process. Recent works indicate an important role of the NF-?B pathway in the generation of these cells, especially relating the involvement of the c-Rel componente, however, in the literature, there are not enough data on the evaluation of genes potentially orchestrated by this factor. With all this questioning, this thesis aimed to evaluate the interaction of c-Rel with the some promoter regions of the genome, naive T cells and in vitro generated iTregs cells, in addition, we have also attempted to evaluate the effect of c-Rel protein silencing on the generation profile of iTregs. For this, the methodology of chromatin immunoprecipitation coupled to the real-time PCR technique with primers was used, which cover the promoter regions of some genes with important role in the biology of naive and iTreg T cells, The efficiency of siRNA transfection against c-Rel and also the siRNA labeled with FITC fluorescence molecule in conjunction with different concentrations and different transfection reagentes, using Jurkat and naive T cells, was also evaluated. Our results showed a better transfection efficiency of the FITC siRNA, considering the viable cells transfected with the highest concentrations of the reagents DharmaFECT®1 (22,14%), DharmaFECT®4 (43,14%) e DMRIE-C (27,59%) with Jurkat cells and DharmaFECT®1 (16,35%) e DMRIE-C (25,94%) with naive T cells, however, was not very efficient for the evaluation by qPCR of silencing, that is, the reduction of c-Rel mRNA and RNA of other genes. In addition, we demonstrated that in an average purity of 80.46% of isolated naive T cells we obtained the generation of iTregs (CD4 + CD25 + CD127-FOXP3 +) with 98.42%, on average, in the expression of the FOXP3 marker, and in these iTregs cells, when compared to naive T cells, c-Rel subunit has bound to the promoters of the genes as IL2RA (CD25) (average de 8,26 folds), CD69 (3,71 folds), regions of the FOXP3 gene (promoter region (20,15 folds), CNS regions - kb1 (16,9 folds), kb2 (17,2 folds) and kb3 (23,29 folds)) and c-Rel promoter - Rel (8,12 folds). Our results demonstrate the possible regulatory mechanisms, such as some of the main roles of the c-Rel subunit during the generation process of iTregs.

O Diabetes Mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença metabólica multifatorial caracterizada por hiperglicemia e hipoinsulinemia crônicas, decorrentes da destruição progressiva das células &#946 pelo sistema imunológico. Durante a progressão do DM1, as ilhotas de Langherhans são invadidas por células do sistema imune que secretam citocinas pró-inflamatórias, gerando um quadro denominado insulite. A exposição das células &#946 a essas citocinas leva a ativação de diversas vias de sinalização que aumentam o estresse oxidativo e de retículo endoplasmático, contribuindo para a indução da morte das células &#946. Existem muitos estudos que investigam as vias moleculares que levam à destruição da célula durante o DM1, contudo é necessário um melhor entendimento da regulação e contribuição dessas diferentes vias para o desenvolvimento dessa patologia para que se possa desenhar terapias mais apropriadas para impedir seu desenvolvimento ou até mesmo para se atingir uma cura. Algumas das dificuldades encontradas na aplicação desses estudos estão relacionadas ao fato de que eles são conduzidos em sua maioria em células &#946 ou ilhotas isoladas em cultura. Sabe-se que há uma importante regulação entre os diferentes tipos celulares presentes na ilhota e também entre as células da ilhota e as células adjacentes a ela, o que, sem dúvida, influencia no destino da célula &#946 frente a um ataque autoimune. Este trabalho visou aperfeiçoar o conhecimento acerca do comportamento das células da ilhota pancreática frente ao desenvolvimento do DM1, utilizando técnicas de imunomarcação em cortes histológicos pancreáticos de três modelos animais de DM1. No primeiro modelo: Influência do exercício físico na indução do DM1, mostramos que o exercício físico é capaz de prevenir a destruição das células &#946 e potencialmente estar envolvido na transdiferenciação celular para recuperação de células endócrinas na ilhota desses animais. No segundo modelo: Efeito de NOX1 e NOX2 na viabilidade e função de células &#946 \", observamos que a presença dessas NADPH oxidases parece ter influência na estrutura e provavelmente na viabilidade de células &#946. No terceiro modelo: Papel de HNF4 &#945 na viabilidade e função das células &#946, mostramos que a imunomarcação das ilhotas de animais KO para esse fator de transcrição nas células &#946 é uma ferramenta de extrema importância para esse estudo. O desenvolvimento desse trabalho possibilita que a investigação de diferentes vias envolvidas na destruição das células &#946 seja realizada no ambiente em que essas células se encontram, permitindo avaliar a ativação de vias especificas, como por exemplo ativação de NF-kB e validar os resultados observados em células isoladas. / Type 1 Diabetes Mellitus (DM1) is a multifactorial metabolic disease characterized by chronic hyperglycemia and hypoinsulinemia, which is due to the progressive and specific destruction of &#946 cells by the immune system. During the progression of DM1, the islets of Langherhans are invaded by cells of the immune system that secrete proinflammatory cytokines, in a process called insulitis. Exposure of &#946 cells to these cytokines leads to the activation of several signaling pathways that increase oxidative and endoplasmic reticulum stress, contributing to the -cell death. There are many studies that investigate the molecular pathways that lead to the destruction of the &#946-cell during DM1, but a better understanding of the regulation and contribution of these different pathways to the development of this pathology is necessary in order to design more appropriate therapies to prevent their development or even to achieve a cure. Some of the difficulties encountered in the application of these studies are related to the fact that they are conducted mostly on &#946-cells or isolated islets in cell culture. It is known that there is an important regulation between the different cell types present in the islet and also between the islet cells and the cells adjacent to it, which undoubtedly influences the fate of the &#946-cell against an autoimmune attack. This work aimed to improve the knowledge about the behavior of pancreatic islet cells in the development of DM1, using immunostaining techniques in pancreatic histological sections of three animal models of DM1. In the first model, \"Influence of physical exercise on the induction of DM1\", we showed that physical exercise is able to prevent the destruction of &#946 cells and potentially be involved in cell transdifferentiation for the recovery of endocrine cells in the islet of these animals. In the second model, \"Effect of NOX1 and NOX2 on viability and &#946 cell function\", we observed that the presence of these NADPH oxidases appears to influence the structure and probably the viability of &#946 cells. \"In the third model:\" Role of HNF4&#945 in viability and &#946 cell function, we show that the immunostaining of islets of KO animals for this transcription factor in &#946 cells is a tool of paramount importance for this study. The development of this work enables the investigation to be performed in the environment of these cells, allowing to evaluate the activation of specific pathways and validate the results observed in isolated cells.

Meduloblastoma é um câncer do sistema nervoso central, altamente invasivo, de origem embrionária, localizado no cerebelo. É mais comum em crianças e corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos. Os tratamentos mais utilizados são cirurgia e quimioterapia, sendo que a radioterapia é aplicada somente em crianças com mais de 3 anos devido aos seus efeitos colaterais. Diversos estudos têm mostrado o papel do NF-B na regulação de genes envolvidos com o processo neoplásico. NF-B é um fator de transcrição chave na regulação da resposta imune e no processo de inflamação e está envolvido na regulação da transcrição de um grande número de genes relacionados ao processo de tumorigênese, além de ser constitutivamente ativo em diversos tipos de câncer, sendo um importante potencial alvo terapêutico. O DHMEQ (Dehidroximetilepoxiquinomicina) é uma droga que inibe a translocação do NF-B do citoplasma para o núcleo, inibindo assim a sua atuação como ativador transcricional. Vários trabalhos tem mostrado os efeitos antineoplásicos do DHMEQ em inúmeros tipos tumorais, entretanto, não há trabalhos que evidenciem esses efeitos em meduloblastoma. Assim, o presente estudo objetivou avaliar os efeitos dessa droga nas linhagens UW402, UW473 e ONS-76 de meduloblastoma pediátrico através de estudos funcionais e moleculares. Os resultados de proliferação demostraram uma significativa diminuição do crescimento celular nas linhagens de meduloblastoma, inibindo cerca de 80, 70 e 60% nas linhagens UW402, UW473 e ONS-76, respectivamente, na dose de 20 g/mL, e apresentou um IC50 de 10g/mL em 48h para as linhagens UW402 e UW473 e em 72h na linhagem ONS-76. Adicionalmente, elevou o nível de apoptose para 50, 17 e 31% nessas linhagens, respectivamente, inibiu fortemente a capacidade clonogênica, a migração e a invasão celular nas três linhagens e foi sinérgico na combinação com outros quimioterápicos em grande parte dos pontos de combinação, além de radiossensibilizar fortemente as três linhagens. Os resultados são congruentes com o potencial efeito antitumoral de DHMEQ. / Medulloblastoma is a cancer of the central nervous system, highly invasive, of embryonic origin, located in the cerebellum. It is more common among children and accounts for approximately 20% of all pediatric intracranial tumors. The most common treatments are surgery and chemotherapy, and radiotherapy is only to children older than 3 years old due to its side effects. Several studies have demonstrated the role of NF-B in the regulation of genes involved in the neoplastic process. NF-B is a key transcription factor in the regulation of immune response and inflammation process, and it is involved in the transcriptional regulation of a large number of genes related to the tumorigenesis process, and constitutively active in many types of cancer, being an important potential therapeutic target. DHMEQ (Dehidroximetilepoxiquinomicina) is a drug that inhibits the translocation of NF-B from the cytoplasm to the nucleus, thus inhibiting its activity as a transcriptional activator. Several studies have shown the antineoplastic effects of DHMEQ in numerous tumor types, however, there is no surveys that have tested their effects in medulloblastoma. Thus, the present study aimed to evaluate the effects of this drug in UW402, UW473 and ONS-76 pediatric medulloblastoma cell lines through functional and molecular studies. The proliferation test results demonstrated a significant decrease in the cell growth in the medulloblastoma cell lines, inhibiting approximately 80, 70 and 60% for UW402, UW473 and ONS-76, respectively, at a dose of 20g/mL, and showed an IC50 of 10g/mL at 48h for UW402 and UW473 and at 72h in ONS-76. Additionally, increased the level of apoptosis to 50, 17 and 31% in these cell lines, respectively, strongly inhibited the clonogenic capacity, the migration and cell invasion in the three lines and it was synergistic in combination with other chemotherapeutic agents in most combination points, and radiosensitization strongly the three cell lines. The results are congruent with the potential antitumor effect of DHMEQ.

Dissertation (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2006. / Vita. Bibliography: p.112-122

Meduloblastoma é um câncer do sistema nervoso central, altamente invasivo, de origem embrionária, localizado no cerebelo. É mais comum em crianças e corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos. Os tratamentos mais utilizados são cirurgia e quimioterapia, sendo que a radioterapia é aplicada somente em crianças com mais de 3 anos devido aos seus efeitos colaterais. Diversos estudos têm mostrado o papel do NF-B na regulação de genes envolvidos com o processo neoplásico. NF-B é um fator de transcrição chave na regulação da resposta imune e no processo de inflamação e está envolvido na regulação da transcrição de um grande número de genes relacionados ao processo de tumorigênese, além de ser constitutivamente ativo em diversos tipos de câncer, sendo um importante potencial alvo terapêutico. O DHMEQ (Dehidroximetilepoxiquinomicina) é uma droga que inibe a translocação do NF-B do citoplasma para o núcleo, inibindo assim a sua atuação como ativador transcricional. Vários trabalhos tem mostrado os efeitos antineoplásicos do DHMEQ em inúmeros tipos tumorais, entretanto, não há trabalhos que evidenciem esses efeitos em meduloblastoma. Assim, o presente estudo objetivou avaliar os efeitos dessa droga nas linhagens UW402, UW473 e ONS-76 de meduloblastoma pediátrico através de estudos funcionais e moleculares. Os resultados de proliferação demostraram uma significativa diminuição do crescimento celular nas linhagens de meduloblastoma, inibindo cerca de 80, 70 e 60% nas linhagens UW402, UW473 e ONS-76, respectivamente, na dose de 20 g/mL, e apresentou um IC50 de 10g/mL em 48h para as linhagens UW402 e UW473 e em 72h na linhagem ONS-76. Adicionalmente, elevou o nível de apoptose para 50, 17 e 31% nessas linhagens, respectivamente, inibiu fortemente a capacidade clonogênica, a migração e a invasão celular nas três linhagens e foi sinérgico na combinação com outros quimioterápicos em grande parte dos pontos de combinação, além de radiossensibilizar fortemente as três linhagens. Os resultados são congruentes com o potencial efeito antitumoral de DHMEQ. / Medulloblastoma is a cancer of the central nervous system, highly invasive, of embryonic origin, located in the cerebellum. It is more common among children and accounts for approximately 20% of all pediatric intracranial tumors. The most common treatments are surgery and chemotherapy, and radiotherapy is only to children older than 3 years old due to its side effects. Several studies have demonstrated the role of NF-B in the regulation of genes involved in the neoplastic process. NF-B is a key transcription factor in the regulation of immune response and inflammation process, and it is involved in the transcriptional regulation of a large number of genes related to the tumorigenesis process, and constitutively active in many types of cancer, being an important potential therapeutic target. DHMEQ (Dehidroximetilepoxiquinomicina) is a drug that inhibits the translocation of NF-B from the cytoplasm to the nucleus, thus inhibiting its activity as a transcriptional activator. Several studies have shown the antineoplastic effects of DHMEQ in numerous tumor types, however, there is no surveys that have tested their effects in medulloblastoma. Thus, the present study aimed to evaluate the effects of this drug in UW402, UW473 and ONS-76 pediatric medulloblastoma cell lines through functional and molecular studies. The proliferation test results demonstrated a significant decrease in the cell growth in the medulloblastoma cell lines, inhibiting approximately 80, 70 and 60% for UW402, UW473 and ONS-76, respectively, at a dose of 20g/mL, and showed an IC50 of 10g/mL at 48h for UW402 and UW473 and at 72h in ONS-76. Additionally, increased the level of apoptosis to 50, 17 and 31% in these cell lines, respectively, strongly inhibited the clonogenic capacity, the migration and cell invasion in the three lines and it was synergistic in combination with other chemotherapeutic agents in most combination points, and radiosensitization strongly the three cell lines. The results are congruent with the potential antitumor effect of DHMEQ.

Background microRNA-23b (miR-23b) is a multiple functional miRNA. We hypothesize that miR-23b plays a role in the pathogenesis of sepsis. Our study investigated the effect of miR-23b on sepsis-induced immunosuppression. Methods Mice were treated with miR-23b inhibitors by tail vein injection 2 days after cecal ligation puncture (CLP)-induced sepsis. Apoptosis in spleens and apoptotic signals were investigated, and survival was monitored. T-cell immunoreactivities were examined during late sepsis. Nuclear factor B (NF-B)-inducing kinase (NIK), tumor necrosis factor (TNF)-receptor associated factor 1 (TRAF1), and X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), the putative targets of miR-23b, were identified by a dual-luciferase reporter assay. Results miR-23b expression is upregulated and sustained during sepsis. The activation of the TLR4/TLR9/p38 MAPK/STAT3 signal pathway contributes to the production of miR-23b in CLP-induced sepsis. miR-23b inhibitor decreased the number of spleen cells positive by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling and improved survival. miR-23b inhibitor restored the immunoreactivity by alleviating the development of T-cell exhaustion and producing smaller amounts of immunosuppressive interleukin 10 and interleukin 4 during late sepsis. We demonstrated that miR-23b mediated immunosuppression during late sepsis by inhibiting the noncanonical NF-B signal and promoting the proapoptotic signal pathway by targeting NIK, TRAF1, and XIAP. Conclusions Inhibition of miR-23b reduces late-sepsis-induced immunosuppression and improves survival. miR-23b might be a target for immunosuppression.