This study examines the role of innate and adaptive immunity in the immunotherapy based on the combination of the ligands stimulating phagocytosis anchored in the tumour cells membrane and the mixture of TLR agonists. This immunotherapy is primarily focused on the innate immunity activation and induces strong inflammatory infiltration, which neutrophils and NK cells are part of. Therefore, the next aim of this study was to evaluate the anti-tumour activity of neutrophils and NK cells. For examination malignant melanoma and pancreatic adenocarcinoma mouse tumour models were used.

Dans la première partie de cette thèse, nous avons cherché à déterminer le rôle de l’éosinophile circulant dans l’asthme par une approche transcriptomique. Nos résultats suggèrent que l’éosinophile recruté sur un site inflammatoire présente des fonctions immunomodulatrices, importantes dans la réparation tissulaire et le retour à l’homéostasie. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons étudié le rôle des cellules NK et des cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2) dans l’inflammation asthmatique. Les cellules NK circulantes sont fortement activées dans l’asthme sévère et ont la capacité d’induire l’apoptose d’éosinophiles autologues in vitro. La PGD2 induit la production d’IL-13 par les ILC2 en synergie avec les cytokines épithéliales IL-25 et IL-33. Enfin, ces fonctions sont régulées par la LXA4. En conclusion, notre travail de thèse met en lumière de nouveaux rôles pour l’éosinophile et les cellules lymphoïdes innées dans l’immunopathologie de l’asthme. / In the first part of the thesis, we adopted a transcriptomic-based approach to investigate the activation state of circulating eosinophils in patients with asthma and other unrelated hypereosinophilic diseases. Taken together, our results, which suggest that esoinophils, recruited to inflammatory sites exhibit non-specific immunomodulatory functions important for tissue repair and homeostasis. In the second part of the thesis, we investigated the role of NK cells and type 2 innate lymphoid cells (ILC2) in asthma inflammation. Circulating NK cells are highly activated in severe asthma and promote apoptosis of autologous eosinophils in vitro. ILC2 generate interleukin-13 in response to prostaglandin D2 alone and in a synergistic manner with the airway epithelial cytokines IL-25 and IL-33. Finally, these functions are regulated by lipoxine A4. In conclusion, this thesis highlights new roles for eosinophils and innate lymphoid cells in asthma immunopathology.

Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée et constituent de véritables sentinelles dans l’immuno-surveillance contre les virus et les processus tumoraux. Pour échapper à la reconnaissance NK, les virus ainsi que les cellules tumorales utilisent de nombreux subterfuges. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à deux facteurs régulateurs de la fonction des cellules NK, la molécule PD-1 et la prostaglandine E2 (PGE2). Programmed death 1 (PD-1) est une molécule régulatrice exprimée sur les lymphocytes T et B activés. L’engagement de PD-1 par ses ligands inhibe leurs fonctions effectrices et prolifératives. Au cours de certaines infections virales chroniques ou de tumeurs, l’expression de PD-1 est associée à l'épuisement fonctionnel des lymphocytes T effecteurs. Le blocage de l’axe PD-1/PD-1 ligands restaure les fonctions effectrices des lymphocytes et représente ainsi une approche thérapeutique prometteuse. Nous avons mis en évidence de manière fortuite une expression inhabituelle du récepteur PD-1 sur les cellules NK au cours de certaines infections virales chroniques (HHV8, VIH ou VHC). L’expression de PD-1 sur les cellules NK caractérise une population récemment activée (CD69++, CD25 + et Nkp44 +), susceptible à l’apoptose (Annexin V+), exprimant une moindre quantité du récepteur de cytotoxicité naturelle NKp46. L’analyse fonctionnelle montre que les cellules NK PD-1+ ont des capacités de cytotoxicité (dégranulation CD107a) et de production de cytokines (IFNγ) réduites en comparaison avec leurs homologues PD-1-. De façon intéressante, l’IL-2 et l’IL-15 peuvent restaurer les fonctions effectrices des cellules NK PD-1+. Contrairement aux cellules T dont l’expression de PD-1 est induite par divers stimuli, seule la stimulation des récepteurs NKp46 et NKp30, en synergie avec l’action de l’IL-15 ou l’IL-2, induit in vitro de façon reproductible l’expression de PD-1 sur les cellules NK de témoins sains. Pour pouvoir disposer d’un modèle in vitro de cellules NK PD-1+, nous avons généré des cellules exprimant PD-1 de manière stable par transduction lentivirale de la lignée NKL. En comparaison avec les cellules transduites par le vecteur vide, les cellules NKL PD-1+ ont des capacités cytotoxiques réduites, confirmant nos résultats chez les patients. Nous avons aussi étudié les mécanismes par lesquels la PGE2, une autre molécule immuno-modularice, régule les fonctions des cellules NK. Nos résultats suggèrent que la PGE2 agit à travers ses récepteurs EP2 et EP4 pour inhiber l’expression de NKG2D et de l’IL-15Rγ induite par l’IL-15 sur les cellules NK. Ce travail doit nous permettre de mieux comprendre comment la PGE2 s’oppose aux effets activateurs de l’IL-15 sur les cellules NK, et représente un mécanisme de rétrocontrôle de l’inflammation. En conclusion, nos résultats montrent que l’expression de PD-1 sur les cellules NK représente un mécanisme supplémentaire d’échappement viral à la réponse immune. La suite de l’étude sur la PGE2 devrait nous permettre d’évaluer l’intérêt de l’utilisation d’antagonistes spécifiques dans l’immunothérapie anti-tumorale par l’IL-15. Le lien entre la PGE2 et l’expression de PD-1 sur les cellules NK est en cours d’investigation. / Natural Killer (NK) cells are effectors of the innate immune system, and play a crucial role in virus and cancer immunesurveillance. To escape NK-cell mediated elimination of infected or transformed cells, viruses and tumors have developed multiple strategies to interfere with NK-cell functions. In the present study, we investigated the role of two regulatory molecules, Programmed Death-1 (PD-1) and Prostaglandine E2 (PGE2), in controlling NK cell activation and effector functions. PD-1 is a key immune checkpoint receptor expressed by activated T and B lymphocytes. Upon interaction with its cognate ligands, PD-1 inhibits lymphocyte proliferation and functions. During cancer or chronic viral infections, PD-1 expression is associated with functional exhaustion of effector T cells. Blockade of PD-1 signaling restores T-cell functions, and represents a promising therapeutic tool. We fortuitously observed unusual expression of PD-1 on a subset of CD56dim NK cells in some patients with persistent viral infection (HHV8, HIV or HCV). We show that PD-1 expression on NK cells characterizes a subpopulation of recently activated cells (CD69+, CD25+, Nkp44+) that are sensitive to apoptosis (Annexin V+) and not senescent (CD57-). NKp46 expression was also markedly decreased on PD-1+ NK cells. In vitro functional experiments showed that PD-1+ NK cells had impaired cytotoxic capacity (CD107a degranulation) and reduced IFN-γ production compared to their PD-1- counterpart, suggesting that they might represent functionally exhausted NK cells. Interestingly, exogenous IL-2 and IL-15 could restore PD-1+ NK cell effector functions. While strong non-specific stimulation by PMA/ionomycin transiently induced PD-1 on control NK cells, only activation through NKp46 or NKp30 receptors in the presence of IL-15 could reproducibly induce stable PD-1 expression. To investigate the effect of PD-1 expression on NK cells in the absence of any confounding factor related to the underlying disease, we generated NK cells stably expressing PD-1 after lentiviral transduction. Compared to NK cells transduced with the control vector, PD-1+ cells showed a constitutively decreased CD107a degranulation, thus confirming our findings in NK cells from infected patients. In the second part of this study, we investigated the immunosuppressive role of PGE2 in the control of IL-15-mediated NK cell activation. Our results suggest that PGE2 acts through EP2 and EP4 receptors to inhibit IL-15 induced NKG2D and IL-15Rγ expression on NK cells. These findings allow a better comprehension of PGE2/IL-15 antagonism in the regulation of NK cell responses. In conclusion, our results indicate that PD-1 expression on NK cells could represent a supplementary mechanism of immune evasion strategy, and allow introducing the concept of exhausted NK cells, similar to exhausted PD-1+ T cells. Our results also demonstrate that PGE2 exerts a negative feedback on IL-15-mediated effects on NK cells. Blocking PGE2 or its receptors could be of interest in IL-15 tumor immunotherapy to potentiate IL-15-induced cytotoxic functions of NK cells.

Les cellules Natural Killer (NK) sont non, seulement de précieux effecteurs cytotoxiques de la réponse immunitaire innée dirigée contre les tumeurs et les infections, mais aussi d’importants immunorégulateurs. Leur activation dépend d’une balance complexe entre des signaux émanant de multiples récepteurs, tantôt inhibiteurs, tantôt activateurs. Parmi les récepteurs activateurs, NCR3 représente un acteur important de la lyse tumorale et de l’interaction avec les cellules dendritiques. Dans le but de caractériser la variabilité interindividuelle de la réponse NK et d’établir une référence pour des études ultérieures dans un contexte pathologique, nous avons examiné, dans un échantillon de 43 donneurs sains, les corrélations entre la variabilité fonctionnelle des cellules NK en réponse à la stimulation de leur récepteur NKp30 et le niveau d’expression des transcrits de NCR3 ainsi que celui de la protéine correspondante, au regard du polymorphisme génomique. Nous avons mis en évidence une étroite corrélation entre l’expression membranaire de NKp30 et NKp46 et la fonction cytotoxique NK, mais pas avec la sécrétion de cytokines. Nous avons retrouvé l’effet déjà connu du variant rs986475 sur l’expression de l’un des transcrits alternatifs de NCR3, T3. Nous avons également identifié un autre variant, rs11575836, influençant le niveau de transcrits T1, en relation avec la cytotoxicité induite par la signalisation NKp30. Cette étude pointe le doigt sur la spécificité des voies de signalisation des fonctions NK et le réseau complexe de gènes impliqués dans leur régulation. Nous avons par ailleurs évalué la variabilité génétique de NCR3 dans la myasthénie auto-immune où les cellules NK pourraient jouer un rôle. Le re-séquençage du gène NCR3 n’a pas révélé d’association avec un polymorphisme commun mais a permis d’identifier deux mutations rares, « faux-sens », retrouvées uniquement chez des patients myasthéniques. L’une d’elle, L19R, est non-conservative et représente un candidat particulièrement intéressant à examiner en détail du fait de sa localisation dans une région très conservée dans la phylogénie. Même si de nombreux points restent à élucider, ces résultats indiquent qu’il devrait être possible de relier de façon globale et intégrative le polymorphisme de l’ADN, ainsi que l’expression des transcrits et des protéines, à la réponse fonctionnelle des cellules NK / Natural Killer (NK) cells are not just invaluable cytotoxic effectors of innate immune response against tumors and infections but also important immunoregulators. They are activated by an intricate balance between signals provided by their inhibitory and activating receptors. Among activating receptors, NCR3 can mediate tumor lysis and dendritic cell maturation making it a crucial receptor in NK cell function. Furthermore, a recent study showed that alternative splicing of NCR3 can affect NK cell function and patient responses to treatment. In order to characterize interindividual variability of NK cell response and to set up a reference for future investigations in pathologies, we investigated 43 healthy donors and studied correlations between NK cell functional variability in response to NKp30 triggering with NKp30 transcript and membrane expression in light of genomic polymorphism. We showed a tight correlation between membrane expression of NKp30 and NKp46 with the cytotoxic NK cell response but not with cytokine secretion. In addtion, we identified a new variant influencing T1 NCR3 transcripts, rs11575836, which is associated with NKp30-induced cytotoxicity. This study pointed out the specifity of pathways underlying NK cell function and the complexity of gene networks involved in their regulation. NCR3 genetic variability was also assessed in myasthenia gravis, an autoimmune disease where NK cells seem to be implicated. NCR3 re-sequencing did not shown any association with common polymorphisms but disclosed two rare nonsense mutations that were found only in patients. One of them, L19R, a non-conservative amino acid change, is of particular interest because it is located in a highly-conserved region across phylogeny. Although numerous issues remain to be clarified, our results indicate that it should be possible to integrate information of DNA polymorphism, with that of transcript and membrane protein expression to identify functional patterns in NK cell response

L'objectif de cette thèse était de caractériser phénotypiquement et fonctionnellement les cellules NK activées par l'IL-21 et d'étudier leur interaction avec les lymphocytes T CD4*. Les lymphocytes Natural Killer (NK) sont essentiels pour la protection exercée par l'immunité innée. Les cellules NK, en plus de leurs fonctions cytotoxiques, peuvent orienter la réponse immunitaire adaptative vers un profile TH1 grâce à leur production d'IFN-y. Dans cette étude, nous avons montré que l'IL-21, une cytokine produite in vivo au cours de l'inflammation chronique ou de maladies infectieuses, induit la différenciation d'une sous-population spécifique de cellules NK co-exprimant ÇD86 et HLA-DR. Les cellules NK HLA-DR* induites par l'IL-21 sont capables d'apprêter et de présenter des antigènes aux lymphocytes T CD4*. De plus, ces cellules produisent MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor) et apportent un signal de costimulation durant le priming des lymphocytes T CD4 naïfs en induisant leur différenciation vers un profile central mémoire (Tcm) peu différencié. Les Tcm activés en présence des cellules NK HLA-DR" sont CXCR3' CCR4' CCR6' CXCR5' et produisent de PIL-2 et du TNF-a. La costimulation des lymphocytes T ÇD4 par les cellules NK HLA-DR" prévient l'acquisition d'un phénotype effecteur mémoire induit par l'IL-2. Ainsi, ces résultats montrent une nouvelle fonction pour l'IL-21 qui peut moduler l'interaction NK/CD4 et favoriser l'expansion des lymphocytes centraux mémoires. / Natural Killer lymphocytes are critical for innate immunity-mediated protection. Main roles of NK cell rely on their cytotoxic functions or depend on the tuning of TH1 adaptive immunity by IFN-y. Here, we provide evidence that 1L-21, a cytokine produced in vivo during chronic inflammation or infectious diseases, promotes the differentiation of a specifie subset of NK co-expressing CD86 and HLA-DR. IL-21-propagated HLA-DR' NK were able to process and present antigens to CD4' T lymphocytes. More importantly, IL-21-propagated HLA-DR' NK produced macrophage migration inhibitory factor and provided a co-stimulatory signaling during naive CD4* T cell priming inducing the differentiation of uncommitted central memory (Tcm) lymphocytes. Tcm expanded in the presence of HLA-DR* NK were CXCR3 CCR4" CCR6' CXCR5' and produced IL-2, as well as low levels of TNF-a. Co-stimulation of CD4* T cells by HLA-DR' NK prevented the acquisition of effector memory phenotype induced by IL-2. Altogether, these results demonstrate a novel function for IL-21 in tuning NK and CD4~ T cell interactions promoting a specifie expansion of central memory lymphocytes.

L'inflammasome est une plateforme moléculaire composée d'un récepteur de l'immunité innée tels que NLRP3 ou NLRP1b, de la protéine adaptatrice ASC et de la caspase-1. Il joue un rôle essentiel dans le déclenchement de la réponse inflammatoire via l'activation de la caspase-1 qui mène à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telle que l'IL-1ß. Dans un premier axe de recherche, nous avons mis en évidence que les macrophages de souris déficientes pour ASC traités avec l'activateur de l'inflammasome NLRP1b, la toxine létale de bacillus anthracis, étaient capables de sécréter la forme mature de l'IL-1ß en absence de clivage de la caspase-1 pourtant décrit comme un événement indispensable à son activité. En reconstituant des macrophages caspase-1 KO avec une forme mutante non-clivable de la caspase-1, nous avons démontré que la forme entière de la caspase-1 est capable d'induire la sécrétion d'IL-1ß en réponse à la toxine létale alors qu'elle n'est pas fonctionnelle au sein de l'inflammasome NLRP3.Dans un second axe de recherche, mon travail de thèse s'est intéressé à comprendre le rôle de l'inflammasome au cours de la progression tumorale. En effet, l'IL-1ß est une cytokine fréquemment retrouvée dans le microenvironnement tumorale mammaire suggérant donc l'activation de l'inflammasome au sein des tumeurs. Au moyen d'un modèle de tumeurs in vivo, nous avons montré que l'absence de la caspase-1 et de ASC dans les cellules immunitaires chez la souris conduit à une réduction de la croissance tumorale. De plus, l'absence de ces deux protéines provoque également un plus fort recrutement et une meilleure activité des cellules NK au sein des tumeurs.En plus d'identifier un nouveau mécanisme d'activation de la caspase-1, mon travail de thèse a permis de mettre en évidence le rôle de l'inflammasome dans l'altération des cellules NK au cours de la progression tumorale mammaire. Ces données permettent d'envisager l'inflammasome comme une cible thérapeutique dans le cancer / The inflammasome is a molecular platform composed of an innate immune receptor such as NLRP3 or NLRP1b, of the adaptor protein ASC and of the caspase-1. It plays an essential role in triggering inflammatory response through the activation of caspase-1 that leads to the secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-1ß.In a first research axis, we showed that ASC deficient mice macrophages treated with an NLRP1b inflammasome activator, the lethal toxin of Bacillus anthracis, were able to secrete the mature form of IL-1ß in absence of any cleavage of caspase-1 previously described as an essential event for its function. By reconstituting caspase-1 KO macrophages with an uncleavable mutant form of caspase-1, we showed that the entire form of the protein is able to induce IL-1ß secretion upon lethal toxin treatment but is nonfunctional upon NLRP3 inflammasome activation.In a second research axis, my PhD work focused on underlying the inflammasome role during tumor progression. Indeed, IL-1ß is frequently found within breast tumor microenvironment suggesting that inflammasome is activated in tumors. Using in vivo tumor model, we showed that the absence of caspase-1 of ASC in immune cells lead to a delay tumor growth. In addition, the absence of these two proteins also causes a stronger recruitment and an enchanced activity of NK cells within mammary tumors

Natural Killer (NK) cells, members of the innate lymphoid cells (ILCs), are known to play an important role in the defense against foreign cells and abnormal host cells that have arisen due to viral infection or cancer inducing mutations. The typical immune response of NK cells involves the release of cytotoxic granules containing perforin and granzyme, and the secretion of immune-regulatory cytokines such as interferon gamma (IFN-γ). Unlike the adaptive lymphocytes such as T cells and B cells, NK cells do not require prior sensitization, enabling them to initiate an immune response much faster. This unique feature of NK cells is made possible by the utilization of an array of germline encoded receptors; but on the other hand, it limits NK cells ability to respond against rapidly evolving pathogens. NK cells overcome this shortcoming with an antibody-assisted process called antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC). A novel subset of human NK cells, which displays potent and broad antiviral responsiveness in concert with virus-specific antibodies, was recently discovered in cytomegalovirus positive (CMV+) individuals. This NK cell subset, called g-NK cell, was characterized by a deficiency in the expression of FcεRIγ, an adaptor protein that associates with CD16 which enables ADCC. Surprisingly, despite this deficiency, g-NK cells displayed an enhanced ADCC as compared to their conventional counterparts. Furthermore, having a long-lasting memory-like NK-cell phenotype suggests a role for g-NK cells in chronic infections. This study investigates the importance of g-NK-cells in clinical settings, first by investigating whether the presence of g-NK cells is associated with the magnitude of liver disease during chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Analysis of g-NK cell proportions and function in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy controls and chronic HCV subjects showed that chronic HCV subjects had slightly lower proportions of g-NK cells, while having similarly enhanced ADCC responses compared to conventional NK cells. Notably, among CMV+ chronic HCV patients, lower levels of liver enzymes and fibrosis were found in those possessing g-NK cells. g-NK cells were predominant among the CD56neg NK cell population often found in chronic HCV patients, suggesting their involvement in the immune response against HCV. Rituximab is a chimeric anti-CD20 antibody used to treat B cell lymphoma patients; and studies have suggested that its efficacy is associated with the ADCC potency and CD16 affinity. Since g-NK cells are characterized by their superior ADCC compared to their conventional counterpart, I decided to investigate whether the presence of g-NK cells can improve the effectiveness of rituximab against malignant B cells in the context of lymphoma and leukemia. The analysis of g-NK cells’ ADCC response against rituximab-coated lymphoma cell lines and B cells from a CLL patient indicated a superior ADCC by g-NK cells compared to their conventional NK cell counterparts. Taken together, for the first time, my findings indicate that the presence of g-NK cells in CMV+ individuals is associated with milder liver disease in chronic HCV infection. In addition, an enhanced ADCC response by g-NK cells upon encountering rituximab coated target cells suggests the beneficial roles of g-NK cells, and opens an avenue for novel therapeutic approaches where g-NK cells can be utilized to treat persistent diseases such as chronic viral infection and cancer.

Mouse NK cell receptors belonging to NKR-P1 family plays role in activation, inhibition and cytokine secretion by these cells. Aim of this thesis is preparation of extracellular parts of C57BL/6 mouse strain activating receptors mNKR-P1A and mNKR-P1C. Production vectors with coding sequences of both proteins were prepared. Next, optimization of production in E. coli was done and appropriate in vitro refolding and purification protocol were developed. Purified proteins were characterized by mass spectrometry and labeled by a fluorescent dye. Primary screening for potential ligand was performed. Further work will involve structural characterization of the receptors and identification of their ligands. These data may help to clarify the function of NK cells.

Protein Nkr-p1b is a surface receptor of cytotoxic NK cells, that mediates inhibitory signal toward the body's own cells. In this study, the ligand binding domain of the mouse protein receptor Nkr-p1b (mNkr-p1b LBD) was prepared by recombinant expression in E. coli cells. Isolated protein was subsequently used for NMR structural analysis. Prediction of protein secondary structures ratio was carried out using three different methods (CD, PSIPRED and TALOS). Results correlate well with the structure of CTLD domain, that plays a key role in ligand binding and thus to function of Nkr-p1b receptor. We managed to prepare this protein in a form suitable for NMR experiments. Based on the data obtained by NMR spectra analysis, a preliminary model of the mNkr-p1b LBD protein structure was created. However, for more precise learning of the 3D structure accurate positions of individual atoms need to be determined by other NMR spectra evaluation in the next phase. Explaining the structure of the ligand binding domain of mNkr-p1b protein could help to better understand the complex mechanism of activation of NK cell cytotoxic activity, thereby contributing to its controlled use as a therapeutic against some viral and tumor diseases.

Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease leading to destruction of insulin-secreting pancreatic -cells. Environmental factors e.g. exposures to infections, dietary components play a substantial role in etiopathogenesis of T1D and are responsible for rapid increase of T1D incidence in past decades, preferentially in developed countries. Despite long record of T1D research no causative cure or efficient prevention exists. While gluten displays proinflammatory properties, gluten-free diet (GFD) has been documented by several studies as a strong diabetes- preventive environmental factor in spontaneous animal models of T1D, mostly in NOD mouse. The aim of this thesis is to better characterize effects of GFD on the immune system of NOD mouse. Using flow cytometry, we compared effects of GFD vs standard (STD) Altromin diets on NK cell subsets, Tregs, as well as other regulatory cell subsets and their cytokine profile in prediabetic SPF NOD females that were exposed to the diets since "in utero". A reference diabetes incidence in NOD females in our SPF facility kept on STD and GFD was recorded. Diabetes-preventive capacity of GFD were tested by using the NOD-SCID model of diabetes transfer, in which splenocytes from at-onset NOD females kept on GFD or STD were transferred to NOD-SCID recipients....