Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-07-28T11:13:37Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Carolina Martins Treméa - 2015.pdf: 3039510 bytes, checksum: 5e06579e2f9fb745276cc6cc6cd1866e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-07-28T11:15:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Carolina Martins Treméa - 2015.pdf: 3039510 bytes, checksum: 5e06579e2f9fb745276cc6cc6cd1866e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T11:15:34Z (GMT). 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The aims of this work were to determine the isolated or associated antifungal activity of EOs and major constituents with amphotericin B (AMB) or fluconazole (FLU) on 15 isolates and two standard strains of C. neoformans complex, evaluate the time-kill curve, the action on the biosynthesis of ergosterol and on cell membrane, in addition to verify the cytotoxicity of EOs and major constituents on human erythrocytes. By in vitro susceptibility testing and minimum fungicidal concentration (MFC), the best activities were to L. cubeba and citral. The EOs and major constituents exhibited minimum inhibitory concentration (MIC) between 16 and 512 μg/mL and 64 and 2048 μg/mL, with a MIC90 of 128 μg/mL for L. cubeba and citral, and 512 μg/mL for C. martini and geraniol. To evaluate the association of EOs and major constituents with antifungal agents was performed the Chequerboard method, that showed indifference in the association of AMB and L. cubeba (94.1%) or citral (70.6%). In association with FLU, L. cubeba was antagonistic (76.5%) and indifferent (94%) for citral. C. martini and geraniol showed synergism associated with AMB, respectively, in 52.9 and 70.6% of isolates, and showed indifference when associated with the FLU in 64.7% and 88.2%. C. gattii 24065 time-kill curve under the action of EOs and major constituents showed a rapid fungicidal activity, which occurred after one hour incubation for L. cubeba, C. martini and geraniol, and after two hours for citral. The amount of ergosterol was quantified after contact with the EOs and major constituents and showed that L. cubeba and citral inhibited 100% of sterol biosynthesis in MIC and 64% for C. martini. This is the probably mechanism of action of these agents, except for geraniol, which reduced only 12% in MIC. The major compounds of EOs showed no ability to injure the plasma membrane of C. gattii, since an average of 2.7% propidium iodide labeled cells were detected by flow cytometry. The in vitro cytotoxicity assay by hemolysis showed that EOs and major constituents were not toxic in the MIC and MFCs. Taken together, our results showed that the EOs of L. cubeba and C. martini and their major constituents, citral e geraniol are promising as candidates for new antifungal agents. / A criptococose é uma infecção fúngica causada por espécies do complexo Cryptococcus neoformans (C. neoformans e C. gattii) com alta incidência em indivíduos com a síndrome da imunodeficiência adquirida (aids). Os antifúngicos utilizados na terapia dessa infecção são escassos e, além disso, possuem toxicidade evidente e baixa eficácia, o que motiva a busca por novos candidatos a antifúngicos. Os óleos essenciais (OEs) extraídos do fruto de Litsea cubeba (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) e das folhas de Palmarosa (Cymbopogon martini (Roxb.) Will. Watson) e seus constituintes majoritários, citral e geraniol, foram investigados como fontes de ação antifúngica. Os objetivos foram determinar a atividade antifúngica isolada e associada à anfotericina B (AMB) ou fluconazol (FLU) sobre 15 isolados e duas cepas padrão do complexo C. neoformans, além de avaliar a curva de morte, a ação sobre a biossíntese do ergosterol e sobre a membrana celular do fungo e a citotoxicidade dos OEs e constituintes majoritários sobre hemácias humanas. Por meio de testes de suscetibilidade in vitro e de concentração fungicida mínima (CFM), verificou-se melhor atividade para L. cubeba e citral. Os OEs e constituintes majoritários avaliados exibiram concentração inibitória mínima (CIM) entre 16 e 512 μg/mL e CFM entre 64 e 2048 μg/mL, com CIM90 de 128 μg/mL para L. cubeba e citral e de 512 μg/mL para C. martini e geraniol. Para avaliar a associação dos OEs com antifúngicos foi realizado o método de Chequerboard, onde houve indiferença na associação de AMB a L. cubeba (94,1%) e citral (70,6%), e na associação com FLU, L. cubeba foi antagônico (76,5%) e citral indiferente (94,%). C. martini e geraniol apresentaram sinergismo associados a AMB, respectivamente, em 52,9 e 70,6% dos isolados, e indiferença associado ao FLU em 64,7% e 88,2%. A curva de morte de C. gattii 24065 sob ação dos OEs e constituintes majoritários mostrou uma rápida ação fungicida, que ocorreu após uma hora de incubação para L. cubeba, C. martini e geraniol, e em duas horas para o citral. A quantificação do ergosterol após contato com os OEs e constituintes majoritários mostrou que L. cubeba e citral inibiram 100% da biossíntese desse esterol na CIM e 64% para C. martini, o que provavelmente é um mecanismo de ação destes agentes, exceto para o geraniol, que reduziu apenas 12% na CIM. Os OEs e compostos majoritários não apresentaram capacidade de lesionar a membrana plasmática de C. gattii, visto que em média de 2,7% das células foram marcadas com iodeto de propídio e detectadas por citometria de fluxo. O ensaio de citotoxicidade in vitro por hemólise mostrou que os OEs e constituintes majoritários não foram tóxicos nas CIMs e CFMs. Os resultados observados no presente trabalho mostram que os OEs de L. cubeba e C. martini e seus constituintes majoritários, citral e geraniol, são promissores candidatos a antifúngicos.

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system

Espécies de fungos dos gêneros Candida e Trichophyton e Cryptococcus neoformans são os mais importantes agentes causadores de micoses em humanos. A seleção de linhagens tolerantes aos fungicidas atualmente utilizados torna extremamente necessário o desenvolvimento de novas estratégias para o controle desses patógenos. A inativação fotodinâmica (IF) de fungos baseia-se na utilização de um fotossensibilizador (FS) que se acumula preferencialmente nas células-alvo e que pode ser ativado por exposições à luz visível. A ativação do FS induz a formação de espécies reativas de oxigênio que matam a célula fúngica. O uso de FS para o tratamento de micoses é uma aplicação recente e promissora da IF de fungos. No presente estudo, foram avaliados os efeitos dos tratamentos fotodinâmicos (TF) com os FS fenotiazínicos azul de metileno (MB), azul de toluidina (TBO), novo azul de metileno (NMBN), o derivado pentacíclico do azul de metileno S137 e com uma cloroalumínio ftalocianina em nanoemulsão (ClAlPc/NE) nas leveduras Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cryptococcus neoformans e nos microconídios dos dermatófitos Trichophyton mentagrophytes e T. rubrum. Os efeitos dos TF com os diferentes FS fenotiazínicos também foram avaliados na linhagem celular L929 de camundongo. Inicialmente, a eficácia dos TF foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de cada FS para cada dose de luz. Adicionalmente, nas condições otimizadas, também foram determinados os efeitos dos TF na sobrevivência das diferentes espécies de fungos. Os MICs variaram tanto entre FS como entre espécies e diminuíram com o aumento da dose de luz. Entre os FS fenotiazínicos, para a maioria dos tratamentos (espécies e doses de luz), o NMBN e o S137 apresentaram os menores MICs. Os MICs para o NMBN e para o S137 foram <= 2,5 ?M para todas as espécies de Candida, para doses >= 20 J cm-2. MICs para a ClAlPc/NE foram tão baixos quanto 0,01 ?M para algumas das espécies de Candida. O TF com NMBN e S137 resultaram em redução de pelo menos 3 logs na sobrevivência de todas as espécies de Candida e de Trichophyton. O TF com ClAlPc/NE resultou em redução de até 4 logs na sobrevivência de C. albicans e C. tropicalis e de até 6 logs na sobrevivência de células melanizadas de C. neoformans. A internalização da ClAlPc foi confirmada por microscopia confocal de fluorescência e a quantidade incorporada pelas células foi dependente da concentração do FS. As toxicidades relativas entre os diferentes FS para as células de mamífero foram semelhantes às observadas em fungos, por exemplo maior toxicidade e fototoxicidade do NMBN e do S137 comparada às do MB e TBO / Fungal species of the genera Candida and Trichophyton and Cryptococcus neoformans are the main responsible for mycoses in humans. The selection of fungal strains resistant to currently used fungicides makes the development of alternative fungus-control techniques highly desirable. Fungal photodinamic inactivation (PI) is based on the use of a visible light-activate photosensitiser (PS) that preferentially accumulates in the cell of the target microorganism. The activation of the PS starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) that kill the fungal cell. The use of PS to treat mycoses is a novel and promising application of PI. In the present study, the effects of the photodynamic treatments (PDT) with the phenothiazinium PS methylene blue (MB), toluidine blue O (TBO), new methylene blue N (NMBN), the novel pentacyclic photosensitiser S137 and with a chloroaluminum phthalocyanine nanoemulsion (ClAlPc/NE) on the yeasts Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis and Cryptococcus neoformans and on microconidia of the dermatophytes Trichophyton mentagrophytes and T. rubrum were evaluated. The effects of the PDT with the phenothiazinium PS were also evaluated on the mouse fibroblast cell line L929. The efficacies of the PDT were evaluated initially by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) of each PS for each light dose. Additionally, for the optimized conditions, the effects of the PDT on the survival of the different fungal species were also determined. MICs varied both among PS and species and decreased with light dose increase. Among the phenothiazinium PS, for most treatments (species and light doses), NMBN and S137 showed the lowest MICs. MICs for NMBN and S137 were <= 2.5 ?M for all the Candida species to light doses >= 20 J cm-2. MICs for ClAlPc/NE were as low as 0.01 ?M for some of the Candida species. PDT with NMBN and S137 resulted in a reduction of at least 3 logs in the survival of all Candida and Trichphyton species. PDT with ClAlPc/NE resulted in reductions up to 4 logs in the survival of C. albicans and C. tropicalis and up to 6 logs in the survival of C. neoformans melanized cells. Internalization of ClAlPc by C. neoformans was confirmed by confocal fluorescence microscopy, and the degree of uptake was dependent on PS concentration. The relative toxicities among the different PS to mammalian cell were similar to the antifungal data, i.e. greater toxicity and phototoxicity with NMBN and S137 compared to MB and TBO.

<p>Cryptococcus neoformans is an opportunistic fungal pathogen that causes significant disease worldwide. Even though this fungus has not evolved specifically to cause human disease, it has a remarkable ability to adapt to many different environments within its infected host. C. neoformans adapts by utilizing conserved eukaryotic and fungal-specific signaling pathways to sense and respond to stresses within the host. Upon infection, two of the most significant environmental changes this organism experiences are elevated temperature and high pH. </p><p>Conserved Rho and Ras family GTPases are central regulators of thermotolerance in C. neoformans. Many GTPases require prenylation to associate with cellular membranes and function properly. Using molecular genetic techniques, microscopy, and infection models, I demonstrated that the prenyltransferase, geranylgeranyl transferase I (GGTase I) is required for thermotolerance and pathogenesis. Using fluorescence microscopy, I found that only a subset of conserved GGTase I substrates requires this enzyme for membrane localization. Therefore, the C. neoformans GGTase I may recognize its substrate in a slightly different manner than other eukaryotic organisms. </p><p>The alkaline response transcription factor, Rim101, is a central regulator of stress-response genes important for adapting to the host environment. In particular, Rim101 regulates cell surface alterations involved in immune avoidance. In other fungi, Rim101 is activated by alkaline pH through a conserved signaling pathway, but this pathway had yet been characterized in C. neoformans. Using molecular genetic techniques, I identified and analyzed the conserved members of the Rim pathway. I found that it was only partially conserved in C. neoformans, missing the components that sense pH and initiate pathway activation. Using a genetic screen, I identified a novel Rim pathway component named Rra1. Structural prediction and genetic epistasis experiments suggest that Rra1 may serve as the Rim pathway pH sensor in C. neoformans and other related basidiomycete fungi. </p><p> To explore the relevance of Rim pathway signaling in the interaction of C neoformans with its host, I characterized the Rim101-regulated cell wall changes that prevent immune detection. Using HPLC, enzymatic degradation, and cell wall stains, I found that the rim101Δ mutation resulted in increased cell wall chitin exposure. In vitro co-culture assays demonstrated that increased chitin exposure is associated with enhanced activation of macrophages and dendritic cells. To further test this association, I demonstrated that other mutant strains with increased chitin exposure induce macrophage and dendritic cell responses similar to rim101Δ. We used primary macrophages from mutant mouse lines to demonstrate that members of both the Toll-like receptor and C-type lectin receptor families are involved in detecting strains with increased chitin exposure. Finally, in vivo immunological experiments demonstrated that the rim101Δ strain induced a global inflammatory immune response in infected mouse lungs, expanding upon our previous in vivo rim101Δ studies. These results demonstrate that cell wall organization largely determines how fungal cells are detected by the immune system.</p> / Dissertation

Orientador : Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Fernando Rogério Pavan / Banca: Patricia Albuquerque de Andrade Nicola / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Resumo: O aumento de micoses invasivas e o desenvolvimento de mecanismos de resistência de algumas espécies de fungos, frente aos fármacos utilizados na terapia, têm sido preocupante. O tratamento antifúngico, geralmente é agressivo e o surgimento da resistência antifúngica acrescenta dificuldades adicionais no tratamento dessas infecções. Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os principais agentes etiológicos da criptococose, e afetam principalmente pacientes imunodeprimidos. Nesse trabalho foi realizada a caracterização morfológica e da virulência de três isolados clínicos de C. neoformans e dois isolados ambientais de C. gattii em Galleria mellonella, além da análise do nível de expressão dos genes MDR1 e AFR1 envolvidos no funcionamento de bomba de efluxo, através da quantificação relativa por PCR (polimerase chain reaction) em tempo real. Uma vez esses genes quantificados, esses isolados foram usados na prospecção de moléculas sintéticas para verificação da atividade inibitória dos genes selecionados, após o contato com as mesmas. Os isolados foram classificados como sensível (26S), sensibilidade intermediária (27I) e resistente (30R) da espécie neoformans e da espécie C. gattii, um foi resistente (118R) e outro sensível (CL), in vitro, a fluconazol. As moléculas selecionadas para os testes foram o ácido gálico e seus derivados sintéticos, e os melhores resultados observados foram obtidos a partir dos galatos de alquila G11, G12, G14, G15, G16 e G17, apresentando ótima atividade antifúngica contra os isolados testados, em especial os galatos G14, G16 e G17, obtendo ótima atividade antifúngica. O galato de n-dodecila (G16), foi selecionado para os demais testes apresentando atividade aditiva no teste de sinergismo, quando utilizado em associação com fluconazol, reduzindo os valores de CIM para o mesmo, o que mostra a possível... / Abstract: The increase of invasive mycoses and the development of antifungal resistance by some fungi species have been worrying. The antifungal treatment is usually aggressive and inefficient, and the emergence of antifungal resistance increases the difficulties in treating these fungi infections.Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii are the main etiologic agents of cryptococcosis andespecially affect immunocompromised patients. In this work the Galleria mellonella, was used to perform the morphologic characterization as well as determine the virulence of three sequential clinical isolates of C. neoformansand twoisolates environmental of C. gattii. In addition, was held the analysis of genes expressions (MDR1, ERG11 and AFR1), that are involved in efflux pumps and ergosterol synthesis, by real time PCR (polimerase chain reaction) assay. After these characterizations the isolates were used in the prospecting of synthetic molecules to verify the inhibitory activity of selected genes. After incubation in vitro with fluconazole the C.neoformans isolates were classified as sensitive (26S), intermediate sensitivity (27I) and resistant (30R), and the C. gattiiisolates were resistant (118R) and the other sensitive (LC). The galic acid molecules and their synthetic derivatives were tests against C.neoformans and C. gattii isolates.The best results were obtained from alkyl gallates G11, G12, G14, G15, G16 and G17 which shows a great antifungal activity, especially G14, G16 e G17. The gallate n-dodecyl (G16), was select to others tests once presented additive activity in synergism test with fluconazole, decreasing the MIC values. The gene expression assay shows that both isolates expressed MDR1 and AFR1 (encoding efflux pumps), and the G16 was capable to inhibit these genes which makes this molecule promising for inhibiting efflux. With virulence assays using the G. mellonella was possible ... / Doutor

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Jean Leandro dos Santos / Coorientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Daniel Assis dos Santos / Banca: Luciana Trilles / Banca: Valéria Valente / Banca: Reginaldo dos Santos Pedroso / Resumo: Criptococose é uma importante micose sistêmica que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos e é classificada como a infecção fúngica com maior mortalidade entre indivíduos portadores de HIV. Cryptococcus neoformans é uma levedura capsulada e o principal agente etiológico da criptococose; encontra-se dispersa no meio ambiente na forma de basidiósporos, os quais são responsáveis pela infecção em humanos e animais. As principais manifestações clínicas estão associadas à infecção pulmonar e meningite. A terapia se dá basicamente com a administração de anfotericina B (AMB) na terapia de ataque associada ou não a 5-fluocitosina e como manutenção é indicado ao longo do tratamento o fluconazol (FCZ). Apesar de esta terapêutica ser eficiente, é constatado elevado número de casos de reincidência e desenvolvimento de resistência aos azóis, além de problemas de toxicidade. Diante desta problemática, este estudo propõe o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para o tratamento da criptococose, visando duas abordagens distintas. A primeira, aplicando novo composto antifúngico e a segunda, o estudo de microRNAs (miRNAs) envolvidos na interação da levedura e células de glioblastoma humano (U87-MG), com a finalidade de usá-los como reguladores da infecção, sendo esta uma estratégia recentemente divulgada em uma variedade de doenças. Para tanto, inicialmente moléculas análogas de resveratrol foram avaliadas quanto a atividade antifúngica e o derivado orto,orto-HDZ (HDZ) mostrou forte atividade fungicida contra isolados de C. neoformans, com valores de concentração fungicida mínima (CFM) variando entre 0,97 a 7,81 µg/mL. A associação entre HDZ e FCZ mostrou sinergia com potencialização do efeito do FCZ em até 64 vezes para um isolado clínico resistente. Baixa toxicidade foi... / Abstract: Cryptococcosis is an important systemic mycosis that mainly affects immunocompromised patients and is classified as the fungal infection with higher mortality among individuals with HIV. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast and the main etiologic agent of cryptococcosis. This yeast is dispersed into the environment in the form of basidiospores, which are responsible for infection in humans and animals. The main clinical manifestations are associated with pulmonary infection and meningitis. The treatment is basically the administration of amphotericin B (AMB) as therapy consolidation with or without the use of 5-flucytosine and, for the maintenance therapy, fluconazole (FCZ) is indicated. Although this therapy is effective, it is observed high number of cases of relapses, development of resistance to azoles and toxicity problems. In front of these problems, this study proposes the development of new therapies for the treatment of cryptococcosis, targeting two distinct approaches. The first aims a new antifungal compound and the second the study microRNAs (miRNAs) involved in the interaction between yeast and human glioblastoma cells (U87-MG), in order to use them as regulators of infection, since this is a recently disclosed strategy in a variety of diseases. For this purpose, initially, analogs of resveratrol molecule were evaluated for antifungal activity and the derived ortho,ortho-HDZ (HDZ) showed a strong fungicidal activity against isolates of C. neoformans with values of minimum fungicidal concentration (MFC) ranging between 0.97 to 7.81 µg/mL. The association between HDZ and FCZ showed synergy with potentiation of the effect of FCZ in up to 64 times for a resistant clinical isolate to FCZ. Low toxicity was observed in in vitro and in vivo assays (Galleria mellonella and mice), despite showing changes in ... / Doutor

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-02-09T11:45:00Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kamila Pereira da Silva - 2014.pdf: 1336089 bytes, checksum: 2658c99debc59b350392edc7239568d9 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-02-20T10:55:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kamila Pereira da Silva - 2014.pdf: 1336089 bytes, checksum: 2658c99debc59b350392edc7239568d9 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-20T10:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kamila Pereira da Silva - 2014.pdf: 1336089 bytes, checksum: 2658c99debc59b350392edc7239568d9 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-05-14 / Fungal infections caused by yeasts of Cryptococcus neoformans complex have increased considerably among immunosuppressed especially in patients infected with human immunodeficiency virus (HIV). Antifungal drugs available to treat these infections have a wide spectrum of action, but the high costs, side effects, besides the acquisition of resistance of fungi make their limited effectiveness. In these circumstances, the search for new drugs is needed. In the present study, we evaluated the antifungal activity of tamoxifen, bisabolol, indinavir, didanosine, UFMG, Labiocon 241, solasodine, Labiocon 237, Clonazepam, semicarbonado Benzaldehyde, Cardanol, AB 36 and three natural extracts of Psychotria spp, Sclerolobium paniculatum, Hymenaea courbaril and cell viability and mechanism of action of the compound showed antifungal activity of 20 isolates of Cryptococcus neoformans. To evaluate the antifungal activity , we used the in vitro susceptibility to yeast broth microdilution protocol M27 - A3 ( CLSI 2008) and to verify the mechanism of action, flow cytometry was performed with the cellular marker Propidium Iodide ( PI ) and cell viability assay with MTT salt. Among the compounds analyzed, only tamoxifen and olanzapine showed inhibitory action on fungal samples at concentrations 128-256 μg/mL. Analysis by flow cytometry was performed with tamoxifen and showed that the compound did not alter the cell membrane of Cryptococcus neoformans ATCC 28957 , however, the cell viability test showed that tamoxifen was able to inhibit the metabolism of the fungus in different concentrations ranging 4-1024 μg/mL. / As infecções fúngicas causadas por leveduras do complexo Cryptococcus neoformans tem sido reduzida entre os imunossuprimidos principalmente nos pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Os antifúngicos disponíveis para o tratamento destas infecções apresentam um amplo espectro de ação, porém os altos custos, efeitos colaterais, além da aquisição de resistência dos fungos tornam sua eficácia limitada. Nestas circunstâncias, a busca por novos fármacos é necessária. No presente trabalho, foi avaliada a atividade antifúngica de tamoxifeno, bisabolol, indinavir, didanosina, Olanzapina, UFMG, Labiocon 241, Solasodina, Labiocon 237, Clonazepam, Benzaldeído semicarbonado, Cardanol, AB 36 e três extratos naturais obtidos de Psychotria spp, Sclerolobium paniculatum, Hymenaea courbaril. A viabilidade celular e o mecanismo de ação do composto que apresentou ação antifúngica sobre 20 isolados de Cryptococcus neoformans formam determinados. A atividade antifúngica foi realizada utilizando-se o método microdiluição em caldo para leveduras. Para verificar do mecanismo de ação, foi realizada a citometria de fluxo com o marcador celular Iodeto de Propídio (PI), enquanto que o teste da viabilidade celular foi obtido usando-se o sal MTT. Dentre os compostos analisados, apenas o tamoxifeno e olanzapina apresentaram ação inibitória sobre as amostras fúngicas, em concentrações de 128 a 256 μg/mL. Pela análise por citometria de fluxo com o tamoxifeno não se verificou alteração da membrana celular de Cryptococcus neoformans ATCC 28957. Entretanto, o tamoxifeno inibiu o metabolismo do fungo em diferentes concentrações, variando de 4 a 1024 μg/mL verificado pelo teste da viabilidade celular.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:17:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Felipe Lopes Campos.pdf: 553352 bytes, checksum: e4d71e5d911a1305af8111fa2c150966 (MD5) Previous issue date: 2006-03-16 / The aim of this survey was the isolation of the Cryptococcus neoformans yeast from cats and dogs central nervous system in Rio de Janeiro City. Periodic collections were made from brain samples from April 2004 to July 2005 at the rabies diagnosis laboratory in the Jorge Vaitsman Veterinary Medicine Municipal Institute in Mangueira, RJ. According to the results, of the 201 clinical samples, we found four positives samples; one of these was positive for C. laurentii, three were positive for Cryptococcus neoformans; of which two were neoformans variety and one was gattii variety. Secondarily we compared with strains from the ICB-USP, previously isolated and identified as for urease and fenol-oxidase production in qualitative character, in the same way that the potential of virulence demonstrated to fosfolipase and protease production. Killer biotyping used in all isolates showed a predominance of biotype II to neoformans variety and biotype VIII to gattii variety. All isolates showed protease and fosfolipase production in varied degrees. lipase / Objetivando o isolamento da levedura Cryptococcus neoformans do sistema nervoso central de c?es e gatos no Munic?pio do Rio de Janeiro, procedeu-se ?s coletas peri?dicas, no per?odo de abril de 2004 a julho de 2005, de amostras de c?rebro, no Laborat?rio de Diagn?stico de Raiva do Instituto Municipal de Medicina Veterin?ria Jorge Vaitsman no bairro da Mangueira, Rio de Janeiro. Das 201 amostras obteve-se um total de quatro positivas para o g?nero; sendo uma de Cryptococcus laurentii e tr?s de C. neoformans, das quais duas revelaram-se pertencentes ? variedade neoformans e uma ? variedade gattii. Secundariamente, confrontamos estas com amostras obtidas junto ao ICB-USP, previamente isoladas e identificadas, quanto ao potencial de virul?ncia espelhado pela produ??o de fosfolipase e de protease. A biotipagem Killer empregada em todos os isolados demonstrou uma predomin?ncia do biotipo II para a variedade neoformans e biotipo VIII para a variedade gattii. Todos os isolados apresentaram-se produtores de protease e de fosfolipase, em diferentes graus.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:17:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Pablo Waldeck Goncalves de Souza.pdf: 2011389 bytes, checksum: 2d903c70e0f497dfa879d5f386e128c6 (MD5) Previous issue date: 2008-03-07 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The objective of this paper was determined the presence of Cryptococcus neoformans in cockroach (Periplaneta americana) collected in public places. The motivation for this research was based on the fact that this species of cockroach is synanthropic and vehicle of several pathogenic agents for man and animals. The insect were collected already dead and also collected alive using different traps, at all, were 150 samples. The research of the presence of the agents in the insects was made in Laboratory of Pathogenic and Environmental Yeasts, Department of Microbiology and Immunology Veterinary, Institute of Veterinary, UFRRJ, by the process of the exoskeleton and the internal content of then, sowing in cultivation medium containing dopamine. The confirmations of isolation were made by macromorfology and micromorfology test, realization of auxanographic method and complementally proofs. Was not obtained isolation of Cryptococcus neoformans of exoskeleton. Were obtained 5 isolated (3%), starting by the content of the insects that, after the serogrouping in CGB medium, show them self as belonging to AD serum group. Test show that 80% of the stumps are big producing of phospholipase and 100% big producing of protease. We considerate that the cockroaches of the species Periplaneta americana are,potentially, a vector for the studied yeast. / O objetivo deste trabalho foi determinar a presen?a de Cryptococcus neoformans em baratas (Periplaneta americana) recolhidas de ambientes p?blicos. A motiva??o para esta pesquisa deve-se ao fato desta esp?cie de barata ser sinantr?pica e veiculadora de v?rios agentes patog?nicos para o homem e animais. Os insetos foram recolhidos mortos e tamb?m capturados vivos por meio de duas diferentes armadilhas, totalizando 150 amostras. A pesquisa da presen?a do agente nos insetos foi feita no Laborat?rio de Leveduras Patog?nicas e Ambientais, Depto de Microbiologia e Imunologia Veterin?ria, Instituto de Veterin?ria, UFRRJ, por processamento do exoesqueleto e do conte?do interno dos mesmos, com semeadura em meio de cultivo contendo dopamina. As confirma??es de isolamento foram realizadas por meio de testes de macromorfologia, micromorfologia, realiza??o de auxanograma e provas complementares. N?o foi obtido isolamento de Cryptococcus neoformans de exoesqueleto. Foram obtidos 5 isolamentos (3%) a partir do conte?do interno dos insetos que, ap?s sorogrupagem em meio CGB revelaram-se como pertencentes ao sorogrupo AD. Testes evidenciaram que 80% das cepas s?o forte produtoras de fosfolipase e 100% forte produtoras de protease. Consideramos que as baratas da esp?cie Periplaneta americana s?o um potencial vetor para a levedura estudada.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina los genotipos y la sensibilidad a los antifúngicos de cepas de Cryptococcus neoformans, provenientes de aislamientos clínicos y ambientales efectuados en la ciudad de Lima. El estudio es descriptivo. La población de microorganismos está constituida por cepas de Cryptococcus neoformans provenientes de aislamientos clínicos y ambientales. Para determinar el genotipo se utiliza la técnica del análisis del polimorfismo en longitud de fragmentos amplificados (AFLP), según instrucciones del fabricante. Para determinar la sensibilidad se utiliza un panel de 3 compuestos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol y voriconazol. Mediante la técnica del AFLP, se determina que el 50% de las cepas son del genotipo AFLP1 (16) y el 40,6% del genotipo AFLP1B (13), ambos correspondieron a C. neoformans var. grubii; asimismo, el 6,3% resulta ser del genotipo AFLP2 (2) (C. neoformans var. neoformans) y el 3,1% es del genotipo AFLP3 (1), es decir, un híbrido entre las dos variedades de C. neoformans. Los perfiles de sensibilidad antifúngica para la anfotericina B, fluconazol y voriconazol indicaron que las 32 cepas de C. neoformans son sensibles a los 3 compuestos antifúngicos. Se observa que C. neoformans var. grubii (AFLP1 y AFLP1B) y C. neoformans var. neoformans (AFLP2) son las únicas variedades de Cryptococcus implicadas en infecciones en humanos. Asimismo, se demuestra que todas las cepas son sensibles a los antifúngicos probados, de acuerdo a lo reportado en la literatura internacional. / Tesis