5 Anglický abstrakt Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is widely accepted as a murine model of human multiple sclerosis autoimmune disease. Murine EAE is usually actively induced by immunization with a suitable myelin antigen. Following immunization, CD4+ T helper lymphocytes Th1 and Th17 accumulate in the nervous tissue and via the production of cytokines, they mediate an inflammatory reaction and the subsequent destruction of myelin. The main goal of this study was the induction of EAE with clinically observable symptoms and the observation of changes in the counts and phenotypes of cells, mainly NK and T cells. NK cells express a wide range of inhibitory and activation receptors from the C-lectin-like receptor superfamily. The specific ligand of the activating NKR-P1C isoform is still unknown and thus this receptor's involvement in EAE was also observed. Another goal was the use of medication with regard to the disease progress improvement. For the purposes of this study, two inbred murine strains with distinct NKR-P1 surface expression were used - the SJL/J strain (expressing inhibitory NKR-P1B) and C57BL/6 (expression activating NKR-P1C). SJL mice elicited a relapse-remitting of EAE, while C57BL/6 had chronic EAE. Both mouse strains exerted changes in the counts of NK...

Lectin-saccharide interactions are involved in many biological processes essential for the survival and proper function of multicellular organisms. C-type lectin-like receptors, predominantly expressed by cells of the innate immune system, recognize saccharide structures on microbes and also aberrant glycosylation pattern of cancer cells. The NKR-P1 receptor family was among the first natural killer (NK) receptor families that were identified, however ligands for some of members remain still elusive. Recently, publications describing N-acetylglucosamine-terminated oligosaccharide structures as possible ligands for NKR-P1 receptor have been subjects for correction/retractions after investigation of the Ethical Committee of the Institute of Microbiology, ASCR, v. v. i. and Charles University in Prague. Re-evaluation of glycodendrimer effect, particularly effect of N-acetyl-D-glucosamine octabranched dendrimer on polyamidoamine scaffold (GN8P), revealed mostly indirect role of NK cells on modulation of immune responses. Properly folded soluble recombinant rat NKR-P1A and mouse NKR-P1C lack binding activity to neoglycoproteins modified with GlcNAc-terminated structures. Moreover, new possible target cell populations (NKT cells and macrophages) for saccharide binding were identified.

Le FcRn ou récepteur néonatal du Fc des IgG est un récepteur " clé " qui prolonge la demi-vie des IgG et de l’albumine et assure leur biodistribution. Récemment, son rôle s'est étendu à la réponse immunitaire humorale et anti-tumorale. Par ailleurs, certains travaux indiquent que le niveau d’expression du FcRn dans les différents tissus pourrait être à l’origine d’une modulation de ses fonctions. Dans ce contexte, nous avons démontré que l’expression du FcRn était diminuée dans le tissu cancéreux par rapport au tissu sain, chez des patients atteints du cancer du poumon et que cet effet était corrélé à leur pronostic. Afin de comprendre les répercussions de cette diminution sur la tumorigenèse, nous avons mis en place le modèle murin de métastases pulmonaires B16F10, chez les souris FcRn-/-. L'absence de FcRn influence la réponse anti-tumorale, en altérant le nombre de cellules dendritiques et des TCD8+. Pour la première fois, nous avons montré que l'absence du FcRn influençait le développement/maturation et fonctions des cellules NK, fragilisant ainsi encore plus l'immunosurveillance antitumorale. Ces résultats mettent en avant un nouveau rôle du FcRn dans la biologie des cellules NK. Les mécanismes à l’origine de cet effet restent à élucider. / FcRn or neonatal receptor for the Fc portion of IgG is a "key" receptor since it extends the half-life of IgGs and albumin and ensures their biodistribution. Recently, its role has been extended to the humoral and anti-tumor immune. Moreover, some studies indicate that the expression level of FcRn in the different tissues may modulate its functions. In this context, we showed that the expression of FcRn was decreased in lung cancer tissue compared to healthy tissue, in patients with NSLC. This decreased expression is correlated with the prognosis of the patients. In order to understand the impact of the reduced FcRn expression on tumorigenesis, we implemented a murine model of lung metastases, implanting B16F10 cells in FcRn deficient mice. The absence of FcRn influences the anti-tumor response, by altering the number of dendritic cells and TCD8+ cells. We showed for the first time that the lack of FcRn altered the development / maturation and the functional activity of NK cells, thus weakening even more anti-tumor immunosurveillance. These new results on NK highlight a new role of FcRn in the biology of NK cells. The mechanisms underlying this effect need to be elucidated.

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Stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale constitue une voie d’avenir indiscutable pour le traitement des cancers. Aujourd'hui, les thérapies ciblées à base d'anticorps ont une place majeure dans l’immunothérapie des cancers du sein de par leur impact positif sur le pronostic des patientes. Cependant, les cancers du sein triple négatifs (TNBC) résistent aux innovations thérapeutiques actuelles, et, par défaut de traitement ciblé efficace, restent de sombre pronostic. Notre équipe développe des stratégies d’immunothérapie à base d'anticorps bispécifiques (bsFabs) conçus à partir de fragments d'anticorps de camélidés qui présentent la particularité de cibler simultanément les cellules immunitaires et tumorales. Ainsi, mon projet visait à évaluer le potentiel anti-tumoral de deux bsFabs sur des modèles précliniques de TNBC à travers leur capacité à activer et à rediriger le système immunitaire contre les cellules tumorales. La finalité du projet est de proposer un nouvel axe de thérapie ciblée susceptible d'améliorer le pronostic des patientes atteintes de TNBC. / Mounting evidence of the key contribution of NK cells in immunity against cancer has boosted the investigations on NK cell-based therapies. Among these strategies, monoclonal antibody-based therapeutics (mAbs) are currently the fastest growing segment of the medicine market. Despite therapeutic innovations, triple negative breast cancers (TNBC) remain insensitive to the current targeted or hormono-therapies. Our objective is to manipulate NK cell functions and tumor targets using an original format of nanobody-based bispecific antibodies (bsFab) to revert the dampened immune response for treating TNBC. Thus, we generate two bsFabs able to crosslink NK and tumor cells. NK antitumor effects driven by mAbs and bsFabs, alone or in combination, were investigated in vitro and in vivo on preclinical TNBC models. Here, we demonstrate the potential of bsFabs to enlarge the number of patients eligible for breast cancer immunotherapy and prompt to consider combination strategies.

Les cellules Natural Killer (NK) sont jouent un rôle essentiel dans la surveillance des hémopathies malignes. Cependant, les cellules tumorales développent des mécanismes immunosuppresseurs pour échapper à l'immunité cellulaire NK. Ainsi, le maintien ou l'amélioration des performances des cellules NK sont considérés comme des défis majeurs. Les objectifs de cette partie étaient d'évaluer l'impact de la perfusion de cellules NK activées sur la récupération et la biologie des cellules NK circulantes après l'allo-SCT. Des doses croissantes de cellules NK activées par IL-2 ex-vivo ont été perfusées chez des patients atteints de tumeurs malignes hématologiques 3 mois après allo-SCT. Nos résultats ont montré une fréquence plus élevée des cellules NK dans la périphérie des patients traités. Bien que le phénotype immature soit remarquable peu après le traitement, les cellules NK circulantes, présentaient un état d'activation avec un profil de maturation amélioré après 6 mois de traitement. Nous avons également constaté que l'expression des récepteurs NK activateurs (NKG2D, NKp30 et NKp46) augmentait sur les cellules NK circulantes des patients. De plus, ces cellules ont montré une augmentation significative de la capacité de dégranulation ainsi que de la sécrétion de cytokines (IFN-Ƴ et TNF-α) tout au long de l'étude. Ces différences ont notamment été observées chez les patients ayant reçu des doses plus importantes de cellules NK activées. En conclusion, nous supposons que la perfusion de fortes doses de cellules NK activées ex-vivo pourrait être associée à l'amélioration du phénotype et des fonctions des cellules NK au cours de la reconstitution immunitaire après allo-SCT. / Natural killer (NK) cells are effector lymphocytes of the innate immune system that have the ability to kill transformed cells. They play a critical role in hematological malignancies surveillance, however, tumor cells develop immunosuppressive mechanisms to escape NK cell-mediated killing. So, maintaining or improving NK cell performance is considered a major challenge. Our goals are to evaluate the impact of activated NK cells infusion on the recovery and biology of circulating NK cells post allo-SCT.Three different doses (dose 1: 106 NK cell/Kg, n=3; dose 2: 5x106 NK cell/Kg, n=7; dose 3: >5x106 NK cell/Kg, n=6) of ex-vivo IL-2 activated NK cells were infused into patients with hematological malignancies after all-SCT. Our results showed higher frequency of NK cells in the periphery of patients treated with larger doses of activated NK cells. Although the notable immature phenotype shortly after treatment, the circulating NK cells in patients receiving larger doses of activated NK cells displayed more activation status with improved maturation profile after 6 months of treatment. We also found that the expression of activating NK receptors (NKG2D, NKp30, and NKp46) augmented on circulating CD56dim NK cells of patients receiving larger doses of activated NK cells. Moreover, these cells showed a significant increase in degranulation capacity as well as cytokine secretion (IFN-Ƴ and TNF-α) throughout study period. In conclusion, we hypothesize that infusion of high-dose of ex-vivo activated NK cells could be associated with improvements of NK cell phenotype and function during immune reconstitution after allo-SCT.

Humane NK Zellen können in CD56br und CD56dim NK Zellen unterteilt werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, in welchem Zusammenhang die verschiedenen NK Zell Populationen stehen und wie funktional kompetente NK Zellen generiert werden. Des Weiteren wurde die Heterogenität der CD56dim NK Zell Population in Bezug auf Funktionalität und Differenzierungsstadien analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass CD56br NK Zellen in CD56dim NK Zellen differenzieren. Währenddessen werden u.a. MHC-I spezifische inhibierende Rezeptoren (KIR) erworben. Diese sind essentiell für die Unterscheidung zwischen “Selbst” und “Nicht-Selbst”, wobei nur NK Zellen, die Selbst-MHC-spezifische KIRs tragen, funktional kompetent sind. In der vor-liegenden Arbeit konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass zuvor anerge NK Zellen nach Zytokin-induzierter Expression eines Selbst-MHC-spezifischen KIRs kompetent werden. Ex vivo Analysen humaner Gewebe lassen vermuten, dass diese Prozesse während einer Entzündung in sekundären lymphatischen Organen (SLO) stattfinden könnten. Auch CD56dim NK Zellen selbst sind nicht homogen, hingegen können anhand der Expression von KIRs oder CD62L, welches für die Migration in SLO wichtig ist, weitere Subpopulationen unterschieden werden. Eine umfassende Analyse bezüglich KIR und CD62L Expression führte zur Identifizierung einer zuvor nicht charakterisierten CD56dimCD62L+ NK Zell Population, welche die Fähigkeiten von CD56br, Zytokine zu produzieren und zu proliferieren, mit einem hohen zytotoxischen Potenzial, vereinigt. Weitere ex vivo Untersuchungen des Phänotyps, der Telomerlängen und der Verteilung in Relation zum Alter lassen vermuten, dass die Differenzierung humaner NK Zellen von CD56br über CD56dimCD62L+ zu CD56dimCD62L- verläuft, wobei die Zellen mit fortschreitender Dif-ferenzierung ihre Fähigkeit auf Zytokine zu antworten verlieren und dafür die Fähigkeit er-langen, über aktivierende Rezeptoren stimuliert zu werden. / Human NK cells comprise two main subsets, CD56br and CD56dim cells. In this study, an extensive analysis of human NK cell phenotype and functional characteristics has been performed in order to investigate the developmental relation between NK cell subsets, to elucidate how NK cell competence is acquired and to further dissect the heterogeneity of the CD56dim subset with regard to functions and differentiation history of human NK cells. It could be shown that upon cytokine activation, CD56br differentiate into CD56dim NK cells and that this process might take place in inflamed secondary lymphoid organs (SLO). One of the crucial markers acquired during this process is KIR, the main MHC-specific inhibitory receptors responsible for self versus non self recognition. Previously, it has been shown that only cells expressing self-MHC specific KIRs are responsive to activating stimuli. In this study, it was demonstrated that induction of self-MHC specific KIR by cytokines leads to acquisition of functional competence. Ex vivo analysis of human tissues suggests that acquisition of KIR and consequently of cytotoxic competence may occur in inflamed SLO. Finally, it was demonstrated that CD56dim NK cells do not represent a homogenous population. When dissected for CD62L and KIR expression, a new subset of NK cells could be identified, namely CD56dimCD62L+, which uniquely combines properties of CD56br NK cells, particularly high IFN-g production upon cytokine stimulation, proliferation and potential to migrate into SLO, with the capacity of CD56dim to kill, produce cytokines upon activating receptor stimulation and to migrate into inflamed tissues. Ex vivo analysis of the function, phenotype, telomere length and frequencies during ageing of CD56br, CD56dimCD62L+ and CD56dimCD62L- NK cells suggest that CD56dimCD62L+ cells represent an intermediate stage of NK cell maturation between the more immature CD56br and the terminally differentiated CD56dim CD62L- NK cells.

Chef de file des inhibiteurs de tyrosines kinase, l’Imatinib Mesylate (IM) a révolutionné la prise en charge de la leucémie myéloïde chronique et des tumeurs stromales gastro-intestiales. En plus de son action directe sur les cellules tumorales, une partie de l’efficacité thérapeutique de l’IM a été attribuée à son aptitude à moduler la réponse immunitaire. Cette propriété soulève la possibilité que les résultats cliniques de l’IM pourraient être améliorés en le combinant efficacement à une immunothérapie. A cet effet, nous avons montré dans un modèle préclinique que l’interleukine-2 (IL-2) – adjuvant des cellules NK – augmente l’efficacité de l’IM. Nous avons également démontré une efficacité supérieure de l’IM en association au cyclophosphamide (CTX) du fait de l’inhibition des lymphocytes T régulateurs. Nous avons donc entrepris un essai clinique de phase 1 associant l’IM, l’IL-2 et le CTX chez des patients ayant une tumeur solide métastatique ou localement avancée. Les objectifs de cet essai sont (i) de déterminer la dose maximale tolérée d’IL-2 associée à l’IM et au CTX ; (ii) d’étudier les paramètres pharmacocinétiques de l’association ; (iii) d’évaluer l’efficacité de l’association et (iv) son effet sur les effecteurs de l’immunité. Au total, 17 patients ont été inclus dans cette étude. La DMT d’IL-2 associée à la dose fixe de 400 mg d’IM correspond à 6 MUI/j. A ce niveau de dose, tous les patients ont présenté au moins un effet indésirable imputable au traitement : principalement fièvre et frissons, augmentation des enzymes hépatiques, asthénie et nausée mais sans que ne soit observée de toxicité limitante. L’étude des paramètres pharmacocinétiques révèle une augmentation significative de l’exposition systémique à l’IM en fin de cycle et qui semble être imputable à l’IL-2. La pharmacocinétique de l’IL-2 n’est par contre pas modifiée par l’administration concomitante d’IM. Sur le plan des effecteurs de l’immunité, l’association IM, IL-2 et CTX diminue le taux de lymphocytes B, lymphocytes T (LT) CD4+ et LT CD8+ mais active les cellules NK puisqu’on observe une augmentation des marqueurs CD56bright, HLA-DR et TRAIL. De manière intéressante, la sous-population de cellules NK HLA-DR+ possède des capacités de dégranulation plus importante après exposition à cette association et son expansion est associée à une meilleure survie. Cette association pourrait donc s’avérer particulièrement intéressante dans le traitement de tumeurs sensibles d’une part à l’IM et d’autre part à la lyse par les cellules NK. Les GIST étant particulièrement sensibles à l’IM, nous avons étudié l’infiltrat tumoral présent au niveau de ses tumeurs. Nous avons ainsi pu mettre en évidence le rôle pronostique de l’infiltrat en LT et NK sur la survie sans progression des GIST. En vue d’une étude de phase 2, les GIST apparaissent donc être un modèle tumoral particulièrement pertinent pour évaluer les bénéfices de l’association IM, IL-2 et CTX. / Imatinib mesylate (IM) was the first tyrosine kinase inhibitor to be successfully used in clinical practice and its introduction has revolutionized the management of chronic myeloid leukemia and gastrointestinal stromal tumors. In addition to its direct effects on malignant cells, IM appears to exert immunological off-target effects that contribute to its anticancer effects. Thus, combining IM with immunotherapy might improve patients’ clinical outcome. Indeed, IM combined to Interleukin-2 (IL-2) - a cytokine that enhances natural killer (NK) cells functions - improved antitumor responses in preclinical models. We also observed synergistic effects of cyclophosphamide (CTX) and IM as a result of the inhibition of regulatory T lymphocytes. Based on the promising results of these preclinical studies, we developed a phase 1 clinical trial which combines metronomic CTX, IM and escalating doses of IL-2 in patients affected by refractory solid tumors. The goals of this study were (i) to determine the maximum tolerated dose of IL-2 combined with IM and CTX ; (ii) to study the pharmacokinetics of IM and IL-2 ; (iii) to evaluate clinical efficacy of the combined therapy and (iv) effects of the association on immune parameters. A total of 17 patients were enrolled in the study. The maximum tolerated dose of IL-2 combined with IM, given at a constant dose of 400 mg was determined to be 6 MIU/day. At this dose level, all patients experienced at least one treatment-related adverse event: fevers and chills, transaminase elevation, fatigue and nausea but no dose-limiting toxicities were observed. Pharmacokinetic studies revealed that the co-administration of IL-2 increases the systemic exposure of patients to IM. In contrast, the pharmacokinetics of IL-2 was not modified by IM. The combined therapy markedly reduced the absolute numbers of B lymphocytes, CD4+ T cells and CD8+ T cells in a IL-2 dose-dependant manner. The NK cell compartment was activated, exhibiting a significant upregulation of CD56bright, HLA-DR and TRAIL. Interinstingly, the abundance of HLA-DR+ NK cells after one course of combined therapy positively correlated with both progression free- and overall survival. Thus, it could be of interest to evaluate this immunotherapeutic regimen in a tumor model sensitive to IM and to lysis by NK cells and evaluate whether the adjunction of IL-2 can boost the efficacy of IM. GIST are particularly sensitive to IM, thus we performed a retrospective study of the immune infiltrates and their prognostic value in these tumors. We found that both LT and NK cell infiltrates were independent prognostic factors for progression-free survival. For a phase 2 clinical trial, gastrointestinal stromal tumors appear to be a particularly relevant to evaluate the benefits of the association IM, IL-2 and CTX.

Stimuler le système immunitaire est un enjeu majeur dans le traitement des leucémies aigües. Nous avons centré notre étude sur la leucémie aigüe myéloïde (LAM) et la leucémie à cellules dendritiques plasmacytoïdes (LAPDC). Dans une première partie, nous avons étudié les médicaments immunomodulateurs (IMiDs) utilisés dans le traitement du myélome multiple et des syndromes myélodysplasiques à délétion 5q. Les IMiDs présentent des propriétés anti-angiogéniques, anti-prolifératives, pro-apoptotiques, et immunomodulatrices en particulier sur les cellules NK (Natural Killer). Nous avons évalué les effets anti-leucémiques des IMiDs (lenalidomide et pomalidomide) dans le but d’améliorer l’activité cytotoxique des NK dans la LAM. Nous avons mis en évidence une altération de la survie des blastes de LAM par les IMiDs in vitro, et dans un modèle in vivo de greffe dans les souris immunodéficientes NOD/SCID/IL2rg-/- (NSG). Nous avons également montré une sensibilisation par les IMiDs des blastes de LAM à la lyse par les NK allogéniques, indépendamment de la cible moléculaire connue, le cereblon. Le traitement des blastes de LAM par IMiDs stimule les fonctions NK. Enfin, nous avons décrit des modifications phénotypiques induites par les IMiDs sur les récepteurs NK, et une diminution d’expression de HLA-classe I sur les cellules de LAM. Ces résultats encouragent la poursuite du développement des IMiDs dans la LAM, en particulier les associations stimulant les fonctions NK. Dans une seconde partie, nous avons développé un modèle murin de LAPDC dans la souris NSG. Cet outil préclinique est indispensable dans l’élaboration de stratégies d’immunothérapie dans les leucémies aigües. / Boosting the Immune System is a major challenge in the treatment of acute leukemias. We focused our study on acute myeloid leukemia (AML) and plasmacytoid dendritic cell leukemia (BPDCN). In the first part, we studied immunomodulatory drugs (IMiDs) that are currently used in the treatment of patients with myeloma and myelodysplastic syndrome with 5q deletion. IMiDs exhibit anti-angiogenesis, anti-proliferative, pro-apoptotic, and immunomodulatory properties especially on NK cells and T lymphocytes. We investigated the anti-leukemic effects of two IMiDs (lenalidomide and pomalidomide) in order to improve NK cell cytotoxic activity in AML. We have shown that IMiDs impaired survival of AML blasts in vitro, and in vivo in NOD/SCID/IL2rg-/- (NSG) murine model. In addition, IMiDs treatment sensitized AML blasts to allogeneic NK cell mediated lysis, independently of Cereblon, the known molecular target of IMiDs. IMiDs treatment of AML blasts enhanced NK cell functions such as degranulation and cytokine production. Finally, we have described phenotypic changes induced by IMiDs on NK receptors, and a down-regulation of HLA-class I on AML blasts. These results encourage continuing investigation for the use of IMiDs in AML, especially in combination with immunotherapies based on NK cells. In a second part, we have developed a murine model of plasmacytoid dendritic cell leukemia (BPDCN) in NSG mice. Murine model of leukemia are essential preclinical tools in the development of new immunotherapies in acute leukemias.

Allergic diseases are influenced by genetics and the environment. Maternal allergy appears to confer a higher risk for allergic sensitization than paternal allergy, suggesting an in utero influence. A decrease in particular infections or a lower exposure to microbial components during infancy is suggested to contribute to the high allergy prevalence in affluent societies. Toll-like receptors (TLR) 2 and 4 recognize peptidoglycan (PGN) and LPS respectively, are expressed on e.g. monocytes, and have been implicated in modulating the risk of IgE-sensitization. This thesis aimed to study the influence of maternal allergy and early microbial exposure on monocyte function and allergic sensitization during childhood. Blood samples from children participating in a prospective allergy cohort were used. Two-year old infants with allergic mothers had lower IL-6 production and reduced activation of the TLR-signalling intermediate p38-MAPK in response to PGN than children with non-allergic mothers. In 5-year old children, allergic disease and not maternal allergy influenced monocytic TLR2-regulation. Five-year olds who were seropositive for Epstein-Barr virus (EBV) at 2-years of age had a lower risk of persistent IgE-sensitization while EBV contraction after 2-years of age related to a higher risk of IgE-sensitization. Upon in vitro stimulation, NK cells from EBV+ 2-year olds produced lower IFN-g levels. EBV+ 2-year olds had also lower systemic IFN-g. In comparison to CD14++CD16- monocytes, CD14+CD16+ cells induced NK-cell IFN-g more potently in vitro, and EBV+ infants tended to have lower proportions of these CD14+CD16+ monocytes. This thesis highlights the importance of early-life microbial (EBV) exposure for a proper allergy-protective immunity. Also, maternal allergic heredity appears to influence monocytic microbial responses in early infancy. All these aspects relate to altered monocyte functionality, which suggest that they could have a role in allergic sensitization.