Espécies de fungos dos gêneros Candida e Trichophyton e Cryptococcus neoformans são os mais importantes agentes causadores de micoses em humanos. A seleção de linhagens tolerantes aos fungicidas atualmente utilizados torna extremamente necessário o desenvolvimento de novas estratégias para o controle desses patógenos. A inativação fotodinâmica (IF) de fungos baseia-se na utilização de um fotossensibilizador (FS) que se acumula preferencialmente nas células-alvo e que pode ser ativado por exposições à luz visível. A ativação do FS induz a formação de espécies reativas de oxigênio que matam a célula fúngica. O uso de FS para o tratamento de micoses é uma aplicação recente e promissora da IF de fungos. No presente estudo, foram avaliados os efeitos dos tratamentos fotodinâmicos (TF) com os FS fenotiazínicos azul de metileno (MB), azul de toluidina (TBO), novo azul de metileno (NMBN), o derivado pentacíclico do azul de metileno S137 e com uma cloroalumínio ftalocianina em nanoemulsão (ClAlPc/NE) nas leveduras Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cryptococcus neoformans e nos microconídios dos dermatófitos Trichophyton mentagrophytes e T. rubrum. Os efeitos dos TF com os diferentes FS fenotiazínicos também foram avaliados na linhagem celular L929 de camundongo. Inicialmente, a eficácia dos TF foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de cada FS para cada dose de luz. Adicionalmente, nas condições otimizadas, também foram determinados os efeitos dos TF na sobrevivência das diferentes espécies de fungos. Os MICs variaram tanto entre FS como entre espécies e diminuíram com o aumento da dose de luz. Entre os FS fenotiazínicos, para a maioria dos tratamentos (espécies e doses de luz), o NMBN e o S137 apresentaram os menores MICs. Os MICs para o NMBN e para o S137 foram <= 2,5 ?M para todas as espécies de Candida, para doses >= 20 J cm-2. MICs para a ClAlPc/NE foram tão baixos quanto 0,01 ?M para algumas das espécies de Candida. O TF com NMBN e S137 resultaram em redução de pelo menos 3 logs na sobrevivência de todas as espécies de Candida e de Trichophyton. O TF com ClAlPc/NE resultou em redução de até 4 logs na sobrevivência de C. albicans e C. tropicalis e de até 6 logs na sobrevivência de células melanizadas de C. neoformans. A internalização da ClAlPc foi confirmada por microscopia confocal de fluorescência e a quantidade incorporada pelas células foi dependente da concentração do FS. As toxicidades relativas entre os diferentes FS para as células de mamífero foram semelhantes às observadas em fungos, por exemplo maior toxicidade e fototoxicidade do NMBN e do S137 comparada às do MB e TBO / Fungal species of the genera Candida and Trichophyton and Cryptococcus neoformans are the main responsible for mycoses in humans. The selection of fungal strains resistant to currently used fungicides makes the development of alternative fungus-control techniques highly desirable. Fungal photodinamic inactivation (PI) is based on the use of a visible light-activate photosensitiser (PS) that preferentially accumulates in the cell of the target microorganism. The activation of the PS starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) that kill the fungal cell. The use of PS to treat mycoses is a novel and promising application of PI. In the present study, the effects of the photodynamic treatments (PDT) with the phenothiazinium PS methylene blue (MB), toluidine blue O (TBO), new methylene blue N (NMBN), the novel pentacyclic photosensitiser S137 and with a chloroaluminum phthalocyanine nanoemulsion (ClAlPc/NE) on the yeasts Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis and Cryptococcus neoformans and on microconidia of the dermatophytes Trichophyton mentagrophytes and T. rubrum were evaluated. The effects of the PDT with the phenothiazinium PS were also evaluated on the mouse fibroblast cell line L929. The efficacies of the PDT were evaluated initially by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) of each PS for each light dose. Additionally, for the optimized conditions, the effects of the PDT on the survival of the different fungal species were also determined. MICs varied both among PS and species and decreased with light dose increase. Among the phenothiazinium PS, for most treatments (species and light doses), NMBN and S137 showed the lowest MICs. MICs for NMBN and S137 were <= 2.5 ?M for all the Candida species to light doses >= 20 J cm-2. MICs for ClAlPc/NE were as low as 0.01 ?M for some of the Candida species. PDT with NMBN and S137 resulted in a reduction of at least 3 logs in the survival of all Candida and Trichphyton species. PDT with ClAlPc/NE resulted in reductions up to 4 logs in the survival of C. albicans and C. tropicalis and up to 6 logs in the survival of C. neoformans melanized cells. Internalization of ClAlPc by C. neoformans was confirmed by confocal fluorescence microscopy, and the degree of uptake was dependent on PS concentration. The relative toxicities among the different PS to mammalian cell were similar to the antifungal data, i.e. greater toxicity and phototoxicity with NMBN and S137 compared to MB and TBO.

O basidiomiceto Cryptococcus neoformans é um fungo saprófita, com ampla distribuição geográfica, que é normalmente isolado de solos que contêm excretas de pombos e detritos vegetais. Apesar de saprófita, o fungo pode infectar e causar doença em uma grande variedade de hospedeiros animais, como mamíferos, aves e insetos. O número de casos de micoses graves, causadas por C. neoformans e por outros gêneros de fungos, tem aumentado em todo o mundo, principalmente devido ao aumento do número de indivíduos imunocomprometidos. Adicionalmente, a emergência de novas espécies de patógenos e a seleção de linhagens tolerantes aos antifúngicos comumente utilizados fazem com que o desenvolvimento de novas estratégias para o controle de fungos seja extremamente desejável. A inativação fotodinâmica de fungos é um método novo e promissor, que pode ser utilizado tanto para o controle de micoses (em animais e em vegetais), como para a eliminação de fungos do ambiente. A fotoinativação de fungos é baseada no uso de fotossensibilizadores que se acumulam ou que são preferencialmente metabolizados pelas células do microrganismo-alvo. A seguir, o fotossensibilizador é exposto à luz visível, que, na presença de oxigênio, inicia processos fotoquímicos que produzem uma série de espécies reativas de oxigênio capazes de matar as células fúngicas sem provocar danos significativos nos tecidos do hospedeiro. Neste trabalho, foram avaliadas as eficácias do azul de metileno (MB) (em solução e em nanoemulsão), da cloro-alumínio ftalocianina (em nanoemulsão) e do complexo nitrosilo de rutênio (em solução) como fotossensibilizadores para a fotoinativação de células melanizadas e não melanizadas de C. neoformans. C. neoformans foi suscetível à fotoinativação pela cloro-alumínio ftalocianina, com uma inativação próxima de 100% quando foi utilizada uma combinação apropriada da concentração do fotossensibilizador e da dose de luz. A completa fotoinativação do fungo pela ftalocianina, em condições compatíveis com a terapia fotodinâmica, abre a perspectiva da utilização desse fotossensibilizador para o tratamento de micoses causadas por C. neoformans. A fotoinativação pelo MB foi apenas parcial e não ocorreu fotoinativação pelo nitrosilo de rutênio. Nenhum dos fotossensibilizadores matou o fungo na ausência da luz. Também foram feitos experimentos para se verificar a influência do tempo de crescimento e da melanização na tolerância de C. neoformans à fotoinativação pelo MB. Houve diferença significativa na tolerância entre diferentes linhagens de C. neoformans. Para a maioria dos tratamentos [linhagens e tempo de crescimento (4, 6 ou 8 dias)], não houve diferença significativa entre a tolerância de células melanizadas e não melanizadas. Também não foi observada diferença na tolerância entre células com idade de 4 a 8 dias. / The basidiomycete Cryptococcus neoformans is a saprophytic worldwide fungus which is normally isolated from soils contaminated with pigeon excreta and plant detritus. Despite a saprophytic existence, the fungus can infect and cause disease in a wide variety of animal hosts such as mammals, birds and insects. Serious infections caused by C. neoformans and by other genera of fungi have emerged all over the world, primarily due to the increased numbers of immunocompromised individuals. Additionally, the emergence of new species and antimycotic-resistant strains of pathogenic fungi makes the development of new fungus-control techniques highly desirable. Photodynamic inactivation of fungi is a new and promising method that can be used to control localized mycoses or kill fungi in the environment. The photodynamic inactivation of fungi is based on the use of a photosensitizer that accumulates in, or preferentially is metabolized by, cells of the target microorganism. The photosensitizer is then exposed to visible light in the presence of oxygen, and this starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) capable of killing the fungal cells without causing significant damage to host tissues. We report here the efficacy of methylene blue (MB) (in solution and in nanoemulsion), chloroaluminum phthalocyanine (in nanoemulsion) and nitrosyl ruthenium complex (in solution) as photosensitizers in photoinactivation of melanized and nonmelanized Cryptococcus neoformans yeast cells. C. neoformans were susceptible to photoinactivation by chloroaluminum phthalocyanine with inactivation close to 100% when the appropriate combination of photosensitizer concentration and light-exposure dose was used. Photoinactivation by MB was only partial and nitrosyl ruthenium complex was ineffective. In the dark, neither photosensitizers inactivated the fungus. Complementary experiments were performed to estimate the effect of the age of the cells and of melanization in the fungus tolerance to photoinactivation by MB. There was a significative difference in the tolerance among strains of C. neoformans. For most of the treatments (strains and time of growth) there was no difference between the tolerance of melanized and nonmelanized cells. There was no difference in the tolerance among 4 to 8-day cells either.

A radiação solar é um dos principais fatores responsáveis pelo controle das populações de fungos no meio ambiente. A inatividade de estruturas de dispersão e de infecção pela radiação UVA e UVB é ainda mais importante no controle de fungos que se dispersam pelo ar e que podem infectar o hospedeiro, quando inalados, como é o caso de espécies do gênero Cryptococcus. C. neofarmans é capaz de produzir melanina na presença de substratos exógenos, como a L-dopa. A melanização é capaz de proteger o fungo contra diversos fatores ambientais bióticos e abióticos. Neste trabalho, foi avaliado o efeito de exposições a uma intensidade ambiental de radiação UVB (I.000mW m-2) na sobrevivência de células melanizadas e não melanizadas de quatro linhagens de Cryptococcus neoformans e de quatro linhagens de Cryptococcus laurentii. Foi determinada a sobrevivência relativa (sobrevivência das células expostas em relação à das células não expostas à radiação de células com 2, 4, 6 e 8 dias, crescidas em meio com e sem L-dopa, após exposição às doses de 1.8 e 3.6 kJ m-2. Tanto a irradiância como as doses, são observadas no meio ambiente, mesmo em regiões temperadas. Foram observadas diferenças na tolerância à radiação UVB, tnato entre as linhagens de C. neoformans, como entre as linhagens de C. laurentii. As linhagens de C. neoformans, foram observbadas diferenças na tolerância à radiação ao longo do desenvolvimento, tanto nas células melanizadas como nas não melanizadas. Na maioria das situações (linhagem, tempo de crescimento, dose de UVB), não houve diferença significativa entre a tolerância das células melanizadas e não melanizadas e, quando isso ocorreu, a diferença foi menor do que a observada anteriormente com UVC. E, C laurentii, não houve diferença na tolerância à radiação ao longo do desenvolvimento das células melanizadas e não melanizadas. Também não foram observadas diferenças significativas entre a tolerância das células melanizadas e não melanizadas em nenhuma das linhagens. / Solar radiation is one of the major factors responsible for the control of fungus populations in the environment. The inactivation of dispersal and infection structures by UVA and UVB radiation is even more important for the control of fungi that disperse through the air and that can produce melanin in the presence of oxogeneous substrates such as L-dopa. Melanization can protect the fungus against various biotic and abiotic factors. In the present study, we investigated the effect of exposure to an environmental intensity of UVB radiation of 1,000 mWm-2 on the survival of melanized and non-melanized cells of four strains of Cryptococcus neoformans and of four strains of Cryptococcus laurentii. The relative survival (survival of cells exposed to radiation in relation to cells not exposed) of 2, 4, 6 and 8 day cells grown on medium with and without L-dopa was determinated after exposure to doses of 1.8 and 3.6kJ m-2. Both irradiance and these doses are observed in the environment even in temperate regions. Difference in tolerance to UVB radiation were observed both in the C. neoformans and C. laurentii strains. The C. neofarmans strains were more sensitive to radiation than the C. laurentii strains. In C. neoformans, diferences in tolerance to radiation were observed during development both in melanized and non-melanized cells. For most features (strains, time of growth and UVB dose) there was no difference in tolerance between melanized and non-melanized cell and when differences occurred they were smaller than those previously observed with UVC. In C. laurentii, there was no difference in tolerance to radiation during development between melanized and non-melanized cells., Also, no significant differences in tolerance were observed between melanized and non-melanized cells of any strain

Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar a base de interações moleculares protagonizadas por duas proteínas que possuem funções biológicas completamente distintas. A primeira delas, clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD), tem um apelo biotecnológico para área ambiental devido a sua capacidade de catalisar a degradação do composto clorocatecol, um intermediário comum no final da decomposição de diversos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Essa característica pode promover a descontaminação de solos e águas poluídos revelando um grande potencial para aplicações em mecanismos de biorremediação. Além disso, a presença de moléculas anfipáticas junto à interface de ligação dos monômeros da CCD levantou a questão em relação à capacidade dessa família de enzimas de se ligar a membranas biológicas. Esse tipo de informação amplia o conhecimento acerca de mecanismos básicos de ação da enzima, aumentando a possibilidade de parceiros de interação, podendo levar a outras formas de controle da atividade biológica para uso em aplicações biotecnológicas como desenvolvimento de biossensores. O estudo dessa enzima está, portanto, voltado para a compreensão de suas interações com miméticos de membrana e a tentativas de imobilização da proteína nestas estruturas. Para isto, fazemos uso de técnicas biofísicas como dicroísmo circular, caloria diferencial de varredura e espectroscopias ópticas, e biomoleculares como desenvolvimento de oligonucleotídeos, reações de cadeia polimerase e análise de restrição. A outra vertente desta dissertação, tem como foco de estudo a proteína ligante de acil-CoA de Cryptococcus neoformans (CnACBP) clonada pela primeira vez em nosso laboratório. Homólogos de ACBP foram encontrados em todos os organismos distribuídos nos quatro reinos eucariotos, com alta similaridade sequencial (~48%). A sua presença ao longo dos reinos e seu envolvimento em diversos mecanismos metabólicos essenciais relacionados ao éster acil-CoA levaram à conclusão de que se trata de uma housekeeping protein, e não uma proteína específica, confinada a um tipo especializado de célula. Este trabalho traz uma caracterização inicial da CnACBP que busca esclarecer questões ainda em aberto e também aprofundar o conhecimento ainda muito vago de como cargas e a presença do ligante podem influenciar estrutura, estabilidade e função através de técnicas termodinâmicas e espectroscópicas antes de um aprofundamento de seu papel no interior da célula e interações com outras proteínas. / In this study, we used a multi technique approach to understand the basic molecular interactions of two proteins that have quite different biological functions. The first, chlorocatechol 1,2- dioxygenase (Pp 1,2-CCD), has an environmental appeal due to it ability to catalyze the degradation of chlorocatechol, a common intermediate in the end of the decomposition of many polycyclic aromatic hydrocarbons. This characteristic of decontaminating polluted soils and waters suggest a great potential for applications in bioremediation mechanisms. Moreover, the presence of amphipathic molecules at the interface of the CCD monomers raised issues related to the ability of this enzyme family of binding to biological membranes. Such information broadens the knowledge of the basic mechanisms of enzyme action, increasing the possibility of interaction partners and may lead to other forms of control of the biological activity for use in biotechnological applications, such as biosensors development. The study of this enzyme is therefore, aimed at understanding their interactions with mimetic membrane and immobilization attempts of the protein in these structures. For this purpose, we make use of biophysical techniques such as circular dichroism, differential scanning calorimetry and optical spectroscopies and biomolecular techniques, such as development of primers, polymerase chain reaction and restriction analysis. The other aspect of this dissertation is focused on the study of acyl-CoA binding protein of Cryptococcus neoformans (CnACBP) cloned for first time in our laboratory. Homologues of ACBP were found in all organisms distributed in the four kingdoms of eukaryotes, with high sequence similarity (~ 48%). Its widespread presence and their involvement in several key metabolic pathways related to the acyl-CoA ester led to the conclusion that ACBP is a housekeeping protein and not a specific protein contained a specialized cell type. Here we present an initial characterization of CnACBP that seeks to relevant issues regarding the proteins function. Our goal was to increase the still vague knowledge on how electrical charges and the presence of the binding partner may influence the structure, stability and function through thermodynamic and spectroscopic techniques. This is an initial step toward the full understanding of the role of protein in the cell.

A radiação solar é um dos principais fatores responsáveis pelo controle das populações de fungos no meio ambiente. A inatividade de estruturas de dispersão e de infecção pela radiação UVA e UVB é ainda mais importante no controle de fungos que se dispersam pelo ar e que podem infectar o hospedeiro, quando inalados, como é o caso de espécies do gênero Cryptococcus. C. neofarmans é capaz de produzir melanina na presença de substratos exógenos, como a L-dopa. A melanização é capaz de proteger o fungo contra diversos fatores ambientais bióticos e abióticos. Neste trabalho, foi avaliado o efeito de exposições a uma intensidade ambiental de radiação UVB (I.000mW m-2) na sobrevivência de células melanizadas e não melanizadas de quatro linhagens de Cryptococcus neoformans e de quatro linhagens de Cryptococcus laurentii. Foi determinada a sobrevivência relativa (sobrevivência das células expostas em relação à das células não expostas à radiação de células com 2, 4, 6 e 8 dias, crescidas em meio com e sem L-dopa, após exposição às doses de 1.8 e 3.6 kJ m-2. Tanto a irradiância como as doses, são observadas no meio ambiente, mesmo em regiões temperadas. Foram observadas diferenças na tolerância à radiação UVB, tnato entre as linhagens de C. neoformans, como entre as linhagens de C. laurentii. As linhagens de C. neoformans, foram observbadas diferenças na tolerância à radiação ao longo do desenvolvimento, tanto nas células melanizadas como nas não melanizadas. Na maioria das situações (linhagem, tempo de crescimento, dose de UVB), não houve diferença significativa entre a tolerância das células melanizadas e não melanizadas e, quando isso ocorreu, a diferença foi menor do que a observada anteriormente com UVC. E, C laurentii, não houve diferença na tolerância à radiação ao longo do desenvolvimento das células melanizadas e não melanizadas. Também não foram observadas diferenças significativas entre a tolerância das células melanizadas e não melanizadas em nenhuma das linhagens. / Solar radiation is one of the major factors responsible for the control of fungus populations in the environment. The inactivation of dispersal and infection structures by UVA and UVB radiation is even more important for the control of fungi that disperse through the air and that can produce melanin in the presence of oxogeneous substrates such as L-dopa. Melanization can protect the fungus against various biotic and abiotic factors. In the present study, we investigated the effect of exposure to an environmental intensity of UVB radiation of 1,000 mWm-2 on the survival of melanized and non-melanized cells of four strains of Cryptococcus neoformans and of four strains of Cryptococcus laurentii. The relative survival (survival of cells exposed to radiation in relation to cells not exposed) of 2, 4, 6 and 8 day cells grown on medium with and without L-dopa was determinated after exposure to doses of 1.8 and 3.6kJ m-2. Both irradiance and these doses are observed in the environment even in temperate regions. Difference in tolerance to UVB radiation were observed both in the C. neoformans and C. laurentii strains. The C. neofarmans strains were more sensitive to radiation than the C. laurentii strains. In C. neoformans, diferences in tolerance to radiation were observed during development both in melanized and non-melanized cells. For most features (strains, time of growth and UVB dose) there was no difference in tolerance between melanized and non-melanized cell and when differences occurred they were smaller than those previously observed with UVC. In C. laurentii, there was no difference in tolerance to radiation during development between melanized and non-melanized cells., Also, no significant differences in tolerance were observed between melanized and non-melanized cells of any strain

O basidiomiceto Cryptococcus neoformans é um fungo saprófita, com ampla distribuição geográfica, que é normalmente isolado de solos que contêm excretas de pombos e detritos vegetais. Apesar de saprófita, o fungo pode infectar e causar doença em uma grande variedade de hospedeiros animais, como mamíferos, aves e insetos. O número de casos de micoses graves, causadas por C. neoformans e por outros gêneros de fungos, tem aumentado em todo o mundo, principalmente devido ao aumento do número de indivíduos imunocomprometidos. Adicionalmente, a emergência de novas espécies de patógenos e a seleção de linhagens tolerantes aos antifúngicos comumente utilizados fazem com que o desenvolvimento de novas estratégias para o controle de fungos seja extremamente desejável. A inativação fotodinâmica de fungos é um método novo e promissor, que pode ser utilizado tanto para o controle de micoses (em animais e em vegetais), como para a eliminação de fungos do ambiente. A fotoinativação de fungos é baseada no uso de fotossensibilizadores que se acumulam ou que são preferencialmente metabolizados pelas células do microrganismo-alvo. A seguir, o fotossensibilizador é exposto à luz visível, que, na presença de oxigênio, inicia processos fotoquímicos que produzem uma série de espécies reativas de oxigênio capazes de matar as células fúngicas sem provocar danos significativos nos tecidos do hospedeiro. Neste trabalho, foram avaliadas as eficácias do azul de metileno (MB) (em solução e em nanoemulsão), da cloro-alumínio ftalocianina (em nanoemulsão) e do complexo nitrosilo de rutênio (em solução) como fotossensibilizadores para a fotoinativação de células melanizadas e não melanizadas de C. neoformans. C. neoformans foi suscetível à fotoinativação pela cloro-alumínio ftalocianina, com uma inativação próxima de 100% quando foi utilizada uma combinação apropriada da concentração do fotossensibilizador e da dose de luz. A completa fotoinativação do fungo pela ftalocianina, em condições compatíveis com a terapia fotodinâmica, abre a perspectiva da utilização desse fotossensibilizador para o tratamento de micoses causadas por C. neoformans. A fotoinativação pelo MB foi apenas parcial e não ocorreu fotoinativação pelo nitrosilo de rutênio. Nenhum dos fotossensibilizadores matou o fungo na ausência da luz. Também foram feitos experimentos para se verificar a influência do tempo de crescimento e da melanização na tolerância de C. neoformans à fotoinativação pelo MB. Houve diferença significativa na tolerância entre diferentes linhagens de C. neoformans. Para a maioria dos tratamentos [linhagens e tempo de crescimento (4, 6 ou 8 dias)], não houve diferença significativa entre a tolerância de células melanizadas e não melanizadas. Também não foi observada diferença na tolerância entre células com idade de 4 a 8 dias. / The basidiomycete Cryptococcus neoformans is a saprophytic worldwide fungus which is normally isolated from soils contaminated with pigeon excreta and plant detritus. Despite a saprophytic existence, the fungus can infect and cause disease in a wide variety of animal hosts such as mammals, birds and insects. Serious infections caused by C. neoformans and by other genera of fungi have emerged all over the world, primarily due to the increased numbers of immunocompromised individuals. Additionally, the emergence of new species and antimycotic-resistant strains of pathogenic fungi makes the development of new fungus-control techniques highly desirable. Photodynamic inactivation of fungi is a new and promising method that can be used to control localized mycoses or kill fungi in the environment. The photodynamic inactivation of fungi is based on the use of a photosensitizer that accumulates in, or preferentially is metabolized by, cells of the target microorganism. The photosensitizer is then exposed to visible light in the presence of oxygen, and this starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) capable of killing the fungal cells without causing significant damage to host tissues. We report here the efficacy of methylene blue (MB) (in solution and in nanoemulsion), chloroaluminum phthalocyanine (in nanoemulsion) and nitrosyl ruthenium complex (in solution) as photosensitizers in photoinactivation of melanized and nonmelanized Cryptococcus neoformans yeast cells. C. neoformans were susceptible to photoinactivation by chloroaluminum phthalocyanine with inactivation close to 100% when the appropriate combination of photosensitizer concentration and light-exposure dose was used. Photoinactivation by MB was only partial and nitrosyl ruthenium complex was ineffective. In the dark, neither photosensitizers inactivated the fungus. Complementary experiments were performed to estimate the effect of the age of the cells and of melanization in the fungus tolerance to photoinactivation by MB. There was a significative difference in the tolerance among strains of C. neoformans. For most of the treatments (strains and time of growth) there was no difference between the tolerance of melanized and nonmelanized cells. There was no difference in the tolerance among 4 to 8-day cells either.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2450774 bytes, checksum: 5a8c6f7ae617f05957b253f97b3104cd (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cryptococcus neoformans is yeast capable of causing infection in humans called cryptococcosis that primarily affects immunocompromised patients. The infection usually affects the central nervous system causing meningoencephalitis with a severe and fatal evolution, accompanying or not, lung injury, fungemia and secondary outbreaks on the skin, bones and kidneys. The drugs of choice for treatment are usually amphotericin B associated with 5-flucytosine, however, increasing resistance to antifungal agents available and toxicity caused by them lead the search for new antifungals, becoming natural products as focus of studies in the research of substances with antifungal properties. Thus, the study aimed to investigate the antifungal activity of essential oils of Coriandrum sativum L. (coriander) and Foeniculum vulgare Mill. (fennel) in vitro against 14 strains of Cryptococcus neoformans. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) were determinated by the microdilution technique, and the effects of essential oils on the morphology and time-kill curve of C. neoformans were evaluated. Was found for the essential oil of C. sativum MIC= 64 &#956;g/mL and MFC= 64 &#956;g/mL, and for the essential oil of F. vulgare, MIC= 256 &#956;g/mL and MFC= 512 &#956;g/mL. There were no changes in the morphology of LM 310 and ICB 59 strains of the yeast when subjected to contact with essential oils. Has been observed a decrease in count of viable forms with increasing concentrations of essential oils. In the time-kill curve of C. neoformans, compared to the essential oil of C. sativum, was observed fungicidal effect (decrease &#8805; 3 log10UFC/mL from the initial inoculation), at 24 hours, at MICx4 for the strain LM 310, and in MICx2 and MICx4, for the strain ICB 59. The essential oil of F. vulgare, for strain LM 310, began fungicidal activity at the time of 4 hours in MICx2 and MICx4, the MIC was fungicidal at 8 hours. The fungicidal activity for the strain ICB 59 began in 4 hours for all concentrations of essential oil (MIC, MICx2 and MICx4). The essential oils of C. sativum and F. vulgare has antifungal activity against strains of C. neoformans, therefore represent a possibility to become new products with antifungal potential in the treatment of cryptococcosis. However, there is need for further studies to search deeper aspects of the essential oils tested, so they can be used in therapy. / Cryptococcus neoformans é uma levedura capaz de provocar no homem uma infecção denominada criptococose que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos. A infecção geralmente atinge o sistema nervoso central provocando meningoencefalite, de evolução grave e fatal, acompanhada ou não, de lesão pulmonar, fungemia e focos secundários na pele, ossos e rins. Os fármacos de escolha para seu tratamento são geralmente anfotericina B associada a 5-fluocitosina. Entretanto, o aumento da resistência aos antifúngicos disponíveis e a toxicidade provocada por eles levam a busca de novos antifúngicos, fazendo com que os produtos naturais sejam foco de pesquisas na busca de substâncias com propriedades antifúngicas. Desta forma, o estudo teve como objetivo investigar a atividade antifúngica dos óleos essenciais de Coriandrum sativum L. (coentro) e Foeniculum vulgare Mill. (funcho) in vitro sobre 14 cepas de Cryptococcus neoformans. Foram determinadas a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM), pela técnica da microdiluição, e avaliados os efeitos dos óleos essenciais sobre a micromorfologia e a curva de morte fúngica de C. neoformans. Foi encontrado para o óleo essencial de C. sativum CIM= 64 &#956;g/mL e CFM= 64 &#956;g/mL, e para o óleo essencial de F. vulgare, CIM= 256 &#956;g/mL e CFM= 512 &#956;g/mL. Não foram observadas alterações na micromorfologia das cepas ICB 59 e LM 310 da levedura quando submetidas ao contato com os óleos essenciais. Foi constatada, porém uma diminuição na contagem de formas viáveis com aumento das concentrações dos óleos essenciais. Na curva de morte microbiana causada pelo óleo essencial de C. sativum sobre a cepa de C. neoformans LM 310, observou-se um efeito fungicida (redução &#8805;3 log10UFC/mL a partir do inóculo inicial), no tempo de 24 horas, na CIMx4; e nas CIMx2 e CIMx4, para a cepa ICB 59. O óleo essencial de F. vulgare, para a cepa LM 310, iniciou sua atividade fungicida no tempo de 4 horas nas CIMx2 e CIMx4, a CIM foi fungicida a partir de 8 horas. A atividade fungicida para a cepa ICB 59 iniciou-se em 4 horas para todas as concentrações do óleo essencial (CIM, CIMx2 e CIMx4). Os óleos essenciais de C. sativum e F. vulgare apresentaram atividade antifúngica contra cepas de C. neoformans, portanto, representam uma possibilidade de tornarem-se novos produtos com potencial efeito antifúngico no tratamento da criptococose. Há, entretanto, necessidade de estudos posteriores que pesquisem aspectos mais aprofundados dos óleos essenciais testados, para que possam ser utilizados na terapêutica.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1157916 bytes, checksum: c99ab78dc2b8ee9f7877c46cab75b07f (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cryptococcus neoformans is the opportunistic pathogenic yeast with broad geographic capable of infecting all kinds of animal distribution. In humans, cryptococcosis mainly affects the lungs and central nervous system, less frequently the skin, presenting in general with severe and fatal outcomes. People with compromised immune systems are more likely to develop cryptococcosis, especially those affected by human immunodeficiency virus. Conventional treatment of cryptococcosis potentially toxic antifungal use for long periods and that has been the target of resistance of these microorganisms, in addition to the high costs of treatment. Against this background, the searches for natural products with antifungal properties have been a promising alternative, with great attention of scholars as to the analysis of essential oils and their constituents. Thus, the present study aimed to evaluate the in vitro antifungal activity of essential oil of Laurus nobilis L. (Laurel) on strains of Cryptococcus neoformans. The chemical composition of the oil was analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC / MS) and its antifungal activity, assessed by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicide concentration (MFC) by microdilution. Its kinetic microbial death and the effects on the morphology were also analyzed. The results of GC / MS revealed the presence of seven phytochemicals, isoeugenol (57%), myrcene (15,9%), chavicol (9,3%), methyleugenol (2,43%), linalool (2,14%), caryophyllenne (2,10%) and limonene (2,02%). The oil showed fungal growth inhibition of 70% of the 10 strains tested, with MIC set at 256 &#956;g/mL and 1024 &#956;g/mL MFC. The curve of microbial death had a fungistatic effect (reduction <3 log10UFC/mL from the initial inoculum) at concentrations of MIC / 2, MIC, MIC x 2 and fungicidal effect (reduction of &#8805; 3 log10UFC/mL from the initial inoculum) in MIC x 4 starting from 2 hours. Not being observed change in micromorphology of LM 2601 strain, selected for the study of kinetics and micromorphology, when subjected to contact with the essential oil in different concentrations. The essential oil of L. nobilis L. showed antifungal activity against all strains of C. neoformans tested and thus may represent a novel antifungal product with potential in the treatment of cryptococcosis. / Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica oportunista, com ampla distribuição geográfica, capaz de infectar os mais variados tipos de animais. No homem, a criptococose acomete principalmente o sistema nervoso central e pulmões, com menor frequência a pele, apresentando-se de uma forma geral com evolução grave e fatal. Indivíduos com o sistema imunológico comprometido são mais susceptíveis de desenvolver a criptococose, principalmente os acometidos pelo vírus da imunodeficiência humana. O tratamento convencional da criptococose utiliza antifúngicos potencialmente tóxicos por longos períodos e que vêm sendo alvo de resistência desses microrganismos, além dos elevados custos com o tratamento. Diante desse panorama, a busca por produtos naturais com propriedades antifúngicas têm sido uma alternativa promissora, com grande atenção dos estudiosos quanto à análise dos óleos essenciais e seus constituintes. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de Laurus nobilis L. (louro) sobre cepas de Cryptococcus neoformans. A composição química do óleo foi analisada por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG/EM) e sua atividade antifúngica, avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida mínima (CFM), pela técnica de microdiluição. A cinética de morte microbiana e os efeitos sobre a micromorfologia também foram analisados. Os resultados da CG/EM revelaram a presença de sete fitoconstituintes majoritários, isoeugenol (57%), mirceno (15,9%), chavicol (9,3%), metileugenol (2,43%), linalol (2,14%), cariofileno (2,10%) e limoneno (2,02%). O óleo apresentou inibição do crescimento fúngico sobre 70% das 10 cepas ensaiadas, tendo a CIM estabelecida em 256 &#956;g/mL e a CFM em 1024 &#956;g/mL. A curva de morte microbiana apresentou efeito fungistático (redução < 3 log10UFC/mL a partir do inóculo inicial) nas concentrações de CIM/2, CIM, CIM x 2 e efeito fungicida (redução &#8805;3 log10UFC/mL a partir do inóculo inicial) na CIM x 4 a apartir das 2 horas. Não foi constatado alteração na micromorfologia da cepa LM 2601, selecionada para o estudo da cinética e da micromorfologia, quando submetida ao contato com o óleo essencial em diferentes concentrações. O óleo essencial de L. nobilis L. apresentou atividade antifúngica contra as cepas de C. neoformans testadas e dessa forma, pode representar um novo produto com potencial antifúngico no tratamento da criptococose.

Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar a base de interações moleculares protagonizadas por duas proteínas que possuem funções biológicas completamente distintas. A primeira delas, clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD), tem um apelo biotecnológico para área ambiental devido a sua capacidade de catalisar a degradação do composto clorocatecol, um intermediário comum no final da decomposição de diversos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Essa característica pode promover a descontaminação de solos e águas poluídos revelando um grande potencial para aplicações em mecanismos de biorremediação. Além disso, a presença de moléculas anfipáticas junto à interface de ligação dos monômeros da CCD levantou a questão em relação à capacidade dessa família de enzimas de se ligar a membranas biológicas. Esse tipo de informação amplia o conhecimento acerca de mecanismos básicos de ação da enzima, aumentando a possibilidade de parceiros de interação, podendo levar a outras formas de controle da atividade biológica para uso em aplicações biotecnológicas como desenvolvimento de biossensores. O estudo dessa enzima está, portanto, voltado para a compreensão de suas interações com miméticos de membrana e a tentativas de imobilização da proteína nestas estruturas. Para isto, fazemos uso de técnicas biofísicas como dicroísmo circular, caloria diferencial de varredura e espectroscopias ópticas, e biomoleculares como desenvolvimento de oligonucleotídeos, reações de cadeia polimerase e análise de restrição. A outra vertente desta dissertação, tem como foco de estudo a proteína ligante de acil-CoA de Cryptococcus neoformans (CnACBP) clonada pela primeira vez em nosso laboratório. Homólogos de ACBP foram encontrados em todos os organismos distribuídos nos quatro reinos eucariotos, com alta similaridade sequencial (~48%). A sua presença ao longo dos reinos e seu envolvimento em diversos mecanismos metabólicos essenciais relacionados ao éster acil-CoA levaram à conclusão de que se trata de uma housekeeping protein, e não uma proteína específica, confinada a um tipo especializado de célula. Este trabalho traz uma caracterização inicial da CnACBP que busca esclarecer questões ainda em aberto e também aprofundar o conhecimento ainda muito vago de como cargas e a presença do ligante podem influenciar estrutura, estabilidade e função através de técnicas termodinâmicas e espectroscópicas antes de um aprofundamento de seu papel no interior da célula e interações com outras proteínas. / In this study, we used a multi technique approach to understand the basic molecular interactions of two proteins that have quite different biological functions. The first, chlorocatechol 1,2- dioxygenase (Pp 1,2-CCD), has an environmental appeal due to it ability to catalyze the degradation of chlorocatechol, a common intermediate in the end of the decomposition of many polycyclic aromatic hydrocarbons. This characteristic of decontaminating polluted soils and waters suggest a great potential for applications in bioremediation mechanisms. Moreover, the presence of amphipathic molecules at the interface of the CCD monomers raised issues related to the ability of this enzyme family of binding to biological membranes. Such information broadens the knowledge of the basic mechanisms of enzyme action, increasing the possibility of interaction partners and may lead to other forms of control of the biological activity for use in biotechnological applications, such as biosensors development. The study of this enzyme is therefore, aimed at understanding their interactions with mimetic membrane and immobilization attempts of the protein in these structures. For this purpose, we make use of biophysical techniques such as circular dichroism, differential scanning calorimetry and optical spectroscopies and biomolecular techniques, such as development of primers, polymerase chain reaction and restriction analysis. The other aspect of this dissertation is focused on the study of acyl-CoA binding protein of Cryptococcus neoformans (CnACBP) cloned for first time in our laboratory. Homologues of ACBP were found in all organisms distributed in the four kingdoms of eukaryotes, with high sequence similarity (~ 48%). Its widespread presence and their involvement in several key metabolic pathways related to the acyl-CoA ester led to the conclusion that ACBP is a housekeeping protein and not a specific protein contained a specialized cell type. Here we present an initial characterization of CnACBP that seeks to relevant issues regarding the proteins function. Our goal was to increase the still vague knowledge on how electrical charges and the presence of the binding partner may influence the structure, stability and function through thermodynamic and spectroscopic techniques. This is an initial step toward the full understanding of the role of protein in the cell.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cryptococcus neoformans is one yeast opportunist that it unchains meningitis in imunocompetentes patients in such a way as in patients This work had as objective to study the varieties (neoformans and gattii) of isolated C.neoformans in the State of Sergipe from the liquor liquid of patients with infectious miningitis. Also had as objective to determine the sensitivity of C. neoformans variety neoformans and variety gattii, isolated of the líquor of patients with infectious meningite in the State of Sergipe, through the microdilution method (NCCLS) and to determine the sexual type - mating type of isolated physicians of Cryptococcus neoformans through the Reaction in Chain of DNA Polimerase (PCR) in Sergipe. Samples of the LCR had been used that had given entered in the IPH/LACEN/SE in the period of 2001 the 2004. Direct microscopy through the coloration with Nanquim Ink was carried through. An aliquot one of the líquor (0,1mL) was transferred to pipes contends Agar Sabouraud with clorafenicol and incubado in ambient temperature 25ºC and 37ºC. Tests for presumptive, fenotípica identification had been carried through in half Níger and of the varieties in half CGB. In the analyzed period, only one sample presented fenotípicas characteristics in half Níger differentiated of the others. Of the total of 15 samples analyzed in half CGB, 02 samples (13,33%) if had presented positive, or either, had been identified as variety gattii, being one of them isolated one of soronegativo patient for HIV (patient not aidético). The others 13 samples (86,67%) had presented negative CGB, or either, they had been identified as variety neoformans. The majority of the isolated samples of Cryptococcus neoformans of the líquor of patients with infectious meningite is of the variety neoformans in Sergipe. For the accomplishment of the sensitivity test variety had been used two samples of C. neoformans var. gattii and 11 of C. neoformans listed variety neoformans above. For control of the tests standard ATCC 32608 was used. After that suspension of fúngicas cells. The following antifungal had been used: Anphotericin B, Fluconazol, Cetoconazol, Miconazol, Itraconazol, 5- Fluorocitosina and Terbinafrina. The fungal suspension was adjusted in a final concentration of 0,5x10³ for 2,5x10³ UFC in the half RPMI. The experiment was carried through in microtitulação plates. After the inoculation, the microdilution plates had been incubadas 37ºC and deal in 24, 48 and 72 hours. The end point of the CIM was determined in the readings of 48 and 72 hours. The isolated physicians of C. neoformans had presented high values of CIM for the antifungal agents tested, what he mainly symbolizes one high tax of resistance Anfotericina B and to the Fluconazol, given that he can be correlated with the clinical data. For analysis of mating type sexual of C. neoformans from the líquor of patients with infectious meningite in Sergipe during the period of 2001 and 2004 had been used 13 samples. The related laboratoriais procedures to molecular biology (extration of DNA and accomplishment of the PCR) had followed as Chatuverdi reference et al. (2000). All the samples of C.neoformans tested, as much that pertaining to the variety neoformans as gattii are matting type, considered of bigger virulence. / Cryptococcus neoformans é um fungo oportunista que desencadeia meningite tanto em pacientes imunocompetentes como em pacientes hígidos Este trabalho teve como objetivo estudar as variedades (neoformans e gattii) de Cryptococcus neoformans isolados no Estado de Sergipe a partir do LCR de pacientes com meningite infecciosa. Também teve como objetivo determinar a sensibilidade de C. neoformans variedade neoformans e variedade gattii, isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa no Estado de Sergipe, através do método de microdiluição (NCCLS) e determinar o mating type de isolados clínicos de Cryptococcus neoformans através da Reação em Cadeia da DNA Polimerase em Sergipe. Foram utilizadas amostras do LCR que deram entrada no IPH/LACEN/SE no período de 2001 a 2004. Foi realizada microscopia direta através da coloração com Tinta Nanquim. Uma alíquota do líquor foi transferida para tubos contendo Agar Sabouraud com clorafenicol e incubado em temperatura ambiente 25ºC e a 37ºC.Foram realizadas provas para identificação presuntiva, fenotípica em meio Níger e das variedades em meio CGB. No período analisado, apenas uma amostra apresentou características fenotípicas em meio Níger diferenciada das outras. Do total de 15 amostras analisadas em meio CGB, 02 amostras (13,33%) se apresentaram positiva, ou seja, foram identificadas como variedade gattii, sendo uma delas isolada de paciente soronegativo para HIV (paciente não aidético). As outras 13 amostras (86,67%) apresentaram CGB negativo, ou seja, foram identificadas como variedade neoformans. A maioria das amostras de Cryptococcus neoformans isolados do líquor de pacientes com meningite infecciosa são da variedade neoformans em Sergipe. Para a realização do teste de sensibilidade foram utilizadas duas amostras de C. neoformans variedade gattii e 11 de C. neoformans variedade neoformans listadas acima. Para controle dos testes foi utilizada a cepa padrão ATCC 32608. Em seguida foi realizada a preparação do inóculo. Foram utilizados os seguintes antifúngicos: Anfotericina B, Fluconazol, Cetoconazol, Miconazol, Itraconazol, 5- Fluorocitosina e Terbinafrina. A suspensão fúngica foi ajustada numa concentração final de 0,5x10³ para 2,5x10³ UFC no meio RPMI. O experimento foi realizado em placas de microtitulação. Após a inoculação, as placas de microdiluição foram incubadas a 37ºC e lida em 24, 48 e 72 horas. O ponto final da CIM foi determinado nas leituras de 48 e 72 horas. Os isolados clínicos de C. neoformans apresentaram valores altos de CIM para os agentes antifúngicos testados, o que simboliza uma alta taxa de resistência principalmente a Anfotericina B e ao Fluconazol, dado que pode ser correlacionado com os dados clínicos. Para análise do mating type sexual foram utilizadas 13 amostras de C. neoformans a partir do líquor de pacientes com meningite infecciosa em Sergipe durante o período de 2001 e 2004. Os procedimentos laboratoriais relacionados à biologia molecular seguiram como referência Chatuverdi et al. (2000). Todas as amostras de C. neoformans tanto aquelas pertencentes à variedade neoformans como gattii são matting type a, considerado de maior virulência.