Thesis (Ph.D.)--McMaster University, 2006. / Supervisor: Jianping Xu). Includes bibliographical references.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (D.P.H.)--University of Alabama at Birmingham, 2010. / Title from PDF title page (viewed on July 1, 2010). Includes bibliographical references.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-27Bitstream added on 2014-06-13T20:24:16Z : No. of bitstreams: 1 diniz_jnm_dr_arafcf.pdf: 718250 bytes, checksum: ad07abef21dc44356500905c93cbf5e5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cryptococcus neoformans é levedura capsulada saprobiota que acomete principalmente indivíduos com o sistema imunológico comprometido. Seu habitat está relacionado com algumas espécies de árvores, madeira em decomposição e fezes de pássaros, em especial de pombos do gênero Columba livia. Nas grandes cidades estas aves vêm causando diversos problemas devido a sua multiplicação intensa. Desta maneira, medidas saneantes serão de grande auxílio para controlar a população desta levedura. Assim, este estudo teve como objetivo reidentificar 67 isolados de C. neoformans de fontes ambientais e caracterizá-los quanto ao seu genótipo e perfil de sensibilidade aos antifúngicos anfotericina B, cetoconazol, itraconazol e fluconazol, utilizando o método da difusão em ágar seguindo o documento M44A e determinando a concentação inibitória mínima frente a fluconazol pelo método M27-A2, ambos preconizados pelo CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute). Por outro lado, verificar o efeito antifúngico de extratos de plantas e sua atividade saneante em fezes de pombos comprovadamente contaminadas com isolado ATCC 90012 de C. neoformans. Todos isolados foram Mating Type α e tipo VNI. Pelo método de microdiluição, 21% (14/67) dos isolados ambientais apresentaram sensibilidade diminuída ao fluconazol com CIM de 16 μg/mL e mais de 50% (34/67) apresentaram CIM de 8 μg/mL.O extrato de Alibertia macrophylla apresentou efeito saneante com índice de eficiência de mais de 80% após 24 horas, na grande maioria dos isolados de C. neoformans. Este extrato foi estável... / Cryptococcus neoformans is a saprobiote capsuled yeast that proliferates mainly in individuals who have the immunologic system compromised. It natural habitat is related to some species of trees, decaying wood and bird excrement, in special Columba livia doves. In big cities, these birds have caused many problems due to its intense proliferation and the cleaning measures will be of great help in controlling this yeast. The aim of this study was to re-identify 67 C. neoformans isolates and characterize them according to their genotype and susceptibility to antifungal amphotericin B, cetoconazole, itraconazole e fluconazole, using the method of agar diffusion following the M44A document and determining the minimum inhibitory concentration to fluconazole by method M27-A2, both recommended by the CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute). On the other hand, the verification of the effect of plant extracts e and their cleaning activity on dove excrement previously contaminated with isolate ATCC 90012 of C. neoformans. All the isolates were Mating Type α and VNI. For the microdilution method, 21% (14/67) of the environmental isolates showed decreased susceptibility to fluconazole with MIC of 16 mg/mL and more than 50% (34/67) had MICs of 8 mg/mL. The extract of Alibertia macrophylla presented clean effect with index of efficiency of 80% after 24 hours, in the great majority of C. neoformans isolates. This extract was stable to the light incidence, to the heat and variation of pH. Our results are of great use for the development and utilization of active natural compounds in the fight against C. neoformans from environmental and the study of other variables are necessary for the viability of its use as a domestic cleaner.

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bernardina_morales_ipec_dout_2013.pdf: 4097768 bytes, checksum: a3e4244f0c2be9b0d8d257c5f8921c52 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies / Cryptococcosis is a system ic mycosis acquired by inhalation of dried yeasts or basidiospores of Cryptococus neoformans and Cryptococus gattii , these species can cause cryptococcosis opportunistic and primary respectively. C. neoformans is composed of molecular types VNI - VNIV and C. gattii VGI - VGIV they have different geographical distribution, the VNI type is cosmopolitan and is associated with AIDS, VGI type is predominant in Australia and the USA; while VGII type occurs in Brazil and Latin America. This paper aims to conduct a comparative study of the molecular types VNI C. neoformans and VGI, VGII C. gattii analyzing different aspects such as : 1 – The susceptibility profile in vitro of fluconazole ( FLZ ), itraconazole ( ITZ ), 5 - fluorocytosine ( 5FC ) and amphotericin B ( A MB ) alone and in combination with 5FC and AMB with voriconazole ( VRZ ) 2 – The minimum inhibitory concentration ( MIC ) by flow cytometry ( FCM ) comparing MIC of FLZ , ITZ and AMB with CLSI; 3 - The minimum lethal concentration ( MLC ) of AMB and 5FC, a lone and in combination; 4 - The action of melanin against 5FC and AMB alone and combined 5FC, 5 – The induced resistance in vitro to FLZ and standardize the fluorochromes: acetoximetil - calceína (calceina - AM), acetoximetil - 2’, 7’ - bis - (2 - carboxietil) - 5 - (e - 6) - carboxifluoresceína (BCECF - AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3’ – dipentiloxacarbocianina (DiOC5) in FCM to verify expression of efflux pumps; 6 - The compare the expression of efflux pumps. These results permitted the identification of dif ferent susceptibility phenotypes which were analyzed and compared between the two species and molecular types, allowing the production of four articles . T hus, we concluded that: 1 - The analysis of the molecular type VGII MICs presented less susceptibility against VGI and VNI, whereas in the combination of AMB and VRZ in vitro 100% indifference was observed, in the combination of AMB and 5FC we observed the need for standardization of the concentration of glucose for future tests which can be related to cli nical cases; 2 - the FCM method proved to be an alternative automated reproducible reading for antifungal susceptibility testing with use of Acridine Orange and FUN - 1, 3 - The importance of carrying out the MLC test to verify the protective action of mela nin when exposed to the combination of AMB and 5FC. 4 - Was also verified that expression of melanin, in combination AMB and 5FC reduces the detection of synergism and additive effect in vitro . 5 - The strains induced to resistance to fluconazole made it p ossible to obtain statistically significant results in the verification of acriviry of efflux pumps in vitro using FCM with fluorochrome Dioc5 and protonophores blocker CCCP, 6 - It was found that 65% isolates no inducted to resistance and 90% isolates ind ucted to resistance of the molecular ty pe VGII expels the FLZ with a certain advantage in relation to the molecular types VNI and VGI. The results of these studies contribute to the understanding of the behavior in vitro of C. neoformans and C. gattii agai nst antifungal drugs and can be applied in clinical correlation studies in vitro and in vivo to better understand the antifungal therapy of cryptococcosis and validation of susceptibility testing for these two species.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:40Z : No. of bitstreams: 1 000851921.pdf: 11886045 bytes, checksum: 1cf15c01de888d44bc38aeeab19c7d88 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O aumento de micoses invasivas e o desenvolvimento de mecanismos de resistência de algumas espécies de fungos, frente aos fármacos utilizados na terapia, têm sido preocupante. O tratamento antifúngico, geralmente é agressivo e o surgimento da resistência antifúngica acrescenta dificuldades adicionais no tratamento dessas infecções. Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os principais agentes etiológicos da criptococose, e afetam principalmente pacientes imunodeprimidos. Nesse trabalho foi realizada a caracterização morfológica e da virulência de três isolados clínicos de C. neoformans e dois isolados ambientais de C. gattii em Galleria mellonella, além da análise do nível de expressão dos genes MDR1 e AFR1 envolvidos no funcionamento de bomba de efluxo, através da quantificação relativa por PCR (polimerase chain reaction) em tempo real. Uma vez esses genes quantificados, esses isolados foram usados na prospecção de moléculas sintéticas para verificação da atividade inibitória dos genes selecionados, após o contato com as mesmas. Os isolados foram classificados como sensível (26S), sensibilidade intermediária (27I) e resistente (30R) da espécie neoformans e da espécie C. gattii, um foi resistente (118R) e outro sensível (CL), in vitro, a fluconazol. As moléculas selecionadas para os testes foram o ácido gálico e seus derivados sintéticos, e os melhores resultados observados foram obtidos a partir dos galatos de alquila G11, G12, G14, G15, G16 e G17, apresentando ótima atividade antifúngica contra os isolados testados, em especial os galatos G14, G16 e G17, obtendo ótima atividade antifúngica. O galato de n-dodecila (G16), foi selecionado para os demais testes apresentando atividade aditiva no teste de sinergismo, quando utilizado em associação com fluconazol, reduzindo os valores de CIM para o mesmo, o que mostra a possível... / The increase of invasive mycoses and the development of antifungal resistance by some fungi species have been worrying. The antifungal treatment is usually aggressive and inefficient, and the emergence of antifungal resistance increases the difficulties in treating these fungi infections.Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii are the main etiologic agents of cryptococcosis andespecially affect immunocompromised patients. In this work the Galleria mellonella, was used to perform the morphologic characterization as well as determine the virulence of three sequential clinical isolates of C. neoformansand twoisolates environmental of C. gattii. In addition, was held the analysis of genes expressions (MDR1, ERG11 and AFR1), that are involved in efflux pumps and ergosterol synthesis, by real time PCR (polimerase chain reaction) assay. After these characterizations the isolates were used in the prospecting of synthetic molecules to verify the inhibitory activity of selected genes. After incubation in vitro with fluconazole the C.neoformans isolates were classified as sensitive (26S), intermediate sensitivity (27I) and resistant (30R), and the C. gattiiisolates were resistant (118R) and the other sensitive (LC). The galic acid molecules and their synthetic derivatives were tests against C.neoformans and C. gattii isolates.The best results were obtained from alkyl gallates G11, G12, G14, G15, G16 and G17 which shows a great antifungal activity, especially G14, G16 e G17. The gallate n-dodecyl (G16), was select to others tests once presented additive activity in synergism test with fluconazole, decreasing the MIC values. The gene expression assay shows that both isolates expressed MDR1 and AFR1 (encoding efflux pumps), and the G16 was capable to inhibit these genes which makes this molecule promising for inhibiting efflux. With virulence assays using the G. mellonella was possible ...

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-11Bitstream added on 2014-06-13T18:31:22Z : No. of bitstreams: 1 barboza_ls_me_sjrp_parcial.pdf: 54066 bytes, checksum: 3901016bbfd3977caa34c67746541ca7 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-28T16:08:50Z: barboza_ls_me_sjrp_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-28T16:09:56Z : No. of bitstreams: 1 000642588.pdf: 349486 bytes, checksum: eea3a5247c5cd27a996061bb9441acaa (MD5) / A criptococose é uma micose sistêmica que afeta principalmente o sistema nervoso central, causando meningite. Causada pela inalação de propágulos de fungos do gênero Cryptococcus sp, C neoformans acomete hospedeiros com imunodepressão celular, cujo maior contingente é representado por indivíduos com AIDS. A fonte principal de aquisição desta levedura são fezes de aves, principalmente pombos (Columba livia). C. gattii infecta indivíduos aparentemente imunocompetentes, sendo isolado principalmente em espécies de eucaliptos. C. albidus e C. laurentii aparece em casos de meningites, fungemias, pneumonias, abscessos pulmonares e infecções cutâneas. C.uniguttulatus é encontrado no trato gastrointestinal, fezes de pássaros e contaminante de leitos de animais e habitats de roedores. Termo-tolerância, parede celular, cápsula, adesão, e produção de enzimas são fatores importantes de virulência do gênero. São José do Rio Preto é a 5ª cidade entre os 100 municípios do estado de São Paulo em de casos de AIDS. Analisou-se morfologicamente e bioquimicamente 48 amostras clínicas e 155 ambientais. Amostras de líquor resultaram em 30 isolados da espécie C. neoformans, 17 de C. gattii e um de C. luteolus. Foram identificados 26 isolados de C.albidus, 22 de C. laurentii, 9 de C. neoformans, 5 de C. gattii e um de C.uniguttulatus nas amostras ambientais. A concentração inibitória mínima para antifúngicos foi determinada para todos os isolados por meio do teste de microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS. Os resultados obtidos mostraram resistência à anfotericina B e itraconazol nas cepas clínicas de C. neoformans e C. gattii, e as cepas de C.albidus e C. laurentii apresentaram resistência a 5-fluorcitosina, itraconazol e anfotericina B / Cryptococcosis is a systemic mycosis that mainly affects the central nervous system, causing meningitis. Caused by inhalation of seedlings of fungi of the genus Cryptococcus sp, C. neoformans affects hosts with immunosuppression cellular, whose largest contingent is represented by individuals with AIDS. The main source of acquiring this yeast is feces of birds, especially pigeons (Columba livia). C. gattii infects individuals apparently immunocompetent, being isolated mainly in species of eucalyptus. C. albidus and C. laurentii appear in cases of meningitis, nosocomial fungemia, pneumonia, lung abscesses and skin infections. C. uniguttulatus is found in the gastrointestinal tract and feces of birds and contaminant of beds of animals and habitats of rodents. Thermo-tolerance, cell wall, capsule, accession, and production of enzymes are important factors in the virulence of the genus. São José do Rio Preto is the 5th city among the 100 cities in the state of São Paulo in cases of AIDS. We analyzed morphologically and biochemically 48 clinical samples and 155 environmental. Liquor samples resulted in 30 isolates of the species C. neoformans, 17 of C. gattii and one of C. luteolus. We identified 26 isolates of C. albidus, 22 of C. laurentii, 9 of C. neoformans, 5 of C. gattii and one of C. uniguttulatus in environmental samples. The minimal inhibitory concentration for antifungal agents was determined for all isolates by means of the test of broth microdilution standardized by the NCCLS. The results obtained showed resistance to amphotericin B and itraconazole in clinical strains of C. neoformans and C. gattii, C. albidus and C. laurentii exhibited resistance to 5-fluorocytosine, itraconazole and amphotericin B

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.