Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-22T18:40:41Z No. of bitstreams: 1 2018_FernandaFonsêcaFerreira.pdf: 4707883 bytes, checksum: f01efd1dfdc33b16fb2d13434b522cb3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-28T17:10:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_FernandaFonsêcaFerreira.pdf: 4707883 bytes, checksum: f01efd1dfdc33b16fb2d13434b522cb3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-28T17:10:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_FernandaFonsêcaFerreira.pdf: 4707883 bytes, checksum: f01efd1dfdc33b16fb2d13434b522cb3 (MD5) Previous issue date: 2018-08-22 / Fundação Universidade de Brasília (FUB); Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF) e Secretaria de Educação do Distrito Federal (SEDF). / Cryptococcus neoformans é um basidiomiceto caracterizado pela presença de cápsula polissacarídica. Esse fungo é o agente patogênico da criptococose, uma doença oportunista que leva a mais de 180.000 mortes anuais. Até o presente, não foram identificadas, nesse patógeno, proteínas de reparo ao dano de DNA O6-alcilguanina (O6-alcilG), gerado pela alcilação da posição O6 de guaninas. O6-alcilG leva a erro de pareamento de bases nitrogenadas, causando mutação. Análises de bioinformática (FungiDB, UniProt, BLAST e Clustal Omega) da sequência de DNA CNAG_02105 de C. neoformans sugeriram que essa sequência poderia codificar Atl1 (Alkyltransferase-like protein), proteína de reparo a O6-alcilG. Uma vez que o hospedeiro humano não possui Atl1, uma Atl1 de C. neoformans poderia representar um alvo para fármacos de ação seletiva sobre esse fungo. Neste trabalho, buscou-se obter uma linhagem de C. neoformans mutante para o gene putativo ATL1 (CNAG_02105), com o objetivo de caracterizar seus principais atributos de virulência e fenótipos. As linhagens atl1Δ não apresentaram diferenças na termotolerância, expansão da cápsula polissacarídica, melanização da parede celular, produção de urease, desenvolvimento do ciclo sexual e virulência em Galleria mellonella quando comparadas às linhagens controle. Não foram detectadas alterações de fenótipo de crescimento de atl1Δ em condições de estresse osmótico, estresse de parede celular e estresse oxidativo. Também não foi identificada sensibilidade aumentada do mutante ao agente genotóxico hidroxiureia, à exposição à radiação UV, a fluconazol e a diferentes pHs. Por outro lado, as linhagens atl1Δ apresentaram hipersensibilidade ao agente alcilante EMS (etil metanossulfonato), mas não a MMS (metil metanossulfonato) ou ENU (etil nitrosoureia). O EMS gera O6-etilguanina, dano de DNA que é reparado pela proteína Atl1. Coletivamente, a bioinformática e as análises experimentais sugerem que CNAG_02105 codifica uma putativa Atl1 em C. neoformans. / Cryptococcus neoformans is a basidiomycete characterized by the presence of a polysaccharide capsule. This fungus is the pathogenic agent of cryptococcosis, an opportunistic disease that leads to more than 180,000 annual deaths. To date, no repair proteins to the DNA damage of O6-alkylguanine (O6-alkylG), generated by alkylation of the position O6 of guanines. O6-alkylG leads to mismatch of nitrogenous bases, causing mutation. Bioinformatics analyzes (FungiDB, UniProt, BLAST and Clustal Omega) of the C. neoformans DNA sequence CNAG_02105 suggested that this sequence could encode Atl1 (Alkyltransferase-like protein), an O6-alkylG repair protein. Since the human host does not have Atl1, an Atl1 of C. neoformans could represent a target for selective action drugs on this fungus. In this work, we aimed to obtain a C. neoformans mutant srain for the putative ATL1 gene (CNAG_02105), in order to characterize its main virulence attributes and phenotype. The strains atl1Δ did not present differences in thermotolerance, polysaccharide capsule expansion, cell wall melanization, urease production, sexual cycle development and virulence in Galleria mellonella when compared to control strains. No changes in atl1Δ growth phenotype were detected under conditions of osmotic stress, cell wall stress and oxidative stress. No increased sensitivity of the mutant to the genotoxic hydroxyurea agent, exposure to UV radiation, fluconazole and different pHs was also identified. On the other hand, the atl1Δ strains showed hypersensitivity to EMS (ethyl methanesulfonate), but not to MMS (methyl methanesulphonate) or ENU (ethyl nitrosourea). EMS generates O6-ethylguanine, DNA damage that is repaired by the Atl1 protein. Collectively, bioinformatics and experimental analyzes suggest that CNAG_02105 encodes a putative Atl1 in C. neoformans.

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Resumo: A Criptococose é uma micose sistêmica, cuja incidência tem aumentado nas últimas décadas. É causada pelos fungos Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii que se apresentam sob a forma de levedura capsulada. Uma importante característica da infecção com as duas espécies do fungo é que enquanto o C.neoformans está associado à doença em pacientes imunossuprimidos, o C.gattii é capaz de induzir a micose em individuos imunocompetentes. O entendimento dos mecanismos envolvidos nestas diferenças tem sido um desafio para os pesquisadores da área. No que se refere à resposta imune do hospedeiro contra o Cryptococcus, está bem estabelecido que a resistência/suscetibilidade a infecção envolve a participação de diferentes subpopulações de células CD4. No entanto, os estudos sobre o papel das subpopulações TH17 e Treg são escassos. Além disso, são raros os trabalhos que de uma forma sistemática objetivaram comparar o perfil de células CD4 induzido por uma ou outra espécie do fungo. Diferencas nesse perfil poderiam explicar a indução da doença em diferentes populações. Assim, um primeiro objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil de células CD4 efetoras induzido pelo C.neoformans e C.gatti . A abordagem experimental foi a incubação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) in vitro com leveduras vivas de C. neoformans e C.gattii, seguida da avaliação da expressão intracitoplasmática das citocinas IFN-(TH1), IL-4 (TH2), IL-17 (TH17) e o fator de transcrição ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:56:07Z : No. of bitstreams: 1 rossi_sa_me_arafcf.pdf: 449591 bytes, checksum: 0d2c245187a1a252f06fa556d6af5f3a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Nas últimas décadas, evidenciou-se aumento considerável de micoses de caráter invasivo e de difícil tratamento. A criptococose vem representando significativa causa de mortalidade, principalmente em indivíduos HIV positivos. É enfermidade causada por espécies de leveduras encapsuladas, Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, ambas as espécies constituindo-se nos agentes fúngicos mais frequentes a comprometer o sistema nervoso central (SNC). A disponibilidade de antifúngicos para a criptococose no mercado, atualmente é limitado, visto que em alguns casos, muitos deles são ineficientes e tóxicos. Além disso, adiciona-se também a diminuição de cepas sensíveis aos antifúngicos atuais, sendo um importante fator de complicação no tratamento dessas infecções. Neste estudo o gene ERG11 que codifica a proteína Lanosterol 14 C Desmetilase, alvo de fluconazol, de isolados clínicos seriados de C. neoformans recuperados de um paciente e um isolado de psitacídeo de C. gattii, que apresentaram valores de CIM elevadas (Concentração Inibitória Mínima) para o fluconazol, foi analisado. Para atingir este objetivo, os isolados clínicos sequenciais 26, 27 e 30 de um paciente do Rio de Janeiro, C. neoformans ATCC 90012 e o isolado do psitacídeo de C. gattii foram selecionados. O isolado C. gattii e os isolados 26, 27 e 30 de C. neoformans, caracterizados como sensível, intermediário e resistente in vitro a fluconazol, respectivamente, foram selecionados para análise de pontos de mutação na sequência do gene ERG11 através do sequenciamento dos produtos amplificados utilizando primers desenhados a partir da sequência do gene. A sequência do gene ERG11 do isolado 30 (resistente) apresentou um ponto de mutação e duas variações na sequência nucleotídica. A primeira, quando alinhada e comparada com a sequência do isolado 26 (sensível) e do gene de referência... / In the last decades, there was a considerable increase in invasive fungal infections of difficult treatment. Cryptococcosis has represented a significant cause of morbidity and mortality, especially among HIV positive individuals. It is a disease caused by encapsulated yeasts species, Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, both species becoming the most common fungal agents to compromise the central nervous system (CNS). The availability of commercial antifungals is currently restricted and many of them are ineffective and toxic. In addition, there was the emergence of resistant strains to the current antifungals and this is an important complicating factor in treating these infections. In this study, the ERG11 gene that encodes the protein alpha Lanosterol 14-demethylase, target of fluconazole of serial clinical isolates of C. neoformans recovered from a patient and an isolate of C. gattii of a parrot, which showed higher MIC values (Minimum Inhibitory Concentration) for fluconazole was analyzed. To achieve this goal, the sequential clinical isolates 26, 27 and 30 of a patient from Rio de Janeiro, C. neoformans ATCC 90012 and the isolate of C. gattii of the parrot were selected. Isolates 26, 27 and 30 susceptible (S), intermediate (I) and resistant (R) in vitro, respectively, and the isolation of C. gattii were selected for analysis of mutation points in the ERG11 gene sequence by sequencing of amplified products using primers designed from the sequence of the gene. The ERG11 gene sequence of isolate 30 (resistant) showed a mutation point and two variations in the nucleotide sequence. The first, when aligned and compared with the sequence of isolate 26 (susceptible) and the reference gene was significant and the other two changes were silent. When the sequence was translated into Lanosterol 14-alpha demethylase protein, we found that the mutation led to an amino acid exchange... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Ana Marisa Fusco-Almeida / Coorientador: Paulo César Gomes / Banca: Claudia Vianna Maurer Morelli / Banca: Valeria Valente / Resumo: A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica e oportunista, causada pelas leveduras capsuladas das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, afetando tanto pacientes imunocompetentes quanto imunocomprometidos. Uma propriedade importante do gênero Cryptococcus é a capacidade de formação de biofilmes. A resistência dos biofilmes aos agentes antifúngicos traz a necessidade da busca de novas terapias. Desta forma, o nosso grupo vem trabalhando com moléculas antifúngicas derivadas de fontes naturais, como as chalconas, onde foi verificado que C. neoformans é sensível a algumas destas moléculas. Assim, o objetivo desse trabalho foi testar a 3'- chalcona como antifúngico contra C. gattii em situação planctônica e biofilme, como também a eficiência e toxicidade em modelos animais alternativos como Danio rerio (Zebrafish) e Galleria mellonella, propondo uma nova alternativa para o tratamento. In vitro, os resultados para a forma planctônica do fungo mostraram que a 3'- chalcona foi mais eficaz para a cepa 118, com concentração inibitória mínima (CIM) de 0,96 µg/mL e para a cepa 56990 de C. gattii, a molécula mostrou ação potente com CIM entre 1,95 e 3,90 µg/mL. No ensaio de formação do biofilme com as duas cepas, observou-se uma atividade metabólica crescente até 72 horas e uma biomassa e matriz extracelular que alcançou seu máximo nas 48 horas. Em seguida, foi feita a avaliação da atividade da 3'- chalcona contra a formação do biofilme maduro após 48 horas, apresenta... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Criptococose is a fungal, systemic and opportunistic infection mainly caused by capsulated yeast of the species Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, affecting immunocompetent and immunocompromised patients. An important property of the genus Cryptococcus is the biofilm formation, which can be considered a virulence factor and resistance. The resistance of biofilms to antifungal agents brings the need to search new therapies. Thus, our group has been working with antifungal molecules derived from natural sources such as chalcones, where it was found that C. neoformans is sensitive to some of these molecules. For this fact, the objective of this study was to test the 3'- chalcone as antifungal against C. gattii in planktonic and biofilm forms, as well as efficiency and toxicity in alternative animal models like Danio rerio (Zebrafish) and Galleria mellonella, proposing a new alternative for treatment. In vitro, the results for the planktonic form of the fungus showed that the 3'- chalcone was more effective for the 118 strain, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.96 µg/mL. For the strain 56990 of C. gattii the molecule showed potent activity with MIC values between 1.95 and 3.90 µg/mL. Biofilm formation assay for both strains had an increased metabolic activity within 72 hours and a biomass and extracellular matrix which reached its maximum in 48 hours. Then, the evaluation of the activity of the 3'-chalcone against the formation of mature biofilm was made after 48 hours, showing inhibition at a concentration of 62.5 µg/mL for ATCC strain and 31.2 µg/mL against the isolated 118. Also, the growth of biofilm against to amphotericin B (AmB) was evaluated, obtained as a result of inhibition at all concentrations for the two strains and against fluconazole were resistant. In vivo, the results of toxicity in zebrafish embryos revealed... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Benedito Barraviera / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca: Célia Maria de Almeida Soares / Banca: Clarice Queico Fujimura Leite / Resumo: Cryptococcus neoformans é patógeno importante, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A principal porta de entrada deste patógeno é pela via respiratória, disseminando-se posteriormente e atingindo principalmente o sistema nervoso central, provocando a meningite criptocóccica. A primeira parte deste estudo teve como objetivos determinar, nos 106 isolados clínicos de C. neoformans obtidos de dois Estados (São Paulo e Rio de Janeiro), (1) as variedades e (2) os mating-types por PCR (Polymerase Chain Reaction), (3) analisar a diversidade genética por PCR-fingerprinting com a seqüência iniciadora específica para regiões microssatélite (GACA)4, (4) por RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) com o iniciador 6 e (5) por PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) do gene da fosfolipase B (PLB1) digerido com a enzima de restrição AvaI e (6) determinar a sensibilidade a quatro antifúngicos (fluconazol, itraconazol, 5-fluorocitosina e anfotericina B) seguindo o método de referência (documento M27-A2) do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). A segunda parte teve como objetivo, analisar transcritos diferencialmente expressos durante a infecção pulmonar de C. neoformans, pela técnica de RDA (Representational Difference Analysis). Entre os 106 isolados, 104 foram identificados como C. neoformans e apenas dois foram C. gattii (=C. neoformans var. gattii), todos MATa. O tipo molecular VNI (C. neoformans var. grubii, sorotipo A) foi o mais prevalente entre os isolados (97/106), seguido do tipo VNII (C. neoformans var. grubii, sorotipo A) (7/106) e VGII (C. gattii, sorotipos B ou C) (2/106) quando analisados por PCR-fingerprinting e PCR-RFLP. Homogeneidade alta foi obtida com o iniciador (GACA)4, com a maioria dos isolados apresentando correlação em torno de 0,9. Os resultados do RAPD, por sua vez, revelaram maior heterogeneidade com número maior de perfis moleculares. / Abstract: Cryptococcus neoformans is an important pathogen, mainly in immunocompromised patients. The pathogen penetrates mainly by respiratory way, disseminate afterward and reach specially the central nervous system causing the cryptococcal meningitis. The first part of this study had the objective to determine, in the 106 clinical isolates of C. neoformans obtained from São Paulo and Rio de Janeiro State, (1) the varieties and (2) mating-types by PCR (Polymerase Chain Reaction), (3) analyze the genetic diversity by PCR-fingerprinting with specific primer to microsatellite regions (GACA)4, (4) by RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) with primer 6 and (5) by PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) of the phospholipase B gene (PLB1) digested with restriction enzyme AvaI and (6) to determine the susceptibility to four antifungal (fluconazole, itraconazole, 5-flucytosine and amphotericin B) following the reference method (document M27-A2) from CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute). The second part had the goal to analyze differentially expressed transcription during pulmonary infection of C. neoformans, by RDA (Representational Difference Analysis) technique. Among 106 isolates, 104 were identified as C. neoformans and only two were C. gattii (=C. neoformans var. gattii), all MATa. The molecular type VNI (C. neoformans var. grubii, serotype A) was the most prevalent among the isolates (97/106), followed by VNII (C. neoformans var. grubii, serotype A) (7/106) and VGII (C. gattii, serotypes B ou C) (2/106) when analyzed by PCR-fingerprinting and PCR-RFLP. High homogeneity was obtained with the primer (GACA)4, with most of the isolates showing correlation around 0.9. By contrast, the RAPD analysis revealed more heterogeneous with more numbers of molecular profiles. / Doutor

Resumo: A criptococose tem emergido como importante infecção oportunista em pacientes imunossuprimidos e imunocompetentes causando principalmente a neurocriptococose. Cryptococcus neoformans, um dos agentes, é uma levedura capsulada comumente encontrada em infecções do sistema nervoso central em pacientes HIV positivos. No mercado há fármacos para o tratamento dessas infecções, porém problemas são verificados quanto ao espectro de ação, custos e efeitos adversos. As plantas são usadas na medicina por longa data constituindo-se de uma ótima alternativa para busca de substâncias que podem ser utilizadas na formulação de novos antifúngicos. Neste estudo foram avaliados vários extratos, frações e substâncias puras do projeto BIOTA frente à cepa ATCC de C. neoformans, bem como em isolados clínicos com perfil de sensível e resistente frente ao fluconazol. Também foi feita a padronização e aplicação da metodologia do "tabuleiro de xadrez" para verificação de atividade sinérgica, aditiva, indiferente e antagônica entre as frações de plantas de interesse, bem como a molécula pedalitina associada com outras substâncias de origem vegetal e com as drogas sintéticas fluconazol e anfotericina B. Os que apresentaram melhores concentrações inibitórias mínimas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cryptococcosis is a disease that has emerged as an important opportunistic infection in immunocompromised and immunocompetent patients mainly causing cryptococcal meningitis. Cryptococcus neoformans, one of the agents, is encapsulated yeast most commonly found in central nervous system infections in HIV patients. There are drugs on the marketplace for the treatment of these infections, but problems are related to spectrum of action, costs and adverse effects. Plants are used in medicine for a long time and they are a great alternative to look for substances that can be used to develop new antifungal agents. In this study we evaluated several extracts, fractions and pure substances from BIOTA project against the ATCC strain of C. neoformans, as well as clinical isolates with sensible and resistant profile to fluconazole. The standardization and application of the methodology of the chessboard technique was developed to verify synergistic, additive, indifferent and antagonistic activities among the fractions of the selected plants, and the molecule pedalitin associated with other natural compounds and the synthetic drugs fluconazole and amphotericin B. The substances that presented the best minimum inhibitory concentrations were selected to verify the fungi protein profile before and after contact with the plant substance and adhesion profile to cells (pneumocytes) A549. Among the plants studied, Pterogyne nitens, specie that belongs to the family Fabaceae, which has the active substance called pedalitin, presented a significant antifungal activity against the isolates of C. neoformans including resistant. Suspensions of C. neoformans with and without treatment with fluconazole and in contact with pedalitin were analyzed by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis. These treatments revealed changes in the expression... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Coorientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Maristela Pereira / Banca: Maysa Furlan / Mestre

número de casos de infecções fúngicas invasivas tem aumentado nas duas últimas décadas, estando associado com aumento do número de pacientes com AIDS ou submetidos a terapias imunossopressoras. Cryptococcus neoformans e C. gattii estão entre os agentes causadores mais comuns dessas infecções. Os antifúngicos atualmente utilizados apresentam limitações relacionadas à toxidade e surgimento de resistência, tornando importante a busca por novos medicamentos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antifúngica do extrato aquoso bruto de sementes de Allamanda polyantha (APCSE) frente a C. neoformans e C. gattii. Os valores de concentração inibitória mínima (CIM) foram determinados por teste de microdiluição. APCSE apresentou melhor atividade contra C. gattii (CIM 70 e 36 Xg/mL, para as linhagens R265 e R272, respectivamente) em comparação com C. neoformans H99 (CIM 563 Xg/mL). APCSE inibiu formação de cápsula polissacarídica em C. neoformans, fenótipo associado à virulência, e reduziu o tamanho de corpo celular em C. gattii. Aparentemente, APCSE inibiu a divisão celular completa em C. neoformans, causando a formação de cadeias lineares de células que apresentam fragmentação nuclear e não reagem com marcador para oligômeros de quitina. Quatro compostos foram isolados de APCSE por métodos cromatográficos e identificados por ressonância magnética nuclear: plumieridina, plumierídeo, protoplumericina, além de uma mistura dos iridoides plumericina e isoplumericina. Os valores de CIM de plumieridina e plumierídeo para Cryptococcus spp. foram maiores que os de APCSE, indicando que outros compostos podem estar contribuindo para atividade do extrato ou que os compostos possuem maior eficência em associação. Protoplumericina não foi ativa contra Cryptococcus spp. Plumierídeo foi um dos compostos causadores de alteração morfológica em C. neoformans. APCSE e compostos isolados a partir do extrato apresentaram potencial atividade antifúngica e podem prover uma nova ferramenta para estudos da biologia celular de C. neoformans e C. gattii. / The number of cases of invasive fungal infections has increased in the last two decades, and is associated with increased numbers of patients with AIDS or patients undergoing immunosuppressive therapies. Cryptococcus neoformans and C. gattii are among the most common causative agents of such infections. Antifungal drugs currently used have limitations related to toxicity and emergence of resistance, making it important to search for new drugs. The objective of this study was to evaluate the antifungal activity of an aqueous crude seed extract from Allamanda polyantha (APCSE) against Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. The values of minimum inhibitory concentration (MIC) were determined by broth microdilution test. APCSE showed better activity against C. gattii (MIC 70 and 36 Xg/mL, for strain R265 and R272, respectively) compared with C. neoformans H99 (MIC 563 Xg/mL). APCSE inhibited polysaccharide capsule formation in C. neoformans, a virulence associated phenotype, and reduced the cell body size in C. gattii. Apparently, APCSE inhibited cell division in C. neoformans, causing the formation of linear chains of cells that exhibit nuclear fragmentation and do not react with marker for chitin oligomers. Four compounds were isolated from APCSE by chromatographic methods and identified by nuclear magnetic resonance: plumieridine, plumieride, protoplumericin, and a mixture of the iridoids plumericin and isoplumericin. MIC values of plumieridine and plumieride for Cryptococcus spp were higher than those of APCSE, indicating that other compounds may be contributing to the activity of the extract or that these compounds are more efficient in combination. Protoplumericin was not active against Cryptococcus spp. Plumieride was one of the compounds causing morphological change in C. neoformans. APCSE and compounds isolated from this extract showed potential antifungal activity and may provide a new tool for studies of C. neoformans and C. gattii cell biology.

Cryptococcus neoformans é uma levedura oportunista que pode se alojar no sistema nervoso central causando meningite, meningoencefalite e encefalite principalmente em indivíduos com algum comprometimento do sistema imune. É responsável por 4,5% das infecções oportunistas que acometem pacientes portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-positivos). Cryptococcus gattii é um patógeno primário responsável por uma alta incidência de criptococomas no pulmão e no cérebro e que apresenta uma alta morbidez neurológica e uma resposta retardada à terapia antifúngica. O diagnóstico da criptococose é, atualmente, baseado na detecção da levedura em amostras clínicas, no cultivo com posterior identificação bioquímica e na pesquisa de antígenos circulantes. A diferenciação entre as espécies C. neoformans e C. gattii, na maioria dos laboratórios, é realizada utilizando o meio de cultura ágar canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) e demora em torno de sete dias. Neste trabalho foi padronizada uma metodologia de PCR multiplex que pode vir a substituir as provas bioquímicas utilizadas atualmente para a identificação das espécies de Cryptococcus, reduzindo em 6 dias o tempo necessário para a identificação das espécies. A metodologia também se mostrou mais específica na identificação das espécies, concordando com os resultados das sorotipagens em todos os 132 isolados de Cryptococcus testados, enquanto o resultado obtido com o cultivo em ágar CGB foi discordante em 6 dos 132 isolados, sendo 5 falso-positivos e 1 falso negativo. Foi também realizado o primeiro estudo epidemiológico do perfil de pacientes com meningite criptocócica no estado do Rio Grande de Sul notificados no Laboratório Central de Saúde Pública IPB-LACEN/RS no período de 2000 a 2005. A maioria dos pacientes é do sexo masculino (77,12%), branco (83,5%), na faixa etária entre 30 a 39 anos (46,24%) e infectados pelo HIV (95%).

Nos últimos anos tem ocorrido um aumento de infecções fúngicas, devido à elevação do número de pacientes imunossuprimidos, principalmente pelo surgimento da epidemia da AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome). O uso aumentado de antifúngicos tem levado ao surgimento de cepas resistentes a estes agentes, já verificado com o azólico fluconazol, o agente antifúngico mais utilizado na terapia de manutenção de pacientes com AIDS, que desenvolvem criptococose. Neste trabalho, foram determinadas as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) de fluconazol para isolados clínicos de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, utilizando-se o teste de microdiluição em caldo padronizado pelo National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), o método padrão para testar susceptibilidade antifúngica de leveduras. Foram testados 173 isolados clínicos de C. neoformans e C. gattii, sendo que as CIMs para fluconazol variaram de 0,125 a 16 μg/mL, com uma CIM50% de 2 e uma CIM90% de 4 μg/mL. Todos os isolados foram considerados sensíveis a fluconazol. Também foi realizado um teste de indução de resistência a fluconazol, por exposição de um isolado sensível, a concentrações crescentes da droga, para verificar se apenas a exposição, levaria ao desenvolvimento de resistência. No entanto, verificou-se apenas uma resistência transitória, em uma das subpopulações, sendo que o fenótipo de sensibilidade foi restaurado. Os dados obtidos neste trabalho estão em concordância com estudos nacionais e internacionais, que também utilizaram o teste padrão de microdiluição em caldo. A resistência entre isolados clínicos de C. neoformans e C. gattii ainda tem se mostrado rara em termos mundiais comparada a resistência adquirida por outras leveduras. No entanto, devido aos relatos de desenvolvimento de resistência durante a terapia de manutenção da criptococose, é importante alertar quanto à possibilidade do surgimento e da propagação de cepas resistentes. / In the last years have occurred an increase of fungal infections due to rise of number of immunocompromised patients, particularly by appearance of the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). The incresing use of antifungal agents has determined the appearance of resistants strains to this agents, already verified with the fluconazole azole, the antifungal agent more used in the maintenance therapy of AIDS patients that developing criptococosis. In this work were determined the Minimuns Inibitories Concentrations (MICs) of fluconazole to Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii clinical isolates, using the National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) broth microdilution method. This is the test standard to test antifungal susceptibility to yeasts. Were tested 173 clinical isolates of C. neoformans and C. gattii. The MICs to fluconazole ranged of 0.125 to 16 μg/mL and the MIC50% was 2 and MIC90% was 4μg/mL. All isolates were considered susceptibles to fluconazole. A test of fluconazole resistance inducing was carry out by exposure to drug incresing concentrations of one susceptible isolate, to verify if only the exposure can to result in the resistance development. However occurred only a temporary resistance in one of the subpopulations, since the susceptibility profile was restored. The data obtained in this work are in agreement with national and international studies that also used the standard broth microdilution method. The resistance between C. neoformans and C. gattii clinical isolates has been rare in the world when compared with others yeasts. Nonetheless due to references to resistance development during the maintenance therapy of cryptococosis, it’s important to remain alert as for possibility of appearance and spread of resistants strains.

número de casos de infecções fúngicas invasivas tem aumentado nas duas últimas décadas, estando associado com aumento do número de pacientes com AIDS ou submetidos a terapias imunossopressoras. Cryptococcus neoformans e C. gattii estão entre os agentes causadores mais comuns dessas infecções. Os antifúngicos atualmente utilizados apresentam limitações relacionadas à toxidade e surgimento de resistência, tornando importante a busca por novos medicamentos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antifúngica do extrato aquoso bruto de sementes de Allamanda polyantha (APCSE) frente a C. neoformans e C. gattii. Os valores de concentração inibitória mínima (CIM) foram determinados por teste de microdiluição. APCSE apresentou melhor atividade contra C. gattii (CIM 70 e 36 Xg/mL, para as linhagens R265 e R272, respectivamente) em comparação com C. neoformans H99 (CIM 563 Xg/mL). APCSE inibiu formação de cápsula polissacarídica em C. neoformans, fenótipo associado à virulência, e reduziu o tamanho de corpo celular em C. gattii. Aparentemente, APCSE inibiu a divisão celular completa em C. neoformans, causando a formação de cadeias lineares de células que apresentam fragmentação nuclear e não reagem com marcador para oligômeros de quitina. Quatro compostos foram isolados de APCSE por métodos cromatográficos e identificados por ressonância magnética nuclear: plumieridina, plumierídeo, protoplumericina, além de uma mistura dos iridoides plumericina e isoplumericina. Os valores de CIM de plumieridina e plumierídeo para Cryptococcus spp. foram maiores que os de APCSE, indicando que outros compostos podem estar contribuindo para atividade do extrato ou que os compostos possuem maior eficência em associação. Protoplumericina não foi ativa contra Cryptococcus spp. Plumierídeo foi um dos compostos causadores de alteração morfológica em C. neoformans. APCSE e compostos isolados a partir do extrato apresentaram potencial atividade antifúngica e podem prover uma nova ferramenta para estudos da biologia celular de C. neoformans e C. gattii. / The number of cases of invasive fungal infections has increased in the last two decades, and is associated with increased numbers of patients with AIDS or patients undergoing immunosuppressive therapies. Cryptococcus neoformans and C. gattii are among the most common causative agents of such infections. Antifungal drugs currently used have limitations related to toxicity and emergence of resistance, making it important to search for new drugs. The objective of this study was to evaluate the antifungal activity of an aqueous crude seed extract from Allamanda polyantha (APCSE) against Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. The values of minimum inhibitory concentration (MIC) were determined by broth microdilution test. APCSE showed better activity against C. gattii (MIC 70 and 36 Xg/mL, for strain R265 and R272, respectively) compared with C. neoformans H99 (MIC 563 Xg/mL). APCSE inhibited polysaccharide capsule formation in C. neoformans, a virulence associated phenotype, and reduced the cell body size in C. gattii. Apparently, APCSE inhibited cell division in C. neoformans, causing the formation of linear chains of cells that exhibit nuclear fragmentation and do not react with marker for chitin oligomers. Four compounds were isolated from APCSE by chromatographic methods and identified by nuclear magnetic resonance: plumieridine, plumieride, protoplumericin, and a mixture of the iridoids plumericin and isoplumericin. MIC values of plumieridine and plumieride for Cryptococcus spp were higher than those of APCSE, indicating that other compounds may be contributing to the activity of the extract or that these compounds are more efficient in combination. Protoplumericin was not active against Cryptococcus spp. Plumieride was one of the compounds causing morphological change in C. neoformans. APCSE and compounds isolated from this extract showed potential antifungal activity and may provide a new tool for studies of C. neoformans and C. gattii cell biology.