Angeborene lymphoide Zellen (ILCs) sind sich im Gewebe befindliche Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase spielen. ILCs wurden in verschiedenen Organen untersucht. Ob ILCs im zentralen Nervensystem (ZNS) vorhanden sind und wenn ja, welchen ​​Phänotyp und welche funktionellen Eigenschaften sie in diesem Organ aufweisen, sind Fragen, die bisher unbeantwortet blieben. NK-Zellen sind die seit langem bekannten ILC-Mitglieder, die viele Merkmale mit ILC1s teilen. Im Zusammenhang mit der Autoimmunität wurde gezeigt, dass NK-Zellen eine immunmodulatorische Rollen spielen. Anhand des Tiermodells von Multiple Sklerose, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis, zeigte unsere Gruppe, dass reife NK-Zellen auf CX3CR1-abhängige Weise in das ZNS rekrutiert werden. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen will ich in meinem PhD Projekt die Chemokinrezeptoren definieren, die die Rekrutierung der unreifen NK-Zellen in das entzündete ZNS vermitteln. Des Weiteren will ich herausfinden, ob die phänotypisch definierten NK-Zellen (CD3-NK1.1 + -Zellen) die im gesunden ZNS vorhanden sind, echte NK-Zellen sind, oder sie zu den ILC1s gezählt werden können. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die im gesunden ZNS vorhandenen CD3-NK1.1+ -Zellen verschiedene Typ-1-ILC-Subsets umfassen: NK-Zellen, ILC1s, Intermediat-ILC1s und Ex-ILC3s. CXCR3 wurde auf ILC1s und einer Fraktion von unreifen NK-Zellen exprimiert, trug jedoch nicht zur Rekrutierung von NK-Zellen in das ZNS im EAE-Modell bei. Die Expression von CD49a, CD69, CXCR6, DNAM-1high, TRAIL und CD200R und das Fehlen von Eomes unterschieden die ILC1 von den NK-Zellen im ZNS. Zusätzlich ILC1s sezernierten mehr TNF-α als NK-Zellen. ILC1s waren die dominante Typ-1-ILC Subgruppe im Plexus choroideus und im Gehirnparenchym und waren auch in den Meningen vorhanden. Zusammenfassend bietet die vorliegende Arbeit zum ersten Mal eine umfassende Charakterisierung von ILCs des Typs I im ZNS. / Innate lymphoid cells (ILCs) are tissue resident cells that play important roles in the maintenance of tissue homeostasis. ILCs have been characterized in diverse organs like the gut and liver. However, whether ILCs are present in the central nervous system (CNS) and if so, what are their phenotype and function in this organ are questions that remain unanswered. NK cells are the longer-known ILC members that share many phenotypical and functional features with ILC1s. Using the animal model of MS, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), our group showed that protective mature NK cells are recruited to the CNS on an CX3CR1-dependent manner. Based on that observations, my PhD project aimed to 1) define the chemokine receptors that mediate the recruitment of the immature NK cells into the inflamed CNS and to 2) determine whether the phenotypically defined NK cells (CD3-NK1.1+ cells) that are present in the CNS during steady state constitute bona fide NK cells or constitute also other group 1 ILC subsets. The results of this work indicate that the CD3-NK1.1+ cells present in the healthy CNS comprise diverse group 1 ILC subsets that include conventional NK cells, ILC1s, intermediate-ILC1s and ex-ILC3s. CXCR3 was expressed on ILC1s and a fraction of immature NK cells, but did not contributed to the recruitment of NK cells into the CNS in the EAE model. In addition, the phenotypic and functional characterization of the newly identified CNS-ILC1s is described. The exclusive expression of CD49a, CD69, CXCR6, DNAM-1high, TRAIL and CD200R, and lack of Eomes distinguished the ILC1s from the NK cells in the CNS. IILC1s secreted IFN-γ and more TNF-α than NK cells upon stimulation in the healthy and EAE mice and were the dominant group 1 ILC subset in the choroid plexus and brain parenchyma and were also present in the meninges. In sum, the present work provides for the first time a comprehensive characterization of group 1 ILCs in the CNS.

In biology, it is common to study cultured cells (in vitro) with fluorescence time-lapse microscopy. The cells are recorded for longer period of time and can later be viewed at an accelerated speed. During the acquisition some live cells tend to migrate. This can be a problem if the cell’s migration speed is high enough to move outside the field of view (FOV) during the acquisition time. The cells that moves outside the FOV can no longer be recorded and the information about them will be lost. This thesis presents scripts that have been developed for ZEN (blue) to be able to track a specific migrating cell of interest in real-time with automated control of imaging parameters. The microscope stage position is modified on-the-fly to have the tracked cell in the center of the FOV for the whole experiment. Three different types of experiments to track migrating NK cells were performed with the scripts. The results show that the scripts were able to track one NK cell for more than 1 hour in both conventional wide-field and lattice light-sheet microscopy. The segmentation was inaccurate when one or more objects were in close proximity to the tracked cell. By applying a watershed algorithm the segmentation result can be improved in some cases. / Inom cellulär biologi är det vanligt att studera odlade celler (in vitro) med time- lapse-mikroskopi. Flertals bilder tas på cellerna under en längre tidsperiod och när experimentet är klart så kan man titta på bilderna som en video. Under förvärvet av bilderna så tenderar vissa levande celler att migrera. Ett problem som kan uppstå är om cellens migrationshastighet är tillräckligt hög för att röra sig utanför synfältet under anskaffningstiden. De celler som rör sig utanför synfältet kan inte längre avbildas och informationen om dem kommer att gå förlorad. I denna avhandling presenteras programmeringskoder som har utvecklats för ZEN (blue) som kan spåra en specifik migrerande cell i realtid med automatiserad kontroll av bildbehandlings parametrar. Mikroskopets scenposition modifieras under experimentets gång för att få den spårade cellen kontinuerligt i mitten av synfältet. Tre olika sorters experiment i kombination med programmeringskoderna utfördes för att spåra NK-celler. Resultaten visar att programmeringskoderna lyckades spåra en NK-cell i mer än 1 timme i både ett bredfältsfluorescensmikroskop och ett lattice light-sheet mikroskop. Segmenteringen var felaktig när ett eller flera objekt var i närheten av den spårade cellen. Genom att tillämpa en watershed algoritm kan segmenteringsresultatet förbättras i vissa fall.

Charles University in Prague Faculty of Natural Sciences Summary of Ph.D. thesis The role of LIF gene mutations and the relative distribution of NK cells, NKT and T lymphocytes in follicular fluid and blood of women with different history of infertility Jiří Křížan Prague 2010 1 | P a g e Doctoral degree programs in biomedicine Charles University in Prague and the Academy of Sciences of the Czech Republic Programme: Biomedicine Chairman of the Subject Board: Doc. RNDr. Vladimír Holáň, Dr.Sc. Place of study: Institute of Microbiology, v.v.i., Academy of the Czech Sciences Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4 phone: +420 296 442 318 Autor: Mgr. Jiří Křížan Supervisor: RNDr. Petr Šíma, CSc. The dissertation can be found at Dean's Office Faculty of Charles University in Prague 2 | P a g e CONTENTS Contents 2 Summary 3 1. Introduction 5 2. Hypotheses and aims 6 3. Material and methods 7 Material: 7 Methods: 8 4. Results 10 5. Discussion 12 6. Conclusion 15 7. References 16 Bibliography of Autor: 18 1. papers in extenso (thesis background) 18 2. papers in extenso (without regard to thesis) 19 3 | P a g e SUMMARY The aim of the dissertation thesis "The role of LIF gene mutations and the relative distribution of NK cells, NKT, and T lymphocytes in follicular fluid and blood of women with different history of infertility"...

5 Abstract Interleukin-2 possesses strong stimulatory activity for activated T and NK cells and thus it is an attractive molecule for immunotherapy. However, its unfavourable pharmacological properties, extremely short half-life and severe toxicities associated with high-dose IL-2 are the most serious and limiting drawbacks. Moreover, IL-2 has been also implicated in the homeostasis of T regulatory cells where it plays a decisive role as an essential growth factor of these cells. Several different approaches to improve the therapeutic potential of IL-2 have been studied. Recently described IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes which show much higher and selective biological activity in contrast with free IL-2 in vivo are probably the most promising of them. In this study, we compared the biological activity of free IL-2 with IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes in order to demonstrate their benefits over free IL-2. We also demonstrated that IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes possess noticeable antitumor activity in two syngeneic mouse tumor models, namely EL4 T lymphoma and B16F10 melanoma, if administered early in tumor progression. Therefore, we justified potential use of IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes in tumor immunotherapy. We covalently conjugated IL-2 to synthetic semitelechelic polymeric carrier based...

Nierenzellkarzinome (NZKs) gelten als stark immunogene Tumore. Dies ist insbesondere auf die Infiltration durch verschiedene Immunzellpopulationen, wie T-Lymphozyten und Natürliche Killer (NK)-Zellen, sowie das klinische Ansprechen auf immuntherapeutische Strategien zurückzuführen. Bisher existieren jedoch nur sehr wenige Studien zur Rolle von humanen nativen dendritischen Zellen (DCs) in NZK-Geweben und über die Tumor-vermittelte Modulation dieser DCs. DCs nehmen als professionelle Antigen-präsentierende Zellen eine zentrale Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der angeborenen sowie adaptiven Immunantwort ein. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der Effekt von klarzelligen NZKs auf den Phänotyp sowie die immunmodulatorischen Fähigkeiten von 6-sulfo LacNAc+ (slan)DCs evaluiert. SlanDCs, welche eine große Subpopulation humaner Blut-DCs darstellen, sind neben der Sekretion großer Mengen proinflammatorischer Zytokine dazu befähigt, Tumorzellen direkt zu lysieren. Des Weiteren sind slanDCs in der Lage, die antitumoralen Effekte von NK-Zellen zu fördern und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie Tumor-reaktive CD8+ T-Lymphozyten effizient zu stimulieren. Angesichts dieser proinflammatorischen Eigenschaften können slanDCs wesentlich an einer Tumor-gerichteten Immunantwort beteiligt sein. Auf dieser Grundlage erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der immunhistochemische Nachweis von slanDCs in klarzelligen NZK-Geweben. Im Vergleich zu Tumor-freiem Nierengewebe trat in den primären Tumorgeweben eine erhöhte Zahl infiltrierender slanDCs auf. Zudem wurde die Präsenz von slanDCs in Lymphknoten- sowie Fernmetastasen von NZK-Patienten beobachtet. Weiterführende Untersuchungen an frischen klarzelligen NZK-Geweben demonstrierten, dass NZK-infiltrierende slanDCs einen unreifen Phänotyp ausprägen und Interleukin-10 produzieren. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten funktionelle Analysen, bei denen der Einfluss der kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären klarzelligen NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf bedeutende immunmodulatorische Fähigkeiten von slanDCs untersucht wurde. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass NZK-Zellen effektiv in der Lage sind, sowohl die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, als auch die slanDC-induzierte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in proinflammatorische T-Helfer 1-Zellen zu inhibieren. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass NZK-Zellen das Potenzial von slanDCs zur Aktivierung von NK-Zellen hemmen. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten, dass die funktionelle Inhibition von slanDCs durch klarzellige NZK-Zellen über membranständige Moleküle vermittelt wird. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse weisen darauf hin, dass NZKs die Ausreifung sowie wesentliche funktionelle Eigenschaften von DCs inhibieren. Dies deutet auf einen neuen Immunescape-Mechanismus klarzelliger NZKs hin, welcher auf einer Tumorzell-vermittelten Generierung von tolerogenen slanDCs basiert und eine unzureichende Aktivierung der angeborenen sowie adaptiven Tumor-gerichteten Immunantwort zur Folge hat. Diese neuen Erkenntnisse können einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Interaktion von NZKs mit nativen humanen DCs leisten und die Konzeption neuer therapeutischer Strategien ermöglichen, welche auf einer Verstärkung der antitumoralen Eigenschaften von DCs beruhen.

La majorité des individus exposés au virus de l’hépatite C (VHC) développent une infection chronique. Une réponse immunitaire adaptative forte et soutenue est associée avec la guérison spontanée du VHC, mais les mécanismes sous-jacents demeurent mal définis. Le rôle des cellules NK et des cellules dendritiques (DC) dans la guérison spontanée du VHC est encore méconnu. Les cellules NK sont la population effectrice la plus importante de l’immunité innée car elles tuent les cellules infectées et sécrètent diverses cytokines. Les DC reconnaissent des agents infectieux et elles sont les premières à initier et réguler l’immunité adaptative. Les cellules NK et les DC interagissent également entre elles afin de réguler l’immunité innée et adaptative. L’hypothèse du projet de doctorat est que l'activité des cellules NK pendant la phase aiguë de l'infection par le VHC module la fonction des DC afin que ces dernières puissent générer une réponse immunitaire adaptative capable d'éliminer le VHC. Le premier objectif était d’établir une corrélation entre l'activité des cellules NK et l'évolution de l'infection au VHC. Nous avons observé une augmentation de la cytotoxicité, mais une diminution de la sécrétion de cytokines par les cellules NK chez les patients chroniques et qui ont résolu spontanément pendant la phase aiguë en comparaison aux contrôles non infectés, démontrant alors une dissociation entre ces deux fonctions. Nos résultats suggèrent que les cellules NK sont activées pendant la phase aiguë indépendamment de l’évolution de l’infection. Le deuxième objectif était d’établir une corrélation entre le phénotype et la fonction des DC, et l'évolution de l'infection. Nous avons d’abord observé que les DC plasmacytoïdes de tous les patients infectés ont un phénotype plus immature que les contrôles, et que ce phénotype est plus prononcé chez les patients ayant résolu spontanément. De plus, en réponse à des stimulations, nous avons observé que pendant la phase aiguë précoce, les DC myéloïdes (mDC) de tous les patients infectés indépendamment de l’évolution de l’infection produisent davantage de cytokines en comparaison aux contrôles. Cependant, cette hyperréactivité n’est pas soutenue au cours de l’évolution chronique. Le troisième objectif était d’établir une corrélation entre les interactions NK/DC et l’évolution de l’infection. Nous avons étudié la capacité des cellules NK à lyser les DC potentiellement tolérogéniques, ainsi que la capacité des DC matures à activer les cellules NK, et nous avons observé aucune différence entre les patients infectés et les contrôles. Finalement, nous avons démontré pour la première fois la capacité des DC immatures à inhiber la fonction des cellules NK. En conclusion, nous avons démontré que les cellules NK sont activées pendant la phase aiguë de l’infection par le VHC indépendamment de l’évolution de l’infection. De plus, la capacité des cellules NK à éliminer les DC potentiellement tolérogéniques est intacte. Finalement, les mDC sont hyperréactives pendant la phase aiguë de l’infection, mais cette hyperréactivité n’est pas soutenue avec la persistance de l’infection. Cette perte d’hyperréactivité des mDC ne semble pas affecter la capacité des DC à activer les cellules NK, mais elle pourrait jouer un rôle dans l’inefficacité de l’immunité adaptative à éliminer le VHC. / The majority of individuals exposed to the hepatitis C virus (HCV) develop a chronic infection. It is known that a strong and sustained adaptive immune response is associated with the spontaneous clearance of HCV, however the underlying mechanisms are not well defined. The role of natural killer (NK) cells and dendritic cells (DCs) during the spontaneous resolution of HCV remains unknown. NK cells are the primary effector population of the innate immune response which are able to kill infected cells and secrete various cytokines. On the other hand, DCs are the first cell type to initiate and regulate adaptive immunity after recognizing infectious pathogens. NK cells and DCs can also interact reciprocally to further regulate innate and adaptive immunity. Our hypothesis is that NK cell activity during acute HCV will modulate DC function to prime a highly efficient adaptive immune response resulting in viral clearance. The first aim of my project was to establish a correlation between NK cell activity and the outcome of HCV infection. We observed increased NK cell cytotoxicity, but decreased cytokine secretion during acute HCV in patients with chronic evolution as well as spontaneous resolution, further demonstrating a dissociation between these two NK cell functions. Our results suggest that NK cells are activated during acute HCV infection regardless of infection outcome. The second aim was to establish a correlation between DC phenotype, function and the outcome of infection. We observed that plasmacytoid DCs (pDCs) from all HCV-infected patients have a more immature phenotype as compared to negative controls, yet this is more pronounced in spontaneous resolvers. Furthermore, we observed that during the early acute phase, myeloid DCs (mDCs) from all HCV-infected patients, regardless of outcome, have increased production of cytokines as compared to un-infected controls in response to stimulation. However, this hyperresponsiveness of mDCs is not sustained with chronic evolution. The third aim was to establish a correlation between the NK/DC cross-talk and infection outcome. We studied the capacity of NK cells to kill potentially tolerogenic DCs, as well as the capacity of mature DCs to activate NK cells, and we observed no major differences between different stages of HCV infection and un-infected controls. However, we obtained unprecedented data which suggests that immature DCs have the capacity to inhibit NK cell function. In conclusion, our results demonstrate that NK cells are activated during acute HCV infection regardless of its outcome. Furthermore, the capacity of NK cells to kill potentially tolerogenic DCs is intact for all groups of patients. Finally, mDCs are hyperresponsive during acute HCV, but this hyperresponsiveness is not sustained with persistence of viremia. The loss of mDC hyperresponsiveness does not seem to affect the capacity of DCs to activate NK cells, but might play a role in the capacity of DCs to prime a highly efficient adaptive immune response resulting in viral clearance.

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Nierenzellkarzinome (NZKs) gelten als stark immunogene Tumore. Dies ist insbesondere auf die Infiltration durch verschiedene Immunzellpopulationen, wie T-Lymphozyten und Natürliche Killer (NK)-Zellen, sowie das klinische Ansprechen auf immuntherapeutische Strategien zurückzuführen. Bisher existieren jedoch nur sehr wenige Studien zur Rolle von humanen nativen dendritischen Zellen (DCs) in NZK-Geweben und über die Tumor-vermittelte Modulation dieser DCs. DCs nehmen als professionelle Antigen-präsentierende Zellen eine zentrale Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der angeborenen sowie adaptiven Immunantwort ein. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der Effekt von klarzelligen NZKs auf den Phänotyp sowie die immunmodulatorischen Fähigkeiten von 6-sulfo LacNAc+ (slan)DCs evaluiert. SlanDCs, welche eine große Subpopulation humaner Blut-DCs darstellen, sind neben der Sekretion großer Mengen proinflammatorischer Zytokine dazu befähigt, Tumorzellen direkt zu lysieren. Des Weiteren sind slanDCs in der Lage, die antitumoralen Effekte von NK-Zellen zu fördern und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie Tumor-reaktive CD8+ T-Lymphozyten effizient zu stimulieren. Angesichts dieser proinflammatorischen Eigenschaften können slanDCs wesentlich an einer Tumor-gerichteten Immunantwort beteiligt sein. Auf dieser Grundlage erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der immunhistochemische Nachweis von slanDCs in klarzelligen NZK-Geweben. Im Vergleich zu Tumor-freiem Nierengewebe trat in den primären Tumorgeweben eine erhöhte Zahl infiltrierender slanDCs auf. Zudem wurde die Präsenz von slanDCs in Lymphknoten- sowie Fernmetastasen von NZK-Patienten beobachtet. Weiterführende Untersuchungen an frischen klarzelligen NZK-Geweben demonstrierten, dass NZK-infiltrierende slanDCs einen unreifen Phänotyp ausprägen und Interleukin-10 produzieren. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten funktionelle Analysen, bei denen der Einfluss der kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären klarzelligen NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf bedeutende immunmodulatorische Fähigkeiten von slanDCs untersucht wurde. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass NZK-Zellen effektiv in der Lage sind, sowohl die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, als auch die slanDC-induzierte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in proinflammatorische T-Helfer 1-Zellen zu inhibieren. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass NZK-Zellen das Potenzial von slanDCs zur Aktivierung von NK-Zellen hemmen. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten, dass die funktionelle Inhibition von slanDCs durch klarzellige NZK-Zellen über membranständige Moleküle vermittelt wird. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse weisen darauf hin, dass NZKs die Ausreifung sowie wesentliche funktionelle Eigenschaften von DCs inhibieren. Dies deutet auf einen neuen Immunescape-Mechanismus klarzelliger NZKs hin, welcher auf einer Tumorzell-vermittelten Generierung von tolerogenen slanDCs basiert und eine unzureichende Aktivierung der angeborenen sowie adaptiven Tumor-gerichteten Immunantwort zur Folge hat. Diese neuen Erkenntnisse können einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Interaktion von NZKs mit nativen humanen DCs leisten und die Konzeption neuer therapeutischer Strategien ermöglichen, welche auf einer Verstärkung der antitumoralen Eigenschaften von DCs beruhen.