A vitamina A e seus derivados, os retinóides, participam de processos celulares tais como desenvolvimento, proliferação, diferenciação e apoptose. Os efeitos da vitamina A, em sua maior parte, são atribuídos à ativação de receptores nucleares da família dos receptores esteróides, conhecidos como receptores de ácido retinóico (RAR) e receptores de retinóides (RXR). No entanto, o excesso de vitamina A, ou de retinóides, na dieta, ou devido a uso terapêutico, pode ser teratogênico. Diversos trabalhos tem demonstrado "in vitro" e "in vivo" que a vitamina A e seus metabólitos são moléculas redox ativas, isto é, podem agir como pró-oxidantes ou antioxidantes, dependendo da concentração e do ambiente em que se encontram. Nesse trabalho nós demonstramos que o tratamento com retinol, o qual é considerado o principal metabólito da vitamina A, em células da linhagem A549, a qual é derivada de um carcinoma de pulmão de não-pequenas células, levou a uma diminuição da expressão e do imunoconteúdo do receptor para produtos finais avançados de glicação (RAGE). O RAGE é constutivamente expresso nas células pulmonares, sendo que qualquer alteração na sua expressão ou imunoconteúdo induz alterações na homeostase do tecido pulmonar. Nós verificamos que a modulação do RAGE induzida pelo tratamento com retinol em nosso modelo foi redox dependente. O tratamento das células A549 com retinol induziu um aumento na produção de espécies reativas do oxigênio, o qual por consequência tornou o ambiente celular próoxidativo favorecendo a indução de danos a biomoléculas como lipídeos e proteínas. Além disso, o aumento na produção de espécies reativas do oxigênio levou a ativação da MAPK p38, por um mecanismo redox-dependente. A ativação da p38 subsequentemente levou à ativação do fator de transcrição NF-kB, o qual por consequência acabou por modular a expressão e imunoconteúdo do RAGE nessas células. Todos os efeitos ocasionados pelo tratamento com retinol foram bloqueados com o co-tratamento com Trolox® (análogo hidrofílico da vitamina E), o qual é uma molécula antioxidante. Portanto, nossos resultados demonstraram que o tratamento com retinol é capaz de induzir um estado pró-oxidativo nas células A549, o qual por consequência acaba por modular a expressão do RAGE de maneira redox-dependente e via a ativação da rota de sinalização da p38 - NF-kB. Então, a partir destes resultados e de outros dados já reportados na literatura, acreditamos que é necessário uma maior cautela no uso de vitamina A tanto a nível de suplementação quanto a nível terapêutico. / Vitamin A and its derivatives, the retinoids, participate in cellular processes such as growth, cell division and apoptosis. The effects of vitamin A, in part, are ascribed to gene transcription mediated by nuclear receptors from the family of the steroid receptors, known as retinoic acid receptors (RARs) and retinoid receptors (RXRs). However, excessive vitamin A, or retinoids, in the diet, or by therapeutic use, may be theratogenic. Several studies have shown "in vitro" and "in vivo" that vitamin A and its metabolites are redox active molecules, that is, may act as pro-oxidants and antioxidants, depending on the concentration and the environment in which they are. In this study we demonstrated that treatment with retinol, which is considered to be the principal metabolite of vitamin A, in cell lines of non-small cells lung carcinoma A549 led to a decrease in the expression and immunocontent of receptor for advanced glycation endproducts (RAGE). The RAGE is constitutively expressed in lung cells; a modulation in expression or immunocontent of RAGE is associated with alterations on homeostasis of lung tissue. Here, we found that the modulation of RAGE induced by retinol treatment in our model was redox dependent. Retinol treatment of A549 cells induced an increase in the production of reactive oxygen species, which consequently become the pro-cellular environment favoring the induction of oxidative damage to biomolecules such as lipids and proteins. Furthermore, the increase in production of reactive oxygen species led to activation of p38 MAPK by a redox-dependent mechanism. Activation of p38 subsequently led to activation of the transcription factor NF-kB, which consequently modulates the expression of RAGE in these cells. All effects caused by retinol treatment were blocked with Trolox ® (hydrophilic analogue of Vitamin E) co-treatment, which is an antioxidant molecule. Therefore, our results demonstrated that retinol treatment is able to induce a pro-oxidative status in A549 cells, and that modulation of RAGE expression by retinol is mediated by the redox-dependent activation of p38/NF-kB signaling pathway. Then, based on these results and other data already reported in the literature, we believe that greater care is needed in the use of vitamin A supplementation as therapeutic level.

Resumo não disponível

Resumo não disponível

A identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de glioblastomas multiformes (GBMs) se faz necessária devido ao mau prognóstico e ineficiência das terapias associadas a esses tumores. Nesta dissertação, avaliamos o envolvimento do Fator Nuclear kappaB (NFkappaB) e da via da PI3K/Akt no crescimento in vitro de glioblastomas, e o potencial uso dos inibidores de NFkappaB e de PI3K/Akt como possíveis agentes antitumorais. Com esta finalidade foram utilizados os inibidores farmacológicos de NFkappaB (partenolide), e de PI3K/Akt (quercetina e Ly294002), e o inibidor misto de NFkappaB/Akt (curcumina). Os inibidores de NFkappaB causaram uma significativa diminuição na viabilidade dos GBMs quando comparado com os inibidores de outras vias de sinalização (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr e JNK1/2), a qual foi tipo dose resposta. Além disso, os inibidores de NFkappaB apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura e perda de integridade da membrana plasmática que foi vista através da técnica do Iodeto de Propideo (PI). Já os inibidores de PI3K/Akt apresentaram um menor efeito do que o apresentado pelos inibidores de NFkappaB, não demonstrando uma curva do tipo dose resposta, ainda assim, diminuíram a viabilidade dos GBMs. Entretanto, não apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura, e não houve incorporação de PI, mostrando que, diferentemente do que ocorre com os inibidores de NFkappaB, a perda de viabilidade vista nas células tratadas com os inibidores de PI3K/Akt está preponderavelmente relacionada com uma diminuição na proliferação, e não com morte celular. Vimos também que os inibidores foram capazes de alterar o imunoconteúdo de fatores relacionados com morte e sobrevivência celular, tais como caspase 3, LC3 A/B, PARP e Hsp70, assim como o ciclo celular. Portanto, nossos resultados demonstram que a via da PI3K/Akt parece estar preferencialmente relacionada com a proliferação celular, enquanto a via do NFkappaB preferencialmente com sobrevivência. / The identification of new therapeutic targets for treatment of glioblastoma multiforme (GBMs) is necessary due to poor prognosis and ineffective therapies associated with these tumors. In this study we have assessed the role of Nuclear Factor-kappaB (NFkappaB) and the PI3K/Akt pathway in glioblastomas in vitro growth, and their inhibitors as potential antitumor agents. For this we used the pharmacological inhibitors of NFkappaB (Parthenolide), and PI3K/Akt (LY294002 and quercetin), and mixed inhibitor of NFkB / Akt (curcumin). NFkappaB inhibitors yielded a significant decrease in viability of GBMs compared to inhibitors of other signaling pathways (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr and JNK1 / 2), which was dose-dependent. Furthermore, inhibitors of NFkappaB showed LDH releasing in culture medium and membrane integrity losing, evaluated through the Propidium Iodide (PI)-based method. The PI3K/Akt inhibitors showed a smaller effect than NFkappaB inhibitors, also decreasing GBMs viability but playing no dose-dependence response. Despite there was not LDH releasing in culture medium and PI incorporation, showing that the loss of viability observed in cells treated with inhibitors of PI3K/Akt is associated with a decrease in the proliferation, unlike what happens with inhibitors of NFkappaB, no cell death was observed. We have also seen that the inhibitors were able to alter the contents of immune-related factors death and cell survival, such as caspase-3, LC3 A / B, PARP and Hsp70, as well as the cell cycle. Therefore, our results demonstrate that the PI3K/Akt pathway seems to be related to cell proliferation, while the NFkappaB pathway to survival.

A vitamina A e seus derivados, os retinóides, participam de processos celulares tais como desenvolvimento, proliferação, diferenciação e apoptose. Os efeitos da vitamina A, em sua maior parte, são atribuídos à ativação de receptores nucleares da família dos receptores esteróides, conhecidos como receptores de ácido retinóico (RAR) e receptores de retinóides (RXR). No entanto, o excesso de vitamina A, ou de retinóides, na dieta, ou devido a uso terapêutico, pode ser teratogênico. Diversos trabalhos tem demonstrado "in vitro" e "in vivo" que a vitamina A e seus metabólitos são moléculas redox ativas, isto é, podem agir como pró-oxidantes ou antioxidantes, dependendo da concentração e do ambiente em que se encontram. Nesse trabalho nós demonstramos que o tratamento com retinol, o qual é considerado o principal metabólito da vitamina A, em células da linhagem A549, a qual é derivada de um carcinoma de pulmão de não-pequenas células, levou a uma diminuição da expressão e do imunoconteúdo do receptor para produtos finais avançados de glicação (RAGE). O RAGE é constutivamente expresso nas células pulmonares, sendo que qualquer alteração na sua expressão ou imunoconteúdo induz alterações na homeostase do tecido pulmonar. Nós verificamos que a modulação do RAGE induzida pelo tratamento com retinol em nosso modelo foi redox dependente. O tratamento das células A549 com retinol induziu um aumento na produção de espécies reativas do oxigênio, o qual por consequência tornou o ambiente celular próoxidativo favorecendo a indução de danos a biomoléculas como lipídeos e proteínas. Além disso, o aumento na produção de espécies reativas do oxigênio levou a ativação da MAPK p38, por um mecanismo redox-dependente. A ativação da p38 subsequentemente levou à ativação do fator de transcrição NF-kB, o qual por consequência acabou por modular a expressão e imunoconteúdo do RAGE nessas células. Todos os efeitos ocasionados pelo tratamento com retinol foram bloqueados com o co-tratamento com Trolox® (análogo hidrofílico da vitamina E), o qual é uma molécula antioxidante. Portanto, nossos resultados demonstraram que o tratamento com retinol é capaz de induzir um estado pró-oxidativo nas células A549, o qual por consequência acaba por modular a expressão do RAGE de maneira redox-dependente e via a ativação da rota de sinalização da p38 - NF-kB. Então, a partir destes resultados e de outros dados já reportados na literatura, acreditamos que é necessário uma maior cautela no uso de vitamina A tanto a nível de suplementação quanto a nível terapêutico. / Vitamin A and its derivatives, the retinoids, participate in cellular processes such as growth, cell division and apoptosis. The effects of vitamin A, in part, are ascribed to gene transcription mediated by nuclear receptors from the family of the steroid receptors, known as retinoic acid receptors (RARs) and retinoid receptors (RXRs). However, excessive vitamin A, or retinoids, in the diet, or by therapeutic use, may be theratogenic. Several studies have shown "in vitro" and "in vivo" that vitamin A and its metabolites are redox active molecules, that is, may act as pro-oxidants and antioxidants, depending on the concentration and the environment in which they are. In this study we demonstrated that treatment with retinol, which is considered to be the principal metabolite of vitamin A, in cell lines of non-small cells lung carcinoma A549 led to a decrease in the expression and immunocontent of receptor for advanced glycation endproducts (RAGE). The RAGE is constitutively expressed in lung cells; a modulation in expression or immunocontent of RAGE is associated with alterations on homeostasis of lung tissue. Here, we found that the modulation of RAGE induced by retinol treatment in our model was redox dependent. Retinol treatment of A549 cells induced an increase in the production of reactive oxygen species, which consequently become the pro-cellular environment favoring the induction of oxidative damage to biomolecules such as lipids and proteins. Furthermore, the increase in production of reactive oxygen species led to activation of p38 MAPK by a redox-dependent mechanism. Activation of p38 subsequently led to activation of the transcription factor NF-kB, which consequently modulates the expression of RAGE in these cells. All effects caused by retinol treatment were blocked with Trolox ® (hydrophilic analogue of Vitamin E) co-treatment, which is an antioxidant molecule. Therefore, our results demonstrated that retinol treatment is able to induce a pro-oxidative status in A549 cells, and that modulation of RAGE expression by retinol is mediated by the redox-dependent activation of p38/NF-kB signaling pathway. Then, based on these results and other data already reported in the literature, we believe that greater care is needed in the use of vitamin A supplementation as therapeutic level.

A vasculopatia crônica do transplante constitui um dos principais obstáculos para o sucesso do transplante de órgãos a longo prazo. Caracteriza-se pela formação de uma camada neoíntima, que culmina no estreitamento da luz do vaso com consequente isquemia e falência do órgão transplantado. Embora diversos mecanismos imunológicos tenham sido descritos, a patogênese da vasculopatia crônica do transplante ainda não foi esclarecida e continua sem tratamento específico. Neste contexto, estratégias com alvos imunomodulatórios são de extrema importância. Dentre estas possíveis estratégias destaca-se a talidomida, uma droga que apresentada potentes propriedades anti-inflamatórias e imunomodulatórias e que recentemente voltou a ter indicações clínicas. Assim, os objetivos do presente estudo foram: 1) Padronizar o modelo experimental de vasculopatia crônica do transplante no modelo experimental de transplante de aorta, pois este modelo mimetiza as principais características observadas na parede do vaso durante o processo de rejeição; 2) Analisar o efeito da talidomida sobre as alterações morfológicas vasculares (histologia para Verhoeff), componentes celulares (expressão de a-actina, atividade proliferativa, número de macrófagos e linfócitos T, através de imuno-histoquímica), além da participação da apoptose (técnica de TUNEL); 3) Avaliar o potencial efeito anti-inflamatório e imunomodulador da talidomida neste modelo, através da análise da expressão de mediadores da resposta imune (TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, IL-4 e IL-10), bem como a atividade do NFkB e o envolvimento das subunidades p50 e p65 no enxerto vascular. Foram utilizados ratos machos das linhagens isogênicas específicas, Fisher 344 e Lewis, distribuídos em 3 diferentes grupos (32 por grupo): ISO (transplante isogênico de aorta, Fisher para Fisher); ALO (transplante alogênico de aorta, Fisher para Lewis); ALO+TALID (transplante alogênico de aorta tratado com talidomida (200mg/Kg/dia/gavagem)). Os animais foram acompanhados por um período de 30 dias e, em seguida, sacrificados. Os resultados obtidos demonstraram que a padronização do modelo experimental de transplante de aorta foi viabilizada dentro de uma sequência metodológica extremamente precisa e reprodutível. Como esperado, os animais do grupo ISO não apresentaram sinais de rejeição no enxerto vascular, mantendo íntegra a arquitetura das camadas do vaso. Por outro lado, animais do grupo ALO desenvolveram vasculopatia crônica do transplante caracterizada pelo espessamento das camadas íntima e adventícia. Na camada média evidenciou-se diminuição das VSMC e acentuado rompimento das fibras elásticas. Além disso, os animais do grupo ALO apresentaram aumento da expressão de a-actina acompanhada de intensa atividade proliferativa celular, particularmente nas camadas neoíntima e adventícia, provavelmente pela migração das VSMC para a camada íntima. A análise por IH revelou intenso infiltrado de macrófagos, linfócitos T, além de apoptose presente em todas as camadas do aloenxerto. A expressão gênica e a concentração tecidual dos mediadores da resposta imune TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g e IL-10 também foram significativamente aumentadas no grupo ALO. Esses achados associaram-se com a ativação do NFkB, bem como o envolvimento dos dímeros p50 e p65. O tratamento com talidomida promoveu um efeito vasculoprotetor através da redução da camada neoíntima e da inflamação local. Além disso, induziu diminuição da expressão gênica e da concentração tecidual dos mediadores TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, bem como aumento da IL-4 e IL-10. A talidomida também diminuiu a ativação do NFkB. Conclusão: os resultados do presente estudo indicam que o modelo experimental de vasculopatia crônica do transplante constitui um modelo adequado para estudar as alterações nas camadas do vaso durante o processo de rejeição ao aloenxerto. A talidomida exerceu um efeito vasculoprotetor, atenuando a formação da neoíntima e do processo inflamatório local, bem como dos mediadores da resposta imune, provavelmente devido as suas propriedades anti-inflamatórias e imunomodulatórias / Chronic transplant vasculopathy is a major obstacle for the long-term success of organ transplantation. It is characterized by the formation of neointimal layer that culminate in the narrowing of the vessel lumen with consequent ischemia and failure of the transplanted organ. Although several immunological mechanisms have been described, the pathogenesis of chronic transplant vasculopathy remains unclear and continues without specific treatment. In this context, immunomodulatory strategies are extremely important. Among these possible strategies stands out thalidomide, a drug that display a potent antiinflammatory and immunomodulatory properties and recently have returned to clinical indications. The aims of this study were: 1) To standardize the experimental model of chronic transplant vasculopathy, induced in an experimental model of aortic transplantation, because this model mimics the key features observed in the vessel wall during the rejection process; 2) To analyze the effects of thalidomide on vascular morphological (Verhoeff staining), cellular components (a-actin expression, proliferative activity, number of macrophages and T lymphocytes by immunohistochemistry), and the participation of apoptosis (TUNEL assay); 3) To evaluate the antiinflammatory and immunomodulatory potential effects of thalidomide in this model by analyzing the mediator expression of the immune response (TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, IL-4 e IL-10), as well as the NFkB activity and involvement of p50 and p65 subunits in the vascular graft. We used male rats from the specific inbred strains, Fisher 344 and Lewis, divided into 3 different groups (32 per group). ISO (isogeneic aortic transplantation, Fisher to Fisher); ALO (allogeneic aortic transplantation, Fisher to Lewis); ALO+THALID (allogeneic aortic transplantation treated with thalidomide (200mg/Kg/day/gavage)). The animals were followed during a period of 30 days and then sacrificed. The results showed that the standardizing of the experimental model of aortic transplantation was possible within a sequence highly accurate and reproducible methodology. As expected, the animals of the ISO showed no sign of graft rejection keeping the entire layered architecture of the vessel. On the other hand, the ALO group developed chronic transplant vasculopathy characterized by thickness of the intima and adventitia. Furthermore, ALO group animals showed increase of a-actin expression accompanied by an intense cellular proliferative activity, particularly in the neointima and adventitia layers, probably due to VSMC migration to the intima. Analysis by IH revealed intense infiltration of macrophages and T lymphocytes, as well as apoptosis in all layers of the allograft. The gene expression and tissue concentrations of the mediators of immune response TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, and IL-10 were also significantly higher in the ALO group. These findings were associated with the NFkB activation, as well as the involvement of p50 and p65 dimers. Treatment with thalidomide promoted a vascular protective effect by reducing the neointimal formation and local inflammation. Moreover, induced a decrease in the gene expression and tissue concentration of the inflammatory mediators TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, as well as increase of IL-4 and IL-10. Thalidomide also decreased the NFkB activation. Conclusion: the results of this study indicate that experimental model of chronic transplant vasculopathy is an appropriate model to study changes in the vessel layers during the process of allograft rejection. Thalidomide promoted a vascular protective effect, attenuating neointimal formation and local inflammation, as well as mediators of immune response, probably due to its anti-inflammatory and immunomodulatory properties

Recent evidence from cancer research indicates that lactate exerts a suppressive effect on innate immune responses in cancer. This study investigated the mechanisms by which lactate suppresses macrophage pro-inflammatory responses. Macrophages [Raw 264.7 and bone marrow derived macrophages (BMDMs)] were treated with LPS in the presence or absence of lactate. Pro-inflammatory cytokines, NF-κB and YAP activation and nuclear translocation were examined. Our results show that lactate significantly attenuates LPS stimulated macrophage TNF-α and IL-6 production. Lactate also suppresses LPS stimulated macrophage NF-κB and YAP activation and nuclear translocation in macrophages. Interestingly, YAP activation and nuclear translocation are required for LPS stimulated macrophage NF-κB activation and TNFα production. Importantly, lactate suppressed YAP activation and nuclear translocation is mediated by GPR81 dependent AMKP and LATS activation which phosphorylates YAP, resulting in YAP inactivation. Finally, we demonstrated that LPS stimulation induces an interaction between YAP and NF-κB subunit p65, while lactate decreases the interaction of YAP and NF-κB, thus suppressing LPS induced pro-inflammatory cytokine production. Our study demonstrates that lactate exerts a previously unknown role in the suppression of macrophage pro-inflammatory cytokine production via GPR81 mediated YAP inactivation, resulting in disruption of YAP and NF-κB interaction and nuclear translocation in macrophages.

Sodium methyldithiocarbamate (SMD) is commonly reported to cause health risks in humans. Previous reports indicate SMD causes oxidative stress, which can contribute to the activation of NF-êB and cause other characteristics of inflammatory responses to be altered. Almost all pro-inflammatory cytokines require NF-êB activation for full expression and development of an innate immune or inflammatory response. This study evaluated NF-êB activation, providing new information regarding reactive oxygen in macrophages from SMD-treated mice. Studies were conducted in which NF-êB reporter mice were treated with lipopolysaccharide (LPS), SMD, buthionine sulfoximine (BSO), and N-acetyl cysteine (NAC). BSO depletes glutathione (GSH) and increases oxidative stress, whereas NAC spares GSH by acting as a precursor for rapid synthesis to replace oxidized GSH. The work here indicates that NF-êB is not affected directly by increased or decreased reactive oxygen species (ROS), and oxidative stress is not the major mechanism by which SMD inhibits inflammatory responses.

No description available.

No description available.