Wear particles and ions from cobalt-chromium-molybdenum (CoCrMo)-based implants have been shown to cause adverse immune responses, including periprosthetic osteolysis leading to aseptic loosening, the main cause of implant failure. Previous studies have shown that these wear and corrosion products can lead to the release of inflammatory cytokines, including interleukin-1β (IL-1β), suggesting the involvement of the NLRP3 inflammasome. However, the mechanisms leading to IL-1β release have not been fully elucidated. The primary objectives of this thesis were to determine if, in murine macrophages, IL-1β release induced by micrometre-size CoCrMo particles and nanometre-size chromium oxide (Cr2O3) particles is: 1. Caspase-1-dependent; 2. Reduction-oxidation (redox)-dependent; and 3. NLRP3 inflammasome-dependent. Additionally, the effects of metal ions (Co2+, Cr3+, and Ni2+) on NLRP3 inflammasome activation and the effects of matrix metalloproteinase (MMP) inhibition on IL-1β release induced by CoCrMo particles were analyzed. Results showed that IL-1β release induced by CoCrMo particles was partly caspase-1-, redox-, and MMP-dependent, but NLRP3 inflammasome-independent. On the other hand, IL-1β release induced by Cr2O3 particles appeared to be NLRP3 inflammasome-dependent. Finally, IL-1β release induced by Cr3+, but not Co2+, appeared to be NLRP3 inflammasome-dependent, while Ni2+-induced IL-1β release appeared to be only partially NLRP3 inflammasome-dependent, suggesting that other pathways may also be involved. These findings, which provide additional insights into the mechanisms leading to IL-1β release induced by wear particles and ions from CoCrMo-based implants, may help the future development of therapeutic treatments to modulate wear product-induced inflammation and increase implant longevity.

Retinale Hypoxie ist ein wichtiger Faktor bei der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Erkrankung, die mit einer chronischen Entzündungsreaktion einhergeht. Das angeborene Immunsystem besitzt eine Vielzahl von Mechanismen, um pathogene Faktoren zu erkennen und zu eliminieren. Dazu gehört u.a. das NLRP3-Inflammasom, das wahrscheinlich auch bei der AMD in der Netzhaut aktiviert ist. Die Aktivierung des Inflammasoms ist ein Zweischrittprozess: der erste Schritt, das Priming, besteht in der Transkription von NLRP3-assoziierten Genen. Im zweiten Schritt kommt es zu einer Assemblierung der Inflammasombestandteile, so dass das aktivierte Inflammasom pro-IL-1ß in das biologisch aktive IL-1ß umwandelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob Hypoxie in kultivierten humanen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE)-Zellen die Transkription und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms induziert. Es sollte auch ermittelt werden, welche Signalwege die hypoxischen Veränderungen der Genexpression von NLRP3 und des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF-A) vermitteln. Dafür wurden Untersuchungen an humanen RPE-Zellen, die in 0,2% O2 bzw. in Anwesenheit von CoCl2 kultiviert wurden, durchgeführt. Hypoxie bewirkte keine Veränderungen der Genexpression der Inflammasom-assoziierten Proteine NLRP1, NLRP6, NLRP7, NLRP12 und NLRC4, wohingegen die Expression der NLRP3- und IL-1ß-Gene sowie der NLRP3- und IL-1ß-Proteingehalt in RPE-Zellen erhöht wurden. Verschiedene Signalwege vermitteln die Hypoxie-induzierte Transkription des NLRP3-Gens. Hierzu zählen die Transkriptionsfaktoren CREB und HIF, Proteinkinase A, IP3-Rezeptoren, calcium-bindende Proteine, TRP- und SOS-Kanäle sowie autokrine/parakrine Aktivierung von EGF-, TGF-ß1-, FGF- und IL-1ß-Rezeptoren. Desweiteren wurde auch eine Beteiligung der autokrin/parakrinen Aktivierung von purinergen Rezeptoren an der hypoxischen NLRP3-Genexpression nachgewiesen. Eine Pannexin-abhängige Freisetzung von ATP trägt über eine Aktivierung von P2Y2- und Adenosin-A1-Rezeptoren zur hypoxischen Expression des NLRP3-Gens bei. Die Aktivierung der P2Y2-Rezeptoren trägt auch zur hypoxischen Expression und Sekretion von VEGF bei. Es konnte auch gezeigt werden, dass eine durch lysosomale Destabilisierung bewirkte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms eine Verringerung der RPE-Zellviabilität unter hypoxischen Bedingungen bewirkt. Die Daten lassen vermuten, dass Hypoxie ein Faktor ist, der ein Priming und eine Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in RPE-Zellen bewirkt. Dies könnte eine retinale Inflammation und eine Degeneration der RPE-Zellen begünstigen. Eine Aktivierung von P2Y2-Rezeptoren trägt sowohl zur Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms als auch zur Produktion des angiogenen Faktors VEGF-A in RPE-Zellen bei.:Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis 2. Einführung 2.1. Das retinale Pigmentepithel-Aufbau und Funktionen 2.2. Die Altersbedingte Makuladegneration (AMD) 2.2.1. Epidemiologie und Ätiologie 2.2.2. Pathophysiologie und Klassifikation der AMD 2.2.2.1. Frühe AMD 2.2.2.2. GA und CNV – Spätformen der AMD 2.3. Zusammenhang zwischen AMD und Immunsystem 2.4. Das NLRP3-Inflammasom 2.4.1. Signalerkennung, Rezeptoren und Aufbau des NLRP3-Inflammasoms 2.4.2. Aktivierung des Inflammasoms 2.4.3. Wirkung von inflammatorischen Prozessen und Zytokinen auf die RPE-Zelle 2.5. Komplementsystem und AMD 2.6. Therapie der AMD 3. Aufgabenstellung 4. Materialien und Methoden 4.1. Materialien 4.1.1. Chemikalien 4.1.2. Substanzen zur Zellstimulation 4.1.3. Geräte und Sonstige Materialien 4.1.4. Primerpaare 4.1.5. Antikörper für die Western-Blot-Analyse 4.1.6. ELISA 4.2. Methoden 4.2.1. Zellkultivierung und Zellstimulation 4.2.2. Zellvitalität 4.2.3. RNA Präparation 4.2.4. cDNA Synthese 4.2.5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) 4.2.6. Agarose – Gelelektrophorese 4.2.7. siRNA Transfektion 4.2.8. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4.2.9. Western-Blot, Proteinbestimmung nach Bradford und SDS-PAGE 4.3. Statistische Auswertung 5. Ergebnisse 5.1. Genexpression von Inflammasom-assoziierten Proteinen 5.2. Wirkung von Hypoxie auf die Genexpression von Inflammasomproteinen 5.3. Hypoxisch induzierte Expression von NLRP3 und IL-1ß Protein 5.4. RPE Zellvitalität 5.5. Regulation der Genexpression von NLRP3 und VEGF unter hypoxischen Bedingungen 5.5.1. Transkriptionsfaktoren 5.5.2. Beteiligung intrazellulärer Signalkaskaden 5.5.2.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.2.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.3. Beteiligung von extrazellulären Signalproteinen 5.5.3.1. NLRP3 mRNA-Expression 5.5.3.2. VEGFA-mRNA-Expression 5.5.4. Beteiligung purinerger Rezeptoren 5.5.4.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.4.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.5. Rolle purinerger Rezeptoren bei der Hypoxie-induzierten Sekretion von VEGF 6. Diskussion 6.1. Hypoxie induziert Priming und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 6.2. Hypoxie-induzierte Signalwege, die die Expression von NLRP3 und VEGF-A regulieren 6.2.1. Transkriptionsfaktoren 6.2.2. Intra- und extrazelluläre Signaltransduktion 6.2.3. Rolle purinerger Rezeptoren bei der hypoxischen Expression von NLRP3 und VEGF 6.3. Chemische Hypoxie vs. Kultivierung in 0,2% O2 6.4. Einfluss der Inflammasomaktivierung auf die Expression und Sekretion von VEGF in RPE-Zellen 6.5. Mögliche klinische Bedeutung der Ergebnisse für die AMD 7. Zusammenfassung 8. Literaturverzeichnis 9. Anhang 9.1. Danksagung 9.2. Abbildungsverzeichnis 9.3. Lebenslauf 9.4. Eigenständigkeitserklärung

Das NLRP3-Inflammasom spielt eine bedeutende Rolle in der Pathogenese der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD). Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Priming, als auch Aktivierung des Inflammasoms abhängig von der extrazellulären NaCl-Konzentration sind. Zahlreiche intra- und extrazelluläre Signalwege zeichnen sich dafür verantwortlich. Die Aktivierung wurde mittels Western Blot nachgewiesen und ist zeitlich stark begrenzt.:Abkürzungsverzeichnis III 1. Einleitung 6 1.1 Das retinale Pigmentepithel 6 1.2 Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) 7 1.2.1 Trockene altersabhängige Makuladegeneration (dry AMD) 8 1.2.2 Feuchte altersabhängige Makuladegeneration (wet AMD) 9 1.3 Inflammatorische Prozesse im Zusammenhang mit AMD 9 1.3.1 Aktivierung des Komplementsystems 9 1.3.2 Inflammasome als Trigger der angeborenen Abwehr 10 1.3.3 Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei trockener AMD 12 1.3.4 Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei feuchter AMD 13 1.4 Hypoxie als Risikofaktor für AMD 14 1.5 Bluthochdruck als Risikofaktor für AMD 14 2. Aufgabenstellung 15 3. Materialien und Methoden 16 3.1 Materialien 16 3.1.1 Chemikalien 16 3.1.2 Substanzen zur Zellstimulation 18 3.1.3 Geräte und sonstige Materialien 20 3.1.4 Primerpaare 22 3.1.5 Antikörper für Westernblotting 23 3.1.6 ELISA-Kits 23 3.2 Methoden 23 3.2.1 Zellkultivierung 23 3.2.2 Zellstimulation 24 3.2.3 siRNA Transfektion 24 3.2.4 RNA-Präparation 25 3.2.5 cDNA-Synthese 25 3.2.6 quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) 26 3.2.7 Agarose-Gelelektrophorese 27 3.2.8 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung nach Bradford 28 3.2.9 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 29 3.2.10 Westernblot 30 3.2.11 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 31 3.3 Statistische Auswertung 32 4. Ergebnisse 33 4.1 Expression der RNA von Inflammasomproteinen 33 4.2 Osmotische Regulation der Genexpression von Inflammasomproteinen 33 4.3 Beteiligte Intrazelluläre Signalwege an der NaCl-induzierten Expression von NLRP3 35 4.4 Einfluss Rezeptor-gesteuerter Signalwege auf die NaCl-induzierte Genexpression von NLRP3 38 4.4.1 Wachstumsfaktorrezeptoren 39 4.4.2 Purinerge Rezeptoren, Adenosinrezeptoren 40 4.5 Einfluss von Transkriptionsfaktoren auf die NaCl-induzierte NLRP3-Expression 41 4.6 Ein erhöhter NaCl-Gehalt bewirkt eine vorübergehende Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 42 4.7 Beteiligung der P2Y1–Rezeptoraktivierung an der NaCl-induzierten Expression angiogener Faktoren 43 5. Diskussion 45 5.1 Die Genexpression von Inflammasomproteinen wird osmotisch reguliert 45 5.2 Beteiligung intrazellulärer Signalwege an der NaCl-induzierten Expression von NLRP3 47 5.3 Die NaCl-stimulierte Genexpression von NLRP3 wird durch Rezeptor-gesteuerte Signalwege beeinflusst 47 5.4 Einfluss der Transkriptionsfaktoren auf die NaCl-induzierte NLRP3-Expression 48 5.5 Ein erhöhter NaCl-Gehalt bewirkt die vorübergehende Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 49 5.6 Beteiligung der P2Y1-Rezeptoraktivierung an der NaCl-induzierten Expression angiogener Faktoren 50 5.7 Klinische Relevanz der gewonnenen Erkenntnisse 50 5.8 Bedeutung der Erkenntnisse für die Pathogenese und Therapie der AMD 50 6. Zusammenfassung 54 7. Literaturverzeichnis 59 8. Anlagen 68 8.1 Abbildungsverzeichnis 68 8.2 Tabellenverzeichnis 69 8.3 Lebenslauf 70 8.4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 71 8.5 Danksagung 72 8.6 Nachweis der Teilnahme an der Vorlesung zur „Guten Wissenschaftlichen Praxis“ 73

Activation of the NOD-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome complex causes the processing and release of mature IL-1β, with mitochondria playing key roles in its assembly. An orally active NLRP3 inflammasome inhibitor would be a significant advance in therapy for IL-1β-driven diseases. To overcome both, the variability among primary immune cells and the limitations of genetic manipulation of differentiated human or murine macrophages, we developed a simplified, reliable and relevant cell-based model for studying the NLRP3 inflammasome using the undifferentiated human myelomonocytic cell line THP1. We established that undifferentiated THP1 cells are fully competent for activation of the NLRP3 inflammasome and production of IL-1β, without differentiation into macrophages. CP-456,773 is a potent and selective inhibitor of the NLRP3 inflammasome, and it is an analogue of glyburide, a sulfonylurea receptor (SUR) inhibitor. Despite the extensive experimental use of CP-456,773, its molecular target remains unknown. Here we tested the hypothesis that mitochondrial ABCb7 or ABCb10 could be the pharmacologic targets of CP-456,773. We optimized a viral shRNA transduction method for genetic manipulations in THP1 cells and generated ABCb7 and ABCb10 knockdown (KD) THP1 cells. We demonstrate that NLRP3 inflammasome activation and CP-456,773 pharmacology are not altered in ABCb7- or ABCb10-deficient THP1 cells. For ABCb10, we confirmed these results using CRISPR/CAS9-mediated ABCb10 knockout (KO) THP1 sub-lines. In studies of mitochondrial fitness, we found that a previously observed reduction in oxygen consumption rate (OCR) following nigericin treatment was completely blocked in NLRP3 KO cells. Our data demonstrating that CP-456,773 rescues the NLRP3-dependent nigericin-induced decline in OCR and protects undifferentiated THP1 cells from nigericin-induced pyroptosis are consistent with the possibility that the NLRP3 protein itself may be the molecular target of CP-456,773. Moreover, we showed that ABCb10 KO THP1 cells exhibit increased rates of basal ATP production and glycolysis, suggesting an important role for ABCb10 in mitochondrial metabolism. Finally, RNA-Seq analysis of ABCb7 and ABCb10 KD in undifferentiated THP1 cells indicate new functions for these proteins, including cell communication and migration, apoptosis and cell adhesion. Overall, our findings demonstrate that undifferentiated THP1 cells are an ideal system in which to study the NLRP3 inflammasome.

Inflammasomes are cytosolic protein platforms whose assembly/activation, in order to resolve various types of threats, can be triggered by a multitude of microbial and host derived stimuli. Their discovery was the key breakthrough in the understanding of inflammation initiation. Although beneficial in clearing microbes and restoring physiological or tissue homeostasis, aberrant or excessive stimulation of inflammasomes leads to various pathologies. The activation of NLRP3 inflammasome is associated with the physio-pathogenesis or the potentiation of the severity of so many diseases including respiratory diseases, such as asthma, COPD, COVID-19, malaria, diabetes, atherosclerosis, etc. Considering the extent of the NLRP3 inflammasome in diseases, therapies targeting the inhibition of its activation appear as a promising approach for the management of a wide range of diseases. The objective of this research work was to investigate the potential of Rwandan medicinal plants in the inhibition of the NLRP3 inflammasome. To this end, we first carried out a field survey to collect ethnobotanical information on plants used for the treatment of asthma in Rwanda. The present thesis is divided into two main parts:- The ethnobotanical study and screening of Rwandan medicinal plants with inhibitory activity on NLRP3 inflammasome activation;- The isolation and structure characterization of the active ingredients responsible for NLRP3 inflammasome inhibition, and the investigation of antiplasmodial activity of selected plants.In the first part, 19 herbal recipes were reconstituted from 61 medicinal plants based on an ethnobotanical survey. Most of these recipes exhibited significant inhibition of the NLRP3 inflammasome activation. The four recipe extracts named R03Cn and R07Kn aqueous extracts, and R10MK and R19Sz organic extracts significantly downregulated the activation of caspase-1 (more than 70% at 50 µg/ml). As R19Sz revealed the best NLRP3 inflammasome inhibitory activity and was less toxic it was hence selected for further investigations. In the second part of the work, two unstudied plants from the R19Sz recipe were submitted to a bio-guided fractionation. This led to the isolation and identification of compounds including caffeic acid, isoquercetin, kaemferol-3-O-galactoside as being the major constituents responsible for the inhibition of NLRP3 inflammasome activation in H. noldeae, and to the isolation and identification of 7-O-glucopyranosyl-isoprunetin, isoprunetin, and luteolin as the main compounds responsible for the inhibitory activity of NLRP3 inflammasome activation in E. montanum. Additionally, in vitro anti-plasmodial activities coupled to cytotoxicity assays of some bio-guided fractionation of E. montanum led to the isolation and determined antiplasmodial activity of Eucomic acid (IC50 = 0.057µg/ml), 7-O-glucopyranosyl-isoprunetin (IC50 = 0.113 µg/ml), isoprunetin (IC50 = 0.042 µg/ml), Isoluteolin (IC50: 0.121 µg/ml) as the main compounds responsible for the antiplasmodial activity with the high selectivity indexes of 6 577, 2646.7; 5264.3 and 2005.8, respectively .Overall, the present work has potentiated the role of Rwandan herbal medicines in the treatment of asthma and malaria while paving ways at the molecular and functional levels allowing to say that these plants likely act on inflammation by inhibiting the NLRP3 inflammasome activation. / Option Biologie moléculaire du Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第18425号 / 生博第305号 / 新制||生||40(附属図書館) / 31283 / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 稲葉 ｶﾖ, 教授 米原 伸, 教授 杉田 昌彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19886号 / 医博第4135号 / 新制||医||1016(附属図書館) / 32963 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 椛島 健治, 教授 松田 文彦, 教授 中畑 龍俊 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13113号 / 論医博第2131号 / 新制||医||1022(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妻木 範行, 教授 安達 泰治, 教授 開 祐司 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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