O microrganismo alvo deste estudo pertence ao gênero Naegleria, que compreende amebas de vida livre amplamente distribuídas ao redor do mundo. Estas possuem estratégias de adaptação em condições de temperatura e pH que envolvem a diferenciação das células para as formas flagelada e cística. A via de biossíntese e incorporação do aminoácido selenocisteína (Sec, U) em N. gruberi foi descrita e, devido à incorporação co-traducional deste aminoácido em resposta a um códon UGA em fase de leitura, possui diversos fatores específicos que tornam a via alvo de estudos moleculares. Dentre os genes identificados, destaca-se o de selenofosfato sintetase (SPS), uma proteína funcionalmente dimérica envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, essencial à síntese de Sec. Diferindo das SPSs homólogas, em N. gruberi a proteína (NgSPS2) é codificada em fusão N-terminal com uma metiltransferase e totaliza 737 aminoácidos. Esta descoberta motivou os objetivos da pesquisa baseada na investigação celular de NgSPS2 nativa nas três diferentes formas de vida de N. gruberi através de ensaios imunoenzimáticos, e a caracterização bioquímica e biofísica da proteína recombinante. A análise dos resultados obtidos por Western blot indicaram que NgSPS2, in vivo, apresenta os dois domínios metiltransferase e SPS separados após a tradução para uma cultura amebóide e, após alcançar a diferenciação de cada uma das formas isoladamente, este resultado se confirmou também para cistos e flagelados. A investigação de N. gruberi em cultura indica o aumento na atividade da via de síntese de selenoproteínas na presença de selênio conferindo resistência às condições de estresse oxidativo. A caracterização bioquímica do domínio C-terminal de NgSPS2, por cromatografia de exclusão molecular analítica e eletroforese não desnaturante, revelou predominância de dímeros em solução, coerente com SPSs homólogas. Os testes de cristalização não resultaram na obtenção de cristais, porém a proteólise limitada permitiu selecionar tripsina como potencial para a clivagem do N terminal do N terminal flexível. A conservação dos resíduos de aminoácidos funcionais em NgSPS2.CTD e seu comportamento em solução confirmam a obrigatoriedade da união de cada monômero e, por isso o domínio metiltransferase adicional pode ser desfavorável à montagem do dímero e in vivo a fusão é desfeita após a tradução. / The target microorganism of the present study belongs to the Naegleria genus. This genus includes free life amoebas widely distributed around the world that, in order to survive in bad temperature and pH environments, developed an adaptive strategy consisting of cells differentiation to flagellate and cystic form. The biosynthesis and incorporation of selenocysteine amino acid (Sec, U) in N. gruberi has been described and, because of the co-translational incorporation of this amino acid in response to a UGA codon during the reading step, this process has several specific factors which make it a target for molecular studies. Among the identified genes, we can highlight the one which encodes the selenophosphate synthetase that is involved in the catalytic conversion of selenite and adenosine triphosphate into selenium phosphate, a necessary step to the Sec synthesis that uses selenide and ATP to produce selenophosphate. SPS from N.gruberi is encoded with an methyltransferase N-terminal fused with the typical SPS C-terminal domain, an open read frame that contains 2211 nucleotides encoding 737 amino acids. This discovery has motivated the initial aims of this project, based on the cellular investigation of SPS2, native on the three different form lifes of N. gruberi, through immunoenzymatic assays, besides a study with the recombinant protein to clarify the biochemistry and biophysics features of NgSPS2. The results indicated that the protein do not keep both domains fused after the translation process, suggesting that they need to be separated to perform their biological function. The investigation of the N. gruberi culture revealed that the cells become less sensitive to stress agent in the presence of selenium, which seems to be correlated with the increasing activity of the selenoprotein synthesis. The biochemistry characterization of the NgSPS2 C-terminal domain, using size exclusion chromatography and electrophoresis under non-denaturing conditions revealed the predominance of dimers in solution according with the typical homologous SPS oligomeric state. The crystallization tests have not resulted in crystal growth; however, the limited proteolysis may be an alternative to optimize the crystallization process. These studies may enlarge the knowledge about the biosynthesis of Sec. in N. gruberi.

O vigésimo primeiro aminoácido, selenocisteína (Sec), representa a principal forma biológica disponível de selênio, micronutriente essencial. A Sec possui vias de síntese distintas para bactérias, arqueobactérias e eucariotos, justificando estudos que avaliem sua particular consequência evolutiva. Naegleria gruberi, alvo do presente estudo, é um organismo modelo bastante interessante para compreensão das vias de síntese e incorporação do aminoácido em um dos três domínios da vida, por tratar-se de um eucarioto basal. A presença da via de biossíntese e incorporação de selenocisteína em N. gruberi foi descrita. Dentre os genes identificados, destaca-se uma Selenofosfato Sintetase ou SPS. A SPS possui um papel central na via de biossíntese de Sec, estando envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, forma orgânica de selênio. A SPS de N. gruberi apresenta dois domínios distintos: o domínio C-terminal, que possui identidade com SPSs de bactérias (SelD) e o domínio N-terminal, similar a metiltransferases de eucariotos. Além disso, foi identificado no protozoário um análogo ao gene SelC de procariotos, responsável pela expressão de tRNASec. SelC promove a inserção da selenocisteína em selenoproteínas no códon UGA, que na maioria das vezes é interpretado como códon de parada de tradução em mRNAs. Além deste, dados experimentais apontam para a existência de outro tRNA traduzindo o códon UGA, sugerindo duas possíveis hipóteses: trata-se de um tRNASec adicional para incorporação de Sec, ou de um tRNA carreador de outro aminoácido, com a capacidade de reconhecer o mesmo códon. Este estudo realizou a expressão e purificação do domínio N-terminal da proteína SPS de Naegleria gruberi e procurou realizar estudos imunoquímicos com a proteína a partir da produção de anticorpos policlonais. Além disso, foram realizados o isolamento e purificação das duas diferentes isoformas de tRNASec identificadas no organismo a partir de ferramentas de bioinformática. Por último, foi dado início à uma investigação para determinar genes de referência para a realização de experimentos de qPCR em N. gruberi. Estes resultados contribuem para o entendimento da via de biossíntese de Sec em eucariotos e sua importância para o metabolismo celular. / The twenty-first amino acid, selenocysteine (Sec), represents the main biologically available form of selenium, an essential micronutrient, and shows different synthesis pathways for bacteria, archeobacteria and eukaryotes, justifying new studies to evaluate its particular evolutionary consequence. Naegleria gruberi is an extremely interesting model organism for the comprehension of the amino acid´s synthesis and incorporation pathways in one of the three domains of life, due to its position in the evolutionary scale as a basal eukaryote. The presence of the selenocysteine´s biosynthesis and insertion pathways in N. gruberi has been described. Amongst the identified genes, a Selenophosphate Synthetase or SPS has a central role. SPS acts on the biosynthesis of Sec, catalyzing the conversion of selenide and adenosine 5´-triphosphate (ATP) into selenophosphate, an organic form of selenium. N. gruberi´s SPS shows two distinct domains: a C-terminal domain having identity with bacterial SPSs (SelD) and a N-terminal domain, similar to eukaryotic methyltransferases. Besides that, an analogous to the SelC gene of prokaryotes was identified in the protozoan. SelC promotes the insertion of selenocysteine in selenoproteins on the UGA codon, a codon which is most of the time interpreted as a stop codon in mRNAs. Experimental data show evidence for the existence of yet another tRNA translating the UGA codon, suggesting two possible hypotheses: this tRNA is either the carrier of another amino acid with the capacity of recognizing the same codon, or an additional tRNA for Sec incorporation with different characteristics. The experiments performed for this study were able to heterologously express and purify the N-terminal domain of Naegleria gruberi´s SPS and pursued to characterize the protein through immunoassays using polyclonal antibodies. More experiments were run to isolate and purify the two different isoforms of tRNA identified in the organism using bioinformatics tools. Finally, an investigation was started aiming at determining reference genes for qPCR experiments with N. gruberi. These results contribute to a better understanding of the Sec´s biosynthesis and insertion pathways in eukaryotes and their importance for the cellular metabolism.

O microrganismo alvo deste estudo pertence ao gênero Naegleria, que compreende amebas de vida livre amplamente distribuídas ao redor do mundo. Estas possuem estratégias de adaptação em condições de temperatura e pH que envolvem a diferenciação das células para as formas flagelada e cística. A via de biossíntese e incorporação do aminoácido selenocisteína (Sec, U) em N. gruberi foi descrita e, devido à incorporação co-traducional deste aminoácido em resposta a um códon UGA em fase de leitura, possui diversos fatores específicos que tornam a via alvo de estudos moleculares. Dentre os genes identificados, destaca-se o de selenofosfato sintetase (SPS), uma proteína funcionalmente dimérica envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, essencial à síntese de Sec. Diferindo das SPSs homólogas, em N. gruberi a proteína (NgSPS2) é codificada em fusão N-terminal com uma metiltransferase e totaliza 737 aminoácidos. Esta descoberta motivou os objetivos da pesquisa baseada na investigação celular de NgSPS2 nativa nas três diferentes formas de vida de N. gruberi através de ensaios imunoenzimáticos, e a caracterização bioquímica e biofísica da proteína recombinante. A análise dos resultados obtidos por Western blot indicaram que NgSPS2, in vivo, apresenta os dois domínios metiltransferase e SPS separados após a tradução para uma cultura amebóide e, após alcançar a diferenciação de cada uma das formas isoladamente, este resultado se confirmou também para cistos e flagelados. A investigação de N. gruberi em cultura indica o aumento na atividade da via de síntese de selenoproteínas na presença de selênio conferindo resistência às condições de estresse oxidativo. A caracterização bioquímica do domínio C-terminal de NgSPS2, por cromatografia de exclusão molecular analítica e eletroforese não desnaturante, revelou predominância de dímeros em solução, coerente com SPSs homólogas. Os testes de cristalização não resultaram na obtenção de cristais, porém a proteólise limitada permitiu selecionar tripsina como potencial para a clivagem do N terminal do N terminal flexível. A conservação dos resíduos de aminoácidos funcionais em NgSPS2.CTD e seu comportamento em solução confirmam a obrigatoriedade da união de cada monômero e, por isso o domínio metiltransferase adicional pode ser desfavorável à montagem do dímero e in vivo a fusão é desfeita após a tradução. / The target microorganism of the present study belongs to the Naegleria genus. This genus includes free life amoebas widely distributed around the world that, in order to survive in bad temperature and pH environments, developed an adaptive strategy consisting of cells differentiation to flagellate and cystic form. The biosynthesis and incorporation of selenocysteine amino acid (Sec, U) in N. gruberi has been described and, because of the co-translational incorporation of this amino acid in response to a UGA codon during the reading step, this process has several specific factors which make it a target for molecular studies. Among the identified genes, we can highlight the one which encodes the selenophosphate synthetase that is involved in the catalytic conversion of selenite and adenosine triphosphate into selenium phosphate, a necessary step to the Sec synthesis that uses selenide and ATP to produce selenophosphate. SPS from N.gruberi is encoded with an methyltransferase N-terminal fused with the typical SPS C-terminal domain, an open read frame that contains 2211 nucleotides encoding 737 amino acids. This discovery has motivated the initial aims of this project, based on the cellular investigation of SPS2, native on the three different form lifes of N. gruberi, through immunoenzymatic assays, besides a study with the recombinant protein to clarify the biochemistry and biophysics features of NgSPS2. The results indicated that the protein do not keep both domains fused after the translation process, suggesting that they need to be separated to perform their biological function. The investigation of the N. gruberi culture revealed that the cells become less sensitive to stress agent in the presence of selenium, which seems to be correlated with the increasing activity of the selenoprotein synthesis. The biochemistry characterization of the NgSPS2 C-terminal domain, using size exclusion chromatography and electrophoresis under non-denaturing conditions revealed the predominance of dimers in solution according with the typical homologous SPS oligomeric state. The crystallization tests have not resulted in crystal growth; however, the limited proteolysis may be an alternative to optimize the crystallization process. These studies may enlarge the knowledge about the biosynthesis of Sec. in N. gruberi.

O vigésimo primeiro aminoácido, selenocisteína (Sec), representa a principal forma biológica disponível de selênio, micronutriente essencial. A Sec possui vias de síntese distintas para bactérias, arqueobactérias e eucariotos, justificando estudos que avaliem sua particular consequência evolutiva. Naegleria gruberi, alvo do presente estudo, é um organismo modelo bastante interessante para compreensão das vias de síntese e incorporação do aminoácido em um dos três domínios da vida, por tratar-se de um eucarioto basal. A presença da via de biossíntese e incorporação de selenocisteína em N. gruberi foi descrita. Dentre os genes identificados, destaca-se uma Selenofosfato Sintetase ou SPS. A SPS possui um papel central na via de biossíntese de Sec, estando envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, forma orgânica de selênio. A SPS de N. gruberi apresenta dois domínios distintos: o domínio C-terminal, que possui identidade com SPSs de bactérias (SelD) e o domínio N-terminal, similar a metiltransferases de eucariotos. Além disso, foi identificado no protozoário um análogo ao gene SelC de procariotos, responsável pela expressão de tRNASec. SelC promove a inserção da selenocisteína em selenoproteínas no códon UGA, que na maioria das vezes é interpretado como códon de parada de tradução em mRNAs. Além deste, dados experimentais apontam para a existência de outro tRNA traduzindo o códon UGA, sugerindo duas possíveis hipóteses: trata-se de um tRNASec adicional para incorporação de Sec, ou de um tRNA carreador de outro aminoácido, com a capacidade de reconhecer o mesmo códon. Este estudo realizou a expressão e purificação do domínio N-terminal da proteína SPS de Naegleria gruberi e procurou realizar estudos imunoquímicos com a proteína a partir da produção de anticorpos policlonais. Além disso, foram realizados o isolamento e purificação das duas diferentes isoformas de tRNASec identificadas no organismo a partir de ferramentas de bioinformática. Por último, foi dado início à uma investigação para determinar genes de referência para a realização de experimentos de qPCR em N. gruberi. Estes resultados contribuem para o entendimento da via de biossíntese de Sec em eucariotos e sua importância para o metabolismo celular. / The twenty-first amino acid, selenocysteine (Sec), represents the main biologically available form of selenium, an essential micronutrient, and shows different synthesis pathways for bacteria, archeobacteria and eukaryotes, justifying new studies to evaluate its particular evolutionary consequence. Naegleria gruberi is an extremely interesting model organism for the comprehension of the amino acid´s synthesis and incorporation pathways in one of the three domains of life, due to its position in the evolutionary scale as a basal eukaryote. The presence of the selenocysteine´s biosynthesis and insertion pathways in N. gruberi has been described. Amongst the identified genes, a Selenophosphate Synthetase or SPS has a central role. SPS acts on the biosynthesis of Sec, catalyzing the conversion of selenide and adenosine 5´-triphosphate (ATP) into selenophosphate, an organic form of selenium. N. gruberi´s SPS shows two distinct domains: a C-terminal domain having identity with bacterial SPSs (SelD) and a N-terminal domain, similar to eukaryotic methyltransferases. Besides that, an analogous to the SelC gene of prokaryotes was identified in the protozoan. SelC promotes the insertion of selenocysteine in selenoproteins on the UGA codon, a codon which is most of the time interpreted as a stop codon in mRNAs. Experimental data show evidence for the existence of yet another tRNA translating the UGA codon, suggesting two possible hypotheses: this tRNA is either the carrier of another amino acid with the capacity of recognizing the same codon, or an additional tRNA for Sec incorporation with different characteristics. The experiments performed for this study were able to heterologously express and purify the N-terminal domain of Naegleria gruberi´s SPS and pursued to characterize the protein through immunoassays using polyclonal antibodies. More experiments were run to isolate and purify the two different isoforms of tRNA identified in the organism using bioinformatics tools. Finally, an investigation was started aiming at determining reference genes for qPCR experiments with N. gruberi. These results contribute to a better understanding of the Sec´s biosynthesis and insertion pathways in eukaryotes and their importance for the cellular metabolism.

We study the evolution of simple cells that are equipped with a genome, a rudimentary gene regulation network at transcription level and two classes of functional genes: motion effectors allow the cell to move in response to nutrient gradients while nutrient importers are required to actually feed from the environment. The model is inspired by the protist Naegleria gruberi which can switch between a feeding and dividing amoeboid state and a mobile agellate state depending on environmental conditions. Simulation results demonstrate how selection in a variable environment affects the gene number and effciency so that the cells can rapidly switch from one expression regime to the other depending on the external conditions.

<p> The rhizoplast (flagellar rootlet) of the amebaflagellate Naegleria gruberi has been studied in sectioned cells and in the isolated state. Since the organelle arises, as do the other components of the flagellar apparatus, through a de novo assembly, and possibly a de novo synthesis during the ameba-to-flagellate transformation, the characterization of the rhizoplast's nature may be of importance in the study of a differentiation process in a eukaryotic cell. </p> <p> Structurally, the organelle is a periodically-banded, longitudinally fibrous structure arising in the basal body area of the cell and tapering towards its end in the cytoplasm adjacent to the nucleus. The attachment of the organelle to the basal bodies is mediated through the interbasal body connector and the rhizoplast-associated microtubules. Attachment to the nucleus is unlikely as it has never been unequivocally demonstrated in electron-microscope studies. </p> <p> Rhizoplasts exhibit a distinct periodicity composed of alternating electron-opaque and electron-transparent bands. Variations in the width of both bands has been observed and is discussed in terms of the possible role of the organelle as an anchor and stapilizing structure for the flagellar complex, with contractility and elasticity being discussed as possible mechanisms of this variation. </p> <p> An isolation and partial purification of the rhizoplast has been achieved and is described with reference to its possible use as a tool in the biochemical analysis of the rhizoplast. An aggregation phenomenon of dissolved rhizoplast material by divalent cations has been observed and is discussed, keeping in mind the similar phenomena exhibited by the contractile proteins paramyosin and tropomyosino Collagen, which exhibits a reaggregation from solution, is discussed and tentatively discarded as a possibility for rhizoplast material due to its tendency towards solubilization rather than reaggregation in solutions containing divalent cations. </p> / Thesis / Master of Science (MSc)

<p> Amoeboid Motion is thought to be due to the action of an actomyosin- like protein present in the cytoplasm of amoeba. A co-ordinated net- 0 work of microfilaments of the actomyosin-like protein, 70 A in diameter, may be the mechanical means of accomplishing amoeboid motion. The microfilaments formed of the actomyosin-like protein, may be capable of rapid association and dissociation in vivo. In this thesis, the cytoplasm of Naegleria gruberi amoeba has been shown to possess a protein similar to actomyosin. Characterization of the ATPase activity, superprecipitating ability, electrophoretic behaviour and microfilament producing ability reveal that the actomyosin-like protein of Naegleria gruberi amoeba is quite similar to the analogous protein in Physarum polycephalum. Naeqleria gruberi may be an ideal organism in which to study the interconversion of one form of a biologically active macromolecule to another., In different stages of the life cycle, amoeboid motion, flagellar beating and mitotic spindles are present. It is possible that the same contractile molecules in different forms may perform different functions. </P> / Thesis / Master of Science (MSc)

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:37:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renato Ferraz Penteado.pdf: 5510615 bytes, checksum: a1e326883a6f1e7ad0decd6835add201 (MD5) Previous issue date: 2016-08-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Knowledge of protein structures is of huge importance, since this information allows to understand the mechanisms through which proteins carry out their biological functions. Lipases constitute an enzymatic family capable to perform synthesis or hydrolysis of ester bonds of triacyl glycerols (TAGs) with long chain fatty acids.These enzymes are the theme of many investigations given their potential to be used in a wide variety of apllications involving chemicals with the ester functional group,e.g., in organic synthesis. On the other hand, structural knowledge of some enzymes is important for the development of new therapeutic drugs or even to contribute for the understanding of structural evolutionary features, like those belonging to metabolic pathways. In this work were accomplished the homology modeling of the lipase from Jatropha curcas and the structure determination of the triosephosphate isomerase from Naegleria gruberi from three X ray diffraction data sets. Among three experimental structures obtained, two belong to C2 space group, with different unit cells, and one to P4122 space group. Initial phases were obtained by molecular replacement procedure using the Phaser program and all structures were refined interactively with Coot and Phenix programs. In one structure it was possible to model three molecules of the precipitant agent Jeffamine present in the crystallization solution and one molecule of Tris buffer (placed at the active site). Structural comparisons were performed among the refined and validated model and some of its homologues, taking into account the differences observed in the structural-based alignment among them and characteristics noticed during the refinement procedure. Circular dichroism experiments have shown that thermal denaturation is irreversible to triosephosphate isomerase of Naegleria gruberi. / O conhecimento da estrutura de proteínas é de grande importância, uma vez que esta informação permite o entendimento dos mecanismos pelos quais elas desempenham suas funções biológicas. Lipases constituem uma família enzimática capaz de realizar a síntese ou hidrólise de ligações éster de substratos triacilgliceróis (TAGs) contendo ácidos graxos de cadeia longa. São alvo de muitos estudos dadas suas potencialidades em um grande número de aplicações envolvendo o grupo funcional éster, por exemplo, em química orgânica síntética. Já o conhecimento estrutural de algumas enzimas é importante para o desenvolvimento de novas drogas terapêuticas ou mesmo contribuir para o entendimento de aspectos evolutivos estruturais, como daquelas pertencentes a vias metabólicas. Neste trabalho foram realizadas a modelagem por homologia da estrutura lipase da planta Jatropha curcas e a determinação experimental da estrutura da triose fosfato isomerase do microrganismo Naegleria gruberi a partir de três conjuntos de imagens de difração de Raios X. Das três estruturas experimentais obtidas, duas pertencem ao grupo de espaço C2, com células unitárias diferentes, e uma ao grupo de espaço P4122. As fases iniciais foram obtidas com o procedimento de substituição molecular utilizando o programa PHASER e todas as estruturas foram refinadas iterativamente com o auxílio dos programas COOT e PHENIX. Em uma das estruturas foi possível modelar três moléculas do agente precipitante Jeffamine® presente na condição de cristalização e uma molécula do tampão Tris (no sítio ativo do monômero B). Comparações estruturais foram realizadas entre o modelo refinado e validado e algumas das proteínas homólogas, tendo em vista diferenças observadas no alinhamento baseado em estrutura entre elas e características notadas durante o procedimento de refinamento. Experimentos de dicroísmo circular mostraram que a desnaturação térmica é irreversível para esta proteína.

The metabolism of iron ions is a crucial process in all living organisms and its correct regulation is essential for basic life functions. Homeostasis of iron ions is closely regulated, it usually appears as a component of various proteins and plays role in many oxidation-reduction reactions. Naegleria gruberi is a non-pathogenic, free living protozoon, that serves as a laboratory model for closely related pathogenic Naegleria fowleri. This work focuses on the study of selected metabolites of N. gruberi, that were possible to detect and quantify by the means of modern metabolomic methods, and the influence on culture cultivated in environment with lack of iron ions was shown. The discovery of effect of this condition on the energetic metabolism of this protozoan is an important aspect of understanding the biological processes on cellular level. This method proved a significant influence on certain metabolites and modification of certain metabolic pathways as a direct effect of decreased availability of iron ions. Second part of this work was focused on the enzyme alcohol dehydrogenase, that was found in the genome of this protozoon. Unusual aspects of this enzyme include a N-terminal mitochondrial presequence, prompting about mitochondrial localization, and utilization of iron ion as a prosthetic...

Made available in DSpace on 2017-07-20T12:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Agnes Thiane Machado.pdf: 7176772 bytes, checksum: 01a4049f5c4aed0935803a0cf3a6468d (MD5) Previous issue date: 2017-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Study of protein three-dimensional structures allow us to investigate the relations between amino acid sequence, structure and function, what is important chiefly for proteins from pathogenic organisms or ones that belong to the same genus of these, such that they can be used as a structural model. In this context, this work aims at the structural characterization of the enzymes alanine racemase long isoform from Trypanosoma cruzi and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Naegleria gruberi. The long isoform of alanine racemase catalyzes the conversion between L and D-alanine which, in turn, is part of one of the metabolic pathways in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The heterologous expression of this enzyme in Escherichia coli BL21 (DE3) GroEL was analyzed by SDS-PAGE, which revealed that the protein is in higher proportion in the insoluble fraction, thus it was necessary to establish a recovery protocol followed by an in vitro refolding. Data from enzymatic assays and circular dichroism revealed the success of the recovery/refolding protocol, which may in the future contribute to the search for specific inhibitors. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Naegleria gruberi catalyzes the sixth step of the organism’s glycolytic pathway. NgGAPDH enzyme was expressed in E. coli (DE3) using the pET-15b vector, and then purified by tree chromatographic steps, two of nickel affinity and one of size exclusion. The enzymatic characterization was investigated with the enzyme without the his-tag; NgGAPDH presented higher activity at pH 8.0, 25 °C and 10 mM of arsenate, and positive cooperativity for substrates G3P and NAD+. His-tag depleted NgGAPDH crystals appeared in 3 days after drop settings, the best crystal diffracted to 1.94 A resolution and belongs to space group P21 with cell parameters a = 83.74 A, b = 94.55 A, c = 90.93 A, = 99.96 °. The final refined structure presents R = 0.1652 and Rfree = 0.2029. The catalytic domain formed by residues 134 to 313 is highly conserved, as expected, with the exception of Asn145, present only in NgGAPDH, while the other GAPDHs present either Ser or Thr on the corresponding position. Molecular dynamics analysis revealed that Asn145 has correlated motion with residues Ala123, Thr125 and Pro126 that belong to what was called "bonded loop". It should be emphasized that this is the first GAPDH from the phylum Percolozoa that has its three dimensional structure determined and kinetic parameters established, such that we expect to have contributed to the understanding of the evolution of this class of proteins. / O estudo da estrutura tridimensional de proteínas nos permite investigar as relações entre sequência de aminoácidos, estrutura e função, o que é importante principalmente para proteínas de organismos patogênicos ou mesmo pertencente ao gênero destes, que podem ser utilizadas como modelo estrutural. Neste contexto, o presente trabalho visa caracterizar estruturalmente as enzimas alanina racemase isoforma longa de Trypanosoma cruzi e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Naegleria gruberi. A alanina racemase isoforma longa catalisa a conversão entre L e D-alanina em uma das vias metabólicas do T. cruzi, que é o agente etiológico da doença de Chagas. A análise por SDS-PAGE de amostras da expressão heteróloga dessa enzima em Escherichia coli BL21(DE3) GroEL revelou que a proteína está em maior proporção na fração insolúvel, por isso, foi necessário estabelecer um protocolo de recuperação seguido de um reenovelamento in vitro. Dados de ensaios enzimáticos e dicroísmo circular revelaram o sucesso do protocolo de recuperação/reenovelamento, o que poderá no futuro contribuir para a busca de inibidores específicos. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Naegleria gruberi catalisa a sexta etapa da via glicolítica do organismo. A enzima NgGAPDH foi expressa em E. coli (DE3) usando-se o vetor pET-15b e então purificada em três passos de cromatografia, dois por afinidade a níquel e um por exclusão por tamanho. A caracterização enzimática foi realizada com a enzima sem a ―his-tag‖; a NgGAPDH apresentou maior atividade em pH 8,0, 25 °C e 10 mM de arsenato, e cooperatividade positiva frente aos substratos G3P e NAD+. Cristais de NgGAPDH sem a ―his-tag‖ apareceram em 3 dias após montagem das gotas e o melhor difratou a 1,94 A de resolução, pertencendo ao grupo espacial P21 com parâmetros de cela a = 83,74 Å, b = 94,55 A, c = 90,93 A e = 99,96 °. A estrutura final refinada apresenta R = 0,1652 e Rfree = 0,2029. O domínio catalítico formado pelos resíduos 134 a 313 é altamente conservado, como esperado, com exceção da Asn145, presente somente em NgGAPDH, enquanto que as demais GAPDHs apresentam Ser ou Thr na posição correspondente. Análises por dinâmica molecular revelaram que a Asn145 tem correlação de movimento com os resíduos Ala123, Thr125 e Pro126, pertencentes ao que se chamou de ―bonded loop‖. Ressalte-se que esta é a primeira GAPDH do filo Percolozoa que tem sua estrutura tridimensional determinada e parâmetros cinéticos estabelecidos, tal que se espera contribuir para o entendimento da evolução dessa classe de proteínas.