Monocytes and macrophages are mediator cells of cartilage and bone erosion in the synovia of rheumatoid arthritis (RA) patients due to secretion of the inflammatory cytokine Interleukin-1β (IL-1β). Calcium, phosphate and fetuin are liberated from the affected bone matrix, and the formation of calciproteinparticles (CPPs) is likely. IL-1β production in monocytes in vitro is stimulated by high concentrations of extracellular calcium. Additionally, the rise of extracellular calcium concentrations leads to increased macropinocytosis in mononuclear phagocytes. Flow cytometry analyses in this study show that peripheral blood monocytes from patients with RA perform more calcium stimulated macropinocytosis of the fluorescent dye calcein than monocytes from healthy donors. Stimulation of monocytes with calcium and preformed CPPs leads to more IL-1β production, quantified using ELISA, by monocytes from RA patients. Experiments with macrophages show similar results. Furthermore calcium-stimulated macropinocytosis and IL-1β secretion are significantly positively correlated. However, there was no connection of in vitro findings and the severity of RA in patients.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatoide Arthritis 1 1.1.1 Epidemiologie und Klinik der rheumatoiden Arthritis 1 1.1.2 Ätiopathogenese der rheumatoiden Arthritis 1 1.2 Monozyten und Makrophagen 3 1.2.1 Inflammasomaktivierung und Interleukin-1β-Sekretion in Monozyten und Makrophagen 4 1.2.2 Makropinozytose in Monozyten und Makrophagen 6 1.2.3 Beitrag der Monozyten und Makrophagen zur rheumatoiden Arthritis 7 1.3 Kalzium – lokale Dysregulation trotz systemischer Regulation 9 1.3.1 Entstehung von Kalziumproteinpartikeln 10 1.3.2 Kurzportrait des G-Protein-gekoppelten Kalziumrezeptors CaSR 11 2 Fragestellungen 13 3 Forschungsdesign, Material und Methoden 15 3.1 Forschungsdesign 15 3.2 Materialien 15 3.2.1 Laborgeräte 16 3.2.2 Verbrauchsmaterialien 17 3.2.3 Materialien und Chemikalien 17 3.2.4 Medien, Lösungen und Puffer 19 3.2.5 Stimulanzien und Inhibitoren 20 3.2.6 Fluoreszenzfarbstoffe 20 3.2.7 Software 20 3.3 Methoden 21 3.3.1 Separation von PBMCs mittels Ficolldichtegradientenzentrifugation 21 3.3.2 Separation von Monozyten mittels negativer Magnetseparation 22 3.3.3 Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen in Zellkulturbeuteln 23 3.3.4 Makropinozytose von Monozyten und Makrophagen in der Durchflusszytometrie 23 3.3.4.1 Makropinozytose von Calcein in Monozyten 24 3.3.4.2 Makropinozytose fluoreszenzgefärbter Kalziumproteinpartikel in Monozyten und Makrophagen 25 3.3.4.3 Inhibition der Makropinozytose in Monozyten 26 3.3.4.4 Auswertung der am Durchflusszytometer generierten Rohdaten mit FlowJo 26 3.3.5 Makropinozytose von Monozyten in der Fluoreszenzmikroskopie 28 3.3.6 Bestimmung der Interleukin-1β-Produktion von Monozyten und Makrophagen mittels ELISA 29 3.3.7 Erhebung des DAS28 33 3.3.8 Bestimmung von Laborparametern 33 3.4 Statistische Auswertung 33 4 Ergebnisse 35 4.1 Charakterisierung der Kohorten 35 4.2 Vorversuche zur Auswahl eines geeigneten Fluoreszenzfarbstoffes für die Detektion der Makropinozytose 37 4.3 Stimulation von Monozyten mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion 39 4.3.1 Kalziumstimulierte Calceinaufnahme von Monozyten 39 4.3.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion von Monozyten 44 4.4 Stimulation von Monozyten mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion unter Zugabe von Kalziumproteinpartikeln 47 4.4.1 Kalziumstimulierte Aufnahme fluoreszierender Kalziumproteinpartikel 47 4.4.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion in Monozyten unter Zugabe von Kalziumproteinpartikeln 51 4.5 Stimulation von Makrophagen mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion 53 4.5.1 Kalziumstimulierte Makropinozytose von fluoreszierenden Kalziumproteinpartikeln in Makrophagen 53 4.5.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion mit und ohne Zugabe von Kalziumproteinpartikeln in Makrophagen 54 4.5.3. Visualisierung von Monozyten und Makrophagen nach 16 Stunden Inkubation 57 4.6 Korrelation zwischen kalziumstimulierter Makropinozytose und Interleukin-1β-Sekretion 59 5 Diskussion 61 5.1 Kalziumstimulierte Makropinozytoseaktivität von Monozyten und Makrophagen 61 5.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen 64 5.2.1 Auswirkung der Phosphatkonzentration im Zellkulturmedium auf die kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen 65 5.2.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen von RA-Patienten und Kontrollprobanden 66 5.3 Zusammenhang von kalziumstimulierter Makropinozytose und Interleukin-1β-Sekretion in Monozyten und Makrophagen von RA-Patienten und Kontrollprobanden 70 5.4 Ausblick und offene Fragen 71 6 Zusammenfassung der Arbeit 73 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 88 9 Danksagung 89

Le développement d'un cancer chez un individu immunocompétent témoigne del'inefficacité de ses défenses immunitaires naturelles à entraver la progression tumorale. Larestauration ou l'induction de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces sont des enjeuxmajeurs des stratégies thérapeutiques actuelles. En plus des immunothérapies classiques,visant à activer le système immunitaire des patients contre leurs tumeurs, les thérapiesconventionnelles, telles que les chimiothérapies et la radiothérapie, peuvent avoir des effetsimmunostimulants, en parallèle de leur effet directement cytotoxique sur les cellulestumorales. Parmi celles-ci, les anthracyclines, l'oxaliplatine et la radiothérapie sontnotamment capables d'induire une mort cellulaire immunogène. L'efficacité thérapeutique deces traitements dépend de l'activation de lymphocytes T (LT) CD8 anti-tumoraux,producteurs d'interféron-gamma (IFN-γ). En utilisant des modèles murins de tumeurstransplantées, nous montrons que le traitement des cellules tumorales par des droguesimmunogènes induit la libération d'adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extracellulaire.Ce signal de danger endogène se lie à son récepteur P2RX7 sur les cellulesdendritiques et permet la formation de l'inflammasome NLRP3/ASC/pro-caspase 1,conduisant à l'activation protéolytique de la caspase 1, qui active la pro-interleukine-1β (pro-IL-1β) en interleukine-1β (IL-1β). L'IL-1β peut directement agir sur les LT CD8 pourfaciliter leur polarisation vers un phénotype de lymphocytes T cytotoxiques de type 1 (Tc1).De plus, le traitement de tumeurs établies par des drogues immunogènes induit uneproduction d'IL-17A (IL-17) dans le lit tumoral, au cours de la première semaine suivant letraitement. Les LT gamma delta (LTγδ) sont les principaux producteurs de cette cytokinedans nos modèles. Ces cellules s'accumulent transitoirement dans la tumeur dès le troisièmejour suivant le traitement et leur taux est parfaitement corrélé à celui des LT CD8 producteursd'IFN-γ tumoraux. Comme l'IFN-γ, l'IL-17 et les LTγδ sont nécessaires à l'efficacitéthérapeutique des drogues immunogènes. L'IL-1β produite par les cellules dendritiquesexposées à des corps apoptotiques immunogènes stimule directement la production d'IL-17par les LTγδ. Ces travaux ont contribué à identifier l'ATP extra-cellulaire comme undéterminant moléculaire de l'immunogénicité des cellules tumorales exposées à certainesthérapies anti-cancéreuses conventionnelles. De plus, nous montrons que les traitementscytotoxiques classiques peuvent moduler l'environnement immunitaire dans le lit tumoral, etcontribuer à remplacer une inflammation chronique et immunosuppressive en uneinflammation aigüe et immunogène. L'étude des interactions entre le système immunitaire etles thérapies anti-cancéreuses conventionnelles est nécessaire pour utiliser ces traitements demanière plus rationnelle, en les combinant par exemple à des immunothérapies plusclassiques.

Hyperhomocysteinemia (hHcys) is a widely known pathogenic factor in the progression of end-stage renal disease (ESRD) and it is also associated with an increased risk for injurious cardiovascular pathologies during ESRD. HHcys is linked to the formation and activation of the NOD-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome, characterized as a critical early mechanism initiating the inflammatory response. NADPH oxidase (NOX)-derived reactive oxygen species (ROS) mediate the activation of the NLRP3 inflammasome in podocytes in response to elevated levels of homocysteine (Hcys) in vitro and in vivo. However, it remains unknown how NLRP3 inflammasome activation is triggered by NOX. The aim of the present study sought to determine the signaling cascade that triggers glomerular injury and sclerosis during hHcys mediated by Vav2, a guanine nucleotide exchange factor (GNEF). Using both genetic and pharmacological interventions of Vav2, we first tested whether this GNEF is involved in hHcys-induced NLRP3 inflammasome activation in podocytes by its role in activation of the Rac-1-NOX complex. Further, we explored whether pharmacological targeting of Vav2 activation may regulate NLRP3 inflammasome signaling pathway during hHcys-induced glomerular injury. We found that mice with hHcys (on the FF diet) or oncoVav2 (a constitutively active form of Vav2) transfection in the kidney exhibited increased colocalization of NLRP3 with apoptosis-associated speck-like protein (ASC) or caspase-1 and elevated IL-1β levels in glomeruli, indicating the formation and activation of the NLRP3 inflammasome. This glomerular NLRP3 inflammasome activation was accompanied by podocyte dysfunction and glomerular injury, even sclerosis. Local transfection of Vav2 shRNA plasmids significantly attenuated hHcys-induced NLRP3 inflammasome activation, podocyte injury, and glomerular sclerosis. In cultured podocytes, Hcys treatment and oncoVav2 transfection increased NLRP3 inflammasome formation and activation. This NLRP3 activation was inhibited by Vav2 shRNA, associated with reduction of Rac-1 activity and ROS production. Administration of NSC23766, a Rac-1 inhibitor substantially attenuated inflammasome formation, desmin expression and decreased podocin expression in glomeruli of hHcys mice. These results suggest that elevated Hcys levels activate Vav2 and thereby increase NOX activity, leading to ROS production. ROS trigger NLRP3 inflammasome activation, podocyte dysfunction and glomerular injury. Therefore, the present study defines a novel mechanism underlying hHcys-induced NLRP3 inflammasome activation and its progression to ESRD.

Inflammation is a biological defence mechanism applied by living organisms against foreign invaders. In the response to DAMPs and PAMPs, organisms use inflammatory multi-protein complexes to fight the attackers. The most studied inflammasome proteins are NLRP3, ASC and Caspase-1. This study is aimed at understanding the role of NEK7 protein in the NLRP3 inflammasome’s activation, using CRISPR/Cas9 system. To determine the effect of CRISPR/Cas9 and transfection, mRNA expression was analyzed. The results obtained suggest that neither the transfection nor the NEK7 protein knockout have sufficiently worked. This study could not experimentally establish that NEK7 triggers NLRP3 inflammasome activation because ELISA was not conducted to verify the levels of cytokines emitted, due to there being no statistical differences between the samples. Above all, the research question in this thesis project was not answered because the instability of the ACTB reference gene negatively influenced the results. However, previous related studies conclude that NEK7 plays a crucial role in the activation of the NLRP3 inflammasome.

No description available.

The inflammasome complex is a multiprotein complex that may play a role in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD) by secreting the inflammatory cytokines interleukin (IL)-1β and IL-18, and inducing pyroptosis, as a response to signals through several inflammasome sensors. This study looked at the expression of several inflammasome components in the ileum and colon of patients suffering from IBD. The inflammasome sensors NLRP1, NLRP3, AIM2 and pyrin were upregulated in whole intestinal tissue of IBD patients, particularly in the colon. NLRP6 expression was increased in the colon of Crohn's disease patients, but not ulcerative colitis patients relative to colon of controls, and was reduced in the ileum of Crohn's disease patients compared to control ileum. Expression of caspase-1 and IL-1β, but not IL-18, were also increased in ileum and colon tissue from Crohn's patients. To identify the cell type where inflammasome expression was altered in Crohn’s disease, transcription of inflammasome subunits in intestinal tissue enriched for epithelial cells or lamina propria (LP) cells was analysed. These analyses indicated that LP cells have greater expression of the inflammasome sensors NLRP1, NLRP3, AIM2 and pyrin relative to epithelial cells, both during disease and in control tissue. Moreover, LP cells from Crohn’s patients have higher expression level of NLRP1, AIM2 and pyrin than LP cells from controls. In contrast the inflammasome sensor NLRP6 was more highly expressed by epithelial cells relative to LP cells in general, and NLRP6 expression in LP cells from IBD patients was lower than that observed in LP cells from controls. The observed differential expression of inflammasome components in controls versus IBD intestine and in different cellular fractions of intestinal tissue highlight the importance of understanding the role of the inflammasome in IBD and hints at the possibility of targeting the inflammasome pathway as a future treatment strategy.

L'inflammation joue un rôle clé dans de nombreuses pathologies, telles que les maladies inflammatoires chroniques, les désordres métaboliques et le cancer. L'un de ses médiateurs le plus puissant est l'interleukine-1β (IL-1β), qui est une cytokine pro-inflammatoire participant à tous les stades de l'inflammation et de l'immunité. Son activation est régulée par un complexe multi-protéique nommé inflammasome, dont la caspase-1 active en découlant est responsable du clivage et de la maturation de l'IL-1β. Huit types d'inflammasomes activant et clivant la pro-caspase-1 ont été identifiés et contiennent tous la protéine ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). Les inflammasomes partagent un signal intracellulaire commun et le mécanisme menant à leur assemblage et leur activation n'est pas totalement élucidé. L'utilisation de la lignée cellulaire humaine monocytaire, THP-1, différenciée en macrophages grâce à un ester de phorbol, le TPA, a permis la mise en place d'un modèle d'étude de modulateurs de l'inflammasome en conditions stériles. Ce modèle a permis l'étude des mécanismes impliqués suite à des signaux issus de l'inflammation chronique, tels que l'ATP et les espèces réactives de l'oxygène (ROS). Ce travail montre qu'il existe une synergie entre ATP et ROS, qui agissent grâce à une boucle d'activation impliquant probablement plusieurs inflammasomes, dont NLRP3. Des donneurs de NO connus (trinitrine et isosorbide dinitrate) ou nouveau (dérivé de purine) ont montré une activité anti-inflammatoire. D'autres composés ont été identifiés comme de potentiels inhibiteurs d'inflammasome (extraits de dattes et dérivé de purine portant un acide lipoïque)

Metal ions released from implantable biomaterials have been associated with adverse biological reactions that can limit implant longevity. Previous studies have shown that, in macrophages, Co2+, Cr3+, and Ni2+ can activate the NLR family pyrin domain-containing protein 3 (NLPR3) inflammasome, which is responsible for interleukin(IL)-1β production through caspase-1. Furthermore, these ions are known to induce oxidative stress, and inflammasome priming is known to involve nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) signaling. However, the mechanisms of inflammasome activation by metal ions remain largely unknown. The objectives of this thesis were to determine if, in macrophages: 1. IL-1β release induced by metal ions is caspase-1-dependent; 2. caspase-1 activation and IL-1β release induced by metal ions are oxidative stress-dependent; and 3. IL-1β release induced by metal ions is NF-κB signaling pathway-dependent. Lipopolysaccharide (LPS)-primed murine bone-marrow-derived macrophages were exposed to Co2+, Cr3+, or Ni2+, with or without an inhibitor of caspase-1, oxidative stress, or NF-κB. Culture supernatants were analyzed for active caspase-1 (immunoblotting) and/or IL-1β (ELISA). Overall, results showed that while both Cr3+ and Ni2+ may be inducing inflammasome activation, Cr3+ is likely a more potent activator, acting through oxidative stress and the NF-κB signaling pathway. Further elucidation of the activation mechanisms may facilitate the development of therapeutic approaches to modulate the inflammatory response to metal ions, and thereby increase implant longevity.

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie neurodégénérative de la rétine, est considérée comme la principale cause de perte de vision chez les personnes âgées. Le CD36 est un récepteur éboueur (scavenger) exprimé à la surface des phagocytes mononucléés et de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), qui agit également comme corécepteur de l’hétérodimère des récepteurs de type Toll-like (TLR) 2/6 dans l’induction de l’inflammation. Dans la DMLA, l’activation du CD36 favorise l’internalisation des lipides oxydés par les cellules de l’EPR, le recrutement et l’accumulation des phagocytes mononucléés (microglie, monocytes/macrophages), ainsi que l’induction de la réponse inflammatoire au niveau sous-rétinien. L’identification du CD36 comme récepteur de peptides synthétiques de la famille des sécrétines de l’hormone de croissance (GHRPs) par notre laboratoire, nous a conduit au développement de ligands plus sélectifs pour ce récepteur, qui ont été étudiés dans le contexte des maladies inflammatoires chroniques liées aux macrophages telle que l’athérosclérose. Étant donné les similitudes observées entre la pathologie de l’athérosclérose et de la DMLA, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle les azapeptides, comme ligands du CD36, auraient des effets protecteurs contre la DMLA en modulant la réponse inflammatoire. Ainsi, l’objectif général de ce projet de doctorat était d’évaluer les effets anti-inflammatoires et immunomodulateurs des azapeptides, comme ligands du CD36, et d’élucider leurs mécanismes d’action au niveau des macrophages ainsi que dans des modèles murins de DMLA. Le premier objectif spécifique de cette thèse était de déterminer l’effet de l’azapeptide MPE-001 dans la modulation de la réponse inflammatoire cellulaire médiée par le TLR2 et les voies de signalisation associées. Pour ce faire, des macrophages péritonéaux de souris C57BL/6 ou déficientes en Cd36 (Cd36-/-) ont été stimulés avec des agonistes du TLR2. Le traitement avec le MPE-001 a induit une diminution significative de la production de cytokines pro-inflammatoires, tels que le TNFa, l’IL-6, l’IL-12 et l’IL-1b et la chimiokine CCL2, de même qu’une inhibition des voies de signalisation nuclear factor kB (NFkB), c-Jun N-terminal kinase (JNK) et P38. Ce premier objectif nous a permis de mettre en évidence les effets anti-inflammatoires du MPE-001 et son mécanisme d’action, en modulant la réponse inflammatoire médiée par l’hétérodimère TLR2/6. Afin de déterminer les effets du MPE-001 sur la modulation de la réponse inflammatoire chez un modèle murin de DMLA, les souris C57BL/6, Cd36-/-, Cx3Cr1-/- et Cx3Cr1-/-/Cd36-/- ont été soumises à un stress photo-oxydatif induit par la lumière bleue pendant 5 jours. Une journée après le début de l’illumination, les souris ont reçu une injection s.c. de MPE-001 répétée pendant 7 jours. Le modèle murin de Cx3Cr1-/- est connue pour exacerber la réponse inflammatoire et induire l’accumulation de phagocytes mononucléés, plus particulièrement les microglies dans la rétine. Les montages à plat des coupes des yeux prélevés ont montré que le traitement au MPE-001 a engendré une diminution importante de 60% de l’accumulation de phagocytes mononucléés dans l’espace sous-rétinien, de même qu’une diminution des marqueurs inflammatoires (iNOS, IL-12), ainsi que la préservation de l’intégrité et de la fonction des photorécepteurs. Ce deuxième objectif nous a permis de démontrer les effets in vivo du MPE-001, en entraînant une diminution de l’accumulation de phagocytes mononucléés sous-rétiniens et la préservation des photorécepteurs. Étant donné les effets inhibiteurs du MPE-001 sur la sécrétion d’IL-1b, notre troisième objectif était d’investiguer l’effet du MPE-001 sur la régulation de l’inflammasome au niveau des macrophages. Nous avons montré que le MPE-001 entraînait une diminution de la réponse inflammatoire en inhibant la sécrétion d’IL-1b au niveau des macrophages, tout en diminuant l’expression de nucleotide-binding domain leucin-rich repeat and pyrin-containing receptor 3 (NLRP3) et de la caspase-1. Ce troisième objectif nous a permis de montrer que le MPE-001 a modulé le profil inflammatoire des macrophages en atténuant l’inflammasome NLRP3. Étant donné que le phénotype des macrophages est régulé par leur métabolisme, notre 4e et dernier objectif était de déterminer si les effets anti-inflammatoires du MPE-001 pouvaient influencer la polarisation des macrophages. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de bone marrow-derived macrophages (BMDM) induits en phénotype pro-inflammatoire M1 ou anti-inflammatoire M2. Bien que le MPE-001 n’ait eu aucune influence sur les marqueurs de surfaces phénotypiques, nous avons montré que ce dernier induisait un changement métabolique des macrophages pro-inflammatoires M1, en inhibant la glycolyse et en favorisant la phosphorylation oxydative, de façon dépendante du récepteur nucléaire peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ). En conclusion, les travaux de cette thèse ont montré que l’azapeptide MPE-001 possède de puissants effets anti-inflammatoires et immunomodulateurs au niveau des macrophages dans un contexte d’inflammation rétinienne, pouvant constituer une nouvelle approche thérapeutique prometteuse pour le traitement de la DMLA. / Age-related macular degeneration (AMD), a neurodegenerative disease of the retina, is considered to be the main cause of vision loss in the elderly. CD36 is a scavenger receptor expressed on the surface of mononuclear phagocytes and retinal pigment epithelium (RPE), which also acts as a co-receptor for the Toll-like receptor (TLR)-2/6 heterodimer in the induction of inflammation. In AMD, CD36 activation promotes the internalization of oxidized lipids by RPE cells, the recruitment and accumulation of mononuclear phagocytes (microglia, monocytes / macrophages), as well as the induction of the inflammatory response at the subretinal level. The identification of CD36 as a receptor for synthetic peptides of the growth hormone releasing-peptides (GHRP) by our laboratory, led us to the development of more selective ligands for this receptor, which have been studied in the context of chronic inflammatory diseases related to macrophages such as atherosclerosis. Given the similarities observed between the pathology of atherosclerosis and AMD, we hypothesized that azapeptides, as CD36 ligands, protect against AMD by modulating the inflammatory response. Thus, the general objective of this doctoral project was to characterize the anti-inflammatory and immunomodulatory effects of azapeptides, as CD36 ligands, and to elucidate their mechanisms of action on macrophages as well as in murine models of AMD. The first specific objective of this thesis was to determine the effect of the azapeptide MPE-001 in the modulation of the cellular TLR2-mediated inflammatory response and the associated signaling pathways. To do so, peritoneal macrophages from C57BL/6 or Cd36-deficient (Cd36-/-) mice were stimulated with TLR2 agonists. Treatment with MPE-001 induced a significant decrease in the production of pro-inflammatory cytokines, such as TNFa, IL-6, IL-12 and IL-1b and the chemokine CCL2, as well as inhibition of the nuclear factor k B (NF kB), N-terminal c-Jun kinase (JNK) and P38 signaling pathways. This first objective allows us to highlight the anti-inflammatory effects of MPE-001 and its mechanism of action, by modulating the inflammatory response mediated by the TLR2/6 heterodimer. In order to determine the effects of MPE-001 on the modulation of the inflammatory response in a mouse model of AMD, the murine models C57BL/6, Cd36-/-, Cx3Cr1-/- and Cx3xr1-/-/Cd36-/- were subjected to photo-oxidative stress induced by blue light for 5 days. One day after the start of illumination, the mice received a repeated s.c. injection of MPE-001 for 7 days. The mouse model of Cx3Cr1-/- is known to exacerbate the inflammatory response and induce the accumulation of mononuclear phagocytes, more specifically microglia, in the retina. Flat mounts from collected eyes showed that MPE-001 treatment caused a significant 60% decrease in the accumulation of mononuclear phagocytes in the subretinal space, as well as a reduction in inflammatory markers (iNOS, IL-12), with the preservation of photoreceptor integrity and function. This second objective allows us to demonstrate the in vivo effects of MPE-001, leading to a decrease in the accumulation of sub-retinal mononuclear phagocytes and the preservation of photoreceptors. Given the inhibitory effects of MPE-001 on IL-1b secretion, our third objective was to investigate the effect of MPE-001 on inflammasome regulation in macrophages. We have shown that MPE-001 decreases the inflammatory response by inhibiting the secretion of IL-1b in macrophages, while decreasing the expression of nucleotide-binding domain leucin-rich repeat and pyrin-containing receptor 3 (NLRP3) and caspase-1. This third objective allows us to show that MPE-001 modulates the inflammatory profile of macrophages by attenuating the NLRP3 inflammasome. Since macrophage phenotypes are regulated by their metabolism, our fourth and final objective was to determine whether the anti-inflammatory effects of MPE-001 could influence the polarization of macrophages. To do so, we used a bone marrow-derived macrophages (BMDM) model induced to pro-inflammatory M1 or anti-inflammatory M2 phenotype. Although MPE-001 had no influence on phenotypic markers, we have shown that the latter induces a metabolic shift of the pro-inflammatory M1 macrophages, by inhibiting glycolysis and promoting oxidative phosphorylation of macrophages, in a peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-g)-dependent manner. In conclusion, the work conducted in this thesis showed that the azapeptide MPE-001 has powerful anti-inflammatory and immunomodulatory effects on macrophages in a context of retinal inflammation, which could constitute a promising new therapeutic approach for the treatment of AMD.

No description available.