A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunista, causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. As infecções por Cryptococcus neoformans são comuns em nível mundial, e as formas graves são observadas nos pacientes imunocomprometidos. A principal fonte de infecção da criptococose são fezes de pássaros (principalmente pombos) contaminadas com o fungo, sendo a inalação de basidiósporos a principal via de infecção. O estabelecimento e a propagação da infecção são altamente dependentes da imunidade do hospedeiro, sendo o sistema imune celular o mecanismo primário de defesa do organismo contra C. neoformans. Nos últimos anos têm-se descrito outros elementos como ativadores e moduladores da resposta imune, destacando o sistema purinérgico e o sistema colinérgico. Desta maneira, este estudo buscou avaliar a influência da criptococose experimental sobre a atividade do sistema purinérgico e colinérgico, através de três objetivos: (1) avaliar a atividade da ecto-difosfoidrolases (E-NTPDase) e ecto-adenosina deaminase (E-ADA) em linfócitos e soro; (2) atividade da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e linfócitos, e butirilcolinesterase (BChE) no soro; e (3) avaliar os níveis de purinas no soro. Os resultados da avaliação do sistema purinérgico demonstraram que a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP) foram diminuídas, bem como a atividade da E-ADA também esteva diminuída. Em relação a dosagem das colinesterases, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no cérebro, e diminuição da BChE. Na dosagem do nível de purinas no soro, verificou-se um aumento nos níveis de ATP e adenosina (ADO) no dia 20 pós-infecção (PI), aumento de ATP e diminuição da ADO, inosina e ácido úrico no dia 50 PI. A avaliação da atividade da E-NTPDase e E-ADA levou a conclusão de que seus comportamentos hidrolíticos seriam compensatórios enquanto a E-NTPDase teria uma ação pró-inflamatória a E-ADA teria uma ação anti-inflamatória, gerando mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas à infecção por C. neoformans. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. Por fim, observou-se um aumento nos níveis extracelulares de ATP caracterizando uma resposta pró-inflamatória. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da criptococose experimental, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada para combater a proliferação da levedura, e um mecanismo de redução de danos teciduais associados à resposta imune exacerbada. / Cryptococcosis is a systemic fungal infection predominantly opportunistic, caused by encapsulated yeast from Cryptococcus genus. Cryptococcus neoformans infections are common worldwide, and the severe forms are observed in immunocompromised patients. The main source of cryptococcosis infection are bird droppings (especially pigeons) contaminated with the fungus, and the inhalation of basidiospore is the main route of infection. The establishment and spread of infection are highly dependent of the host immunity, and the cellular immune system is the primary mechanism for defense against C. neoformans. In recent years it has been described other elements as activators and modulators of the immune response, highlighting the purinergic and the cholinergic system. Thus, this study aimed to evaluate the influence of experimental cryptococcosis on the activity of purinergic and cholinergic systems through three objectives: (1) to evaluate the activity of the ecto-diphosphohydrolases (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA ) in lymphocytes and serum; (2) the activity of acetylcholinesterase (AchE) in the brain and lymphocytes, and butyrylcholinesterase (BChE) in serum; and (3) evaluate the serum levels of purines. The results of the evaluation in the purinergic system demonstrated that the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) was decreased as well as the E-ADA activity. For the dosage of the cholinesterase, there was an increase in AChE activity in lymphocytes and in the brain, and a decreased in BChE. The measurement of serum purine level demonstrate an increase in the levels of ATP and adenosine) on day 20 post-infection (PI), an increased in ATP and decreased in ADO, inosine and uric acid on day 50 PI. The assessment of the E-NTPDase and E-ADA activity led the conclusion that their hydrolytic behavior would be compensatory while the E-NTPDase would have a pro-inflammatory action, E-ADA would have an anti-inflammatory action, generating protective mechanism against secondary damage tissue, producing possibly exacerbated responses to C. neoformans infection. In addition, data of AChE activity in corresponding samples confirmed the establishment of a pro-inflammatory response, corroborating the hypothesis of the need for a modulation mechanism. Finally, there was an increase in extracellular levels of ATP featuring a pro-inflammatory response. In this way, it was observed a direct involvement of the purinergic and cholinergic systems in immunomodulation of experimental cryptococcosis, contributing to the installation of an immune cell response suitable to combat the proliferation of yeast, and a reduction mechanism of tissue damage associated with response immune exacerbated.

The fungal infections are becoming an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised patients. Here we have studied the activity of new antifungal agents as ravuconazole, albaconazole, micafungin as well as fluconazole tpathogenic yeasts as Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Candida glabrata and Candida krusei. We have also included clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans. The susceptibilities tests indicated that the majority of the strains were sensible to the antifungal agents studied but Candida albicans (6.6%) and C.tropicalis (3.3%) were classified as resistant to fluconazole. These results show the importance of monitoring of the susceptibility in yeast like fungi from clinical source and emphasize that new and constant susceptibility studies deserve be applied to Candida and Cryptococcus neoformans to reduce the mortality among immunocompromised patients. / As infecções fúngicas têm-se tornado uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes, principalmente os imunocomprometidos. Na tentativa de se transpor esta realidade, têm-se buscado estabelecer e avaliar novas drogas antifúngicas eficazes e com melhor tolerabilidade e segurança. O presente estudo foi objetivado a verificar a atividade dos triazólicos fluconazol, ravuconazol e albaconazol e da micafungina, frente a um banco de fungos leveduriformes incluindo as espécies C.albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. lusitaniae, C. glabrata e C. krusei, todas de origem clínica e Cryptococcus neoformans de origens clínica e ambiental. De modo geral, as espécies de Candida spp. e Cryptococcus foram sensíveis aos antifúngicos testados, com exceção da Candida albicans e Candida tropicalis frente ao fluconazol, onde 6,6% e 3,3%, respectivamente dos isolados, foram resistentes a este azólico. Estes resultados demonstram a necessidade de uma constante vigilância da suscetibilidade dos fungos e maiores pesquisas em relação às drogas antifúngicas, pois, desta forma, estaremos contribuindo para a menor morbidade e maior sobrevida dos pacientes.

A Criptococose é uma enfermidade micótica sistêmica, subaguda ou crônica, que acomete a cavidade nasal, tecidos paranasais e pulmões do homem, animais domésticos e silvestres, podendo disseminar-se para o sistema nervoso central, olhos, pele e outros órgãos. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose em pequenos animais, incluindo toxicidade, desenvolvimento de resistência aos antifúngicos tradicionalmente utilizados e longos períodos de tratamento da enfermidade, o estudo objetivou avaliar a eficácia do imunomodulador ß (1-3) glucana isoladamente e em associação ao fluconazol no tratamento da criptococose experimental. Foram utilizados 100 camundongos (Mus musculus), cepa UFPel, albinos, os quais foram divididos em cinco grupos de 20 animais. O tratamento dos animais com criptococose experimental foi iniciado sete dias após a inoculação. O grupo Controle (G1) foi tratado com 0,1 ml de água destilada estéril, o grupo Fluconazol (G2) com 5 mg/kg de fluconazol, o grupo Fluconazol associado a ß (1-3) glucana (G3) com 5 mg/kg de fluconazol associado a 0,5 mg de ß (1-3) glucana, o grupo Glucana dose I (G4) com 0,5 mg de ß (1-3) glucana e o grupo Glucana dose II (G5) recebeu 0,25 mg de ß (1-3) glucana. Após acompanhamento clínico durante as seis semanas de tratamento os animais foram eutanasiados e necropsiados para avaliação anatomopatológica dos órgãos, quantificação das unidades formadoras de colônias fúngicas (UFCs), retroisolamento e avaliação histopatológica. Nas avaliações clínicas o G3 foi sempre superior ao G1 e G2, sendo que na última avaliação clínica individual, os animais pertencentes ao G3 não apresentavam nenhum sintoma clínico. O G2 teve um menor número de órgãos afetados e de alterações macroscópicas, seguido pelo G3, sendo que no primeiro não foram observadas lesões em órgãos-alvo, como pulmão e cérebro. O grupo com maior número de lesões e órgãos afetados foi o G1. Nos parâmetros retroisolamento e UFCs, o G3 foi superior aos outros tratamentos, seguido pelo G2, sendo que o pior grupo, ou seja, aquele que teve um maior número de isolamentos e maior quantificação de UFCs foi o G1. Conforme os resultados obtidos os tratamentos G2 e G3 foram os mais eficazes para a remissão da criptococose experimental, no entanto, G3 apresentou uma superioridade na maioria dos parâmetros avaliados. Portanto, de acordo com os resultados obtidos, a associação de fluconazol ao imunomodulador ß (1-3) glucana pode ser uma alternativa benéfica em considerável quantidade de pacientes com criptococose. / Cryptococcosis is a systematic sub acute or chronic mycotic condition that affects the nasal cavity, paranasal tissues and the lungs of humans, as well as domestic and wild animals, which can spread to the central nervous system, skin, and other organs. Considering the therapeutic difficulties in treating this mycosis in small animals, which include toxicity, resistance towards traditionally used antifungals, and the extended treatment of this condition, this study aimed to evaluate the ß (1-3) glucan immunomodulator efficacy when used both alone and in association with fluconazole in the treatment of experimental cryptococcosis. One Hundred albino UFPel strain mice (Mus musculus), divided into five groups of 20 animals each, were used. The treatment of these animals with experimental cryptococcosis was started seven days following inoculation. The control group (G1) was treated with 0,1 ml sterile distilled water. The fluconazole group (G2) was treated with 5 mg/kg fluconazole; the fluconazole associated with ß glucan (1-3) group (G3) was treated with 5 mg/kg fluconazole associated with 0,5 mg ß (1-3) glucan ; the group glucan dose I (G4) was treated with 0,5 mg ß (1-3) glucan, and the group glucan dose II (G5) was administered 0,25 mg ß (1-3) glucan. After the six-week treatment clinical follow-up, the aimals were euthanized and necropsied for anatomopathological evaluation of organs, quantification of fungal colony-forming units (FCUs), retro isolation and histopathological evaluation. In clinical evaluations, G3 was always superior to G1 and G2, and in the last individual clinical evaluation, G3 animals did not show any clinical symptoms. G2 had a smaller number of affected organs and microscopic alterations, followed by G3. In G2, target organ lesions, such as those in the lungs and brain, were not found. Considering retro isolation and FCU parameters, G3 was superior to other treatments, followed by G2; the worst group, that is, the one with the highest isolation occurrence and greatest FCU quantification, was G1. According to the results obtained, treatments G2 and G3 were the most efficient in experimental cryptococcosis remission; however, G3 was superior in most parameters evaluated. Therefore, according to the results obtained, the association of fluconazole with the ß (1-3) glucan immunomodulator can be a beneficial alternative to a considerable number of cryptococcosis-bearing patients.

A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunista, causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. As infecções por Cryptococcus neoformans são comuns em nível mundial, e as formas graves são observadas nos pacientes imunocomprometidos. A principal fonte de infecção da criptococose são fezes de pássaros (principalmente pombos) contaminadas com o fungo, sendo a inalação de basidiósporos a principal via de infecção. O estabelecimento e a propagação da infecção são altamente dependentes da imunidade do hospedeiro, sendo o sistema imune celular o mecanismo primário de defesa do organismo contra C. neoformans. Nos últimos anos têm-se descrito outros elementos como ativadores e moduladores da resposta imune, destacando o sistema purinérgico e o sistema colinérgico. Desta maneira, este estudo buscou avaliar a influência da criptococose experimental sobre a atividade do sistema purinérgico e colinérgico, através de três objetivos: (1) avaliar a atividade da ecto-difosfoidrolases (E-NTPDase) e ecto-adenosina deaminase (E-ADA) em linfócitos e soro; (2) atividade da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e linfócitos, e butirilcolinesterase (BChE) no soro; e (3) avaliar os níveis de purinas no soro. Os resultados da avaliação do sistema purinérgico demonstraram que a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP) foram diminuídas, bem como a atividade da E-ADA também esteva diminuída. Em relação a dosagem das colinesterases, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no cérebro, e diminuição da BChE. Na dosagem do nível de purinas no soro, verificou-se um aumento nos níveis de ATP e adenosina (ADO) no dia 20 pós-infecção (PI), aumento de ATP e diminuição da ADO, inosina e ácido úrico no dia 50 PI. A avaliação da atividade da E-NTPDase e E-ADA levou a conclusão de que seus comportamentos hidrolíticos seriam compensatórios enquanto a E-NTPDase teria uma ação pró-inflamatória a E-ADA teria uma ação anti-inflamatória, gerando mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas à infecção por C. neoformans. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. Por fim, observou-se um aumento nos níveis extracelulares de ATP caracterizando uma resposta pró-inflamatória. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da criptococose experimental, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada para combater a proliferação da levedura, e um mecanismo de redução de danos teciduais associados à resposta imune exacerbada. / Cryptococcosis is a systemic fungal infection predominantly opportunistic, caused by encapsulated yeast from Cryptococcus genus. Cryptococcus neoformans infections are common worldwide, and the severe forms are observed in immunocompromised patients. The main source of cryptococcosis infection are bird droppings (especially pigeons) contaminated with the fungus, and the inhalation of basidiospore is the main route of infection. The establishment and spread of infection are highly dependent of the host immunity, and the cellular immune system is the primary mechanism for defense against C. neoformans. In recent years it has been described other elements as activators and modulators of the immune response, highlighting the purinergic and the cholinergic system. Thus, this study aimed to evaluate the influence of experimental cryptococcosis on the activity of purinergic and cholinergic systems through three objectives: (1) to evaluate the activity of the ecto-diphosphohydrolases (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA ) in lymphocytes and serum; (2) the activity of acetylcholinesterase (AchE) in the brain and lymphocytes, and butyrylcholinesterase (BChE) in serum; and (3) evaluate the serum levels of purines. The results of the evaluation in the purinergic system demonstrated that the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) was decreased as well as the E-ADA activity. For the dosage of the cholinesterase, there was an increase in AChE activity in lymphocytes and in the brain, and a decreased in BChE. The measurement of serum purine level demonstrate an increase in the levels of ATP and adenosine) on day 20 post-infection (PI), an increased in ATP and decreased in ADO, inosine and uric acid on day 50 PI. The assessment of the E-NTPDase and E-ADA activity led the conclusion that their hydrolytic behavior would be compensatory while the E-NTPDase would have a pro-inflammatory action, E-ADA would have an anti-inflammatory action, generating protective mechanism against secondary damage tissue, producing possibly exacerbated responses to C. neoformans infection. In addition, data of AChE activity in corresponding samples confirmed the establishment of a pro-inflammatory response, corroborating the hypothesis of the need for a modulation mechanism. Finally, there was an increase in extracellular levels of ATP featuring a pro-inflammatory response. In this way, it was observed a direct involvement of the purinergic and cholinergic systems in immunomodulation of experimental cryptococcosis, contributing to the installation of an immune cell response suitable to combat the proliferation of yeast, and a reduction mechanism of tissue damage associated with response immune exacerbated.

A Criptococose é uma enfermidade micótica sistêmica, subaguda ou crônica, que acomete a cavidade nasal, tecidos paranasais e pulmões do homem, animais domésticos e silvestres, podendo disseminar-se para o sistema nervoso central, olhos, pele e outros órgãos. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose em pequenos animais, incluindo toxicidade, desenvolvimento de resistência aos antifúngicos tradicionalmente utilizados e longos períodos de tratamento da enfermidade, o estudo objetivou avaliar a eficácia do imunomodulador ß (1-3) glucana isoladamente e em associação ao fluconazol no tratamento da criptococose experimental. Foram utilizados 100 camundongos (Mus musculus), cepa UFPel, albinos, os quais foram divididos em cinco grupos de 20 animais. O tratamento dos animais com criptococose experimental foi iniciado sete dias após a inoculação. O grupo Controle (G1) foi tratado com 0,1 ml de água destilada estéril, o grupo Fluconazol (G2) com 5 mg/kg de fluconazol, o grupo Fluconazol associado a ß (1-3) glucana (G3) com 5 mg/kg de fluconazol associado a 0,5 mg de ß (1-3) glucana, o grupo Glucana dose I (G4) com 0,5 mg de ß (1-3) glucana e o grupo Glucana dose II (G5) recebeu 0,25 mg de ß (1-3) glucana. Após acompanhamento clínico durante as seis semanas de tratamento os animais foram eutanasiados e necropsiados para avaliação anatomopatológica dos órgãos, quantificação das unidades formadoras de colônias fúngicas (UFCs), retroisolamento e avaliação histopatológica. Nas avaliações clínicas o G3 foi sempre superior ao G1 e G2, sendo que na última avaliação clínica individual, os animais pertencentes ao G3 não apresentavam nenhum sintoma clínico. O G2 teve um menor número de órgãos afetados e de alterações macroscópicas, seguido pelo G3, sendo que no primeiro não foram observadas lesões em órgãos-alvo, como pulmão e cérebro. O grupo com maior número de lesões e órgãos afetados foi o G1. Nos parâmetros retroisolamento e UFCs, o G3 foi superior aos outros tratamentos, seguido pelo G2, sendo que o pior grupo, ou seja, aquele que teve um maior número de isolamentos e maior quantificação de UFCs foi o G1. Conforme os resultados obtidos os tratamentos G2 e G3 foram os mais eficazes para a remissão da criptococose experimental, no entanto, G3 apresentou uma superioridade na maioria dos parâmetros avaliados. Portanto, de acordo com os resultados obtidos, a associação de fluconazol ao imunomodulador ß (1-3) glucana pode ser uma alternativa benéfica em considerável quantidade de pacientes com criptococose. / Cryptococcosis is a systematic sub acute or chronic mycotic condition that affects the nasal cavity, paranasal tissues and the lungs of humans, as well as domestic and wild animals, which can spread to the central nervous system, skin, and other organs. Considering the therapeutic difficulties in treating this mycosis in small animals, which include toxicity, resistance towards traditionally used antifungals, and the extended treatment of this condition, this study aimed to evaluate the ß (1-3) glucan immunomodulator efficacy when used both alone and in association with fluconazole in the treatment of experimental cryptococcosis. One Hundred albino UFPel strain mice (Mus musculus), divided into five groups of 20 animals each, were used. The treatment of these animals with experimental cryptococcosis was started seven days following inoculation. The control group (G1) was treated with 0,1 ml sterile distilled water. The fluconazole group (G2) was treated with 5 mg/kg fluconazole; the fluconazole associated with ß glucan (1-3) group (G3) was treated with 5 mg/kg fluconazole associated with 0,5 mg ß (1-3) glucan ; the group glucan dose I (G4) was treated with 0,5 mg ß (1-3) glucan, and the group glucan dose II (G5) was administered 0,25 mg ß (1-3) glucan. After the six-week treatment clinical follow-up, the aimals were euthanized and necropsied for anatomopathological evaluation of organs, quantification of fungal colony-forming units (FCUs), retro isolation and histopathological evaluation. In clinical evaluations, G3 was always superior to G1 and G2, and in the last individual clinical evaluation, G3 animals did not show any clinical symptoms. G2 had a smaller number of affected organs and microscopic alterations, followed by G3. In G2, target organ lesions, such as those in the lungs and brain, were not found. Considering retro isolation and FCU parameters, G3 was superior to other treatments, followed by G2; the worst group, that is, the one with the highest isolation occurrence and greatest FCU quantification, was G1. According to the results obtained, treatments G2 and G3 were the most efficient in experimental cryptococcosis remission; however, G3 was superior in most parameters evaluated. Therefore, according to the results obtained, the association of fluconazole with the ß (1-3) glucan immunomodulator can be a beneficial alternative to a considerable number of cryptococcosis-bearing patients.

A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunista, causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. As infecções por Cryptococcus neoformans são comuns em nível mundial, e as formas graves são observadas nos pacientes imunocomprometidos. A principal fonte de infecção da criptococose são fezes de pássaros (principalmente pombos) contaminadas com o fungo, sendo a inalação de basidiósporos a principal via de infecção. O estabelecimento e a propagação da infecção são altamente dependentes da imunidade do hospedeiro, sendo o sistema imune celular o mecanismo primário de defesa do organismo contra C. neoformans. Nos últimos anos têm-se descrito outros elementos como ativadores e moduladores da resposta imune, destacando o sistema purinérgico e o sistema colinérgico. Desta maneira, este estudo buscou avaliar a influência da criptococose experimental sobre a atividade do sistema purinérgico e colinérgico, através de três objetivos: (1) avaliar a atividade da ecto-difosfoidrolases (E-NTPDase) e ecto-adenosina deaminase (E-ADA) em linfócitos e soro; (2) atividade da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e linfócitos, e butirilcolinesterase (BChE) no soro; e (3) avaliar os níveis de purinas no soro. Os resultados da avaliação do sistema purinérgico demonstraram que a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP) foram diminuídas, bem como a atividade da E-ADA também esteva diminuída. Em relação a dosagem das colinesterases, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no cérebro, e diminuição da BChE. Na dosagem do nível de purinas no soro, verificou-se um aumento nos níveis de ATP e adenosina (ADO) no dia 20 pós-infecção (PI), aumento de ATP e diminuição da ADO, inosina e ácido úrico no dia 50 PI. A avaliação da atividade da E-NTPDase e E-ADA levou a conclusão de que seus comportamentos hidrolíticos seriam compensatórios enquanto a E-NTPDase teria uma ação pró-inflamatória a E-ADA teria uma ação anti-inflamatória, gerando mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas à infecção por C. neoformans. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. Por fim, observou-se um aumento nos níveis extracelulares de ATP caracterizando uma resposta pró-inflamatória. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da criptococose experimental, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada para combater a proliferação da levedura, e um mecanismo de redução de danos teciduais associados à resposta imune exacerbada. / Cryptococcosis is a systemic fungal infection predominantly opportunistic, caused by encapsulated yeast from Cryptococcus genus. Cryptococcus neoformans infections are common worldwide, and the severe forms are observed in immunocompromised patients. The main source of cryptococcosis infection are bird droppings (especially pigeons) contaminated with the fungus, and the inhalation of basidiospore is the main route of infection. The establishment and spread of infection are highly dependent of the host immunity, and the cellular immune system is the primary mechanism for defense against C. neoformans. In recent years it has been described other elements as activators and modulators of the immune response, highlighting the purinergic and the cholinergic system. Thus, this study aimed to evaluate the influence of experimental cryptococcosis on the activity of purinergic and cholinergic systems through three objectives: (1) to evaluate the activity of the ecto-diphosphohydrolases (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA ) in lymphocytes and serum; (2) the activity of acetylcholinesterase (AchE) in the brain and lymphocytes, and butyrylcholinesterase (BChE) in serum; and (3) evaluate the serum levels of purines. The results of the evaluation in the purinergic system demonstrated that the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) was decreased as well as the E-ADA activity. For the dosage of the cholinesterase, there was an increase in AChE activity in lymphocytes and in the brain, and a decreased in BChE. The measurement of serum purine level demonstrate an increase in the levels of ATP and adenosine) on day 20 post-infection (PI), an increased in ATP and decreased in ADO, inosine and uric acid on day 50 PI. The assessment of the E-NTPDase and E-ADA activity led the conclusion that their hydrolytic behavior would be compensatory while the E-NTPDase would have a pro-inflammatory action, E-ADA would have an anti-inflammatory action, generating protective mechanism against secondary damage tissue, producing possibly exacerbated responses to C. neoformans infection. In addition, data of AChE activity in corresponding samples confirmed the establishment of a pro-inflammatory response, corroborating the hypothesis of the need for a modulation mechanism. Finally, there was an increase in extracellular levels of ATP featuring a pro-inflammatory response. In this way, it was observed a direct involvement of the purinergic and cholinergic systems in immunomodulation of experimental cryptococcosis, contributing to the installation of an immune cell response suitable to combat the proliferation of yeast, and a reduction mechanism of tissue damage associated with response immune exacerbated.

A Criptococose é uma enfermidade micótica sistêmica, subaguda ou crônica, que acomete a cavidade nasal, tecidos paranasais e pulmões do homem, animais domésticos e silvestres, podendo disseminar-se para o sistema nervoso central, olhos, pele e outros órgãos. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose em pequenos animais, incluindo toxicidade, desenvolvimento de resistência aos antifúngicos tradicionalmente utilizados e longos períodos de tratamento da enfermidade, o estudo objetivou avaliar a eficácia do imunomodulador ß (1-3) glucana isoladamente e em associação ao fluconazol no tratamento da criptococose experimental. Foram utilizados 100 camundongos (Mus musculus), cepa UFPel, albinos, os quais foram divididos em cinco grupos de 20 animais. O tratamento dos animais com criptococose experimental foi iniciado sete dias após a inoculação. O grupo Controle (G1) foi tratado com 0,1 ml de água destilada estéril, o grupo Fluconazol (G2) com 5 mg/kg de fluconazol, o grupo Fluconazol associado a ß (1-3) glucana (G3) com 5 mg/kg de fluconazol associado a 0,5 mg de ß (1-3) glucana, o grupo Glucana dose I (G4) com 0,5 mg de ß (1-3) glucana e o grupo Glucana dose II (G5) recebeu 0,25 mg de ß (1-3) glucana. Após acompanhamento clínico durante as seis semanas de tratamento os animais foram eutanasiados e necropsiados para avaliação anatomopatológica dos órgãos, quantificação das unidades formadoras de colônias fúngicas (UFCs), retroisolamento e avaliação histopatológica. Nas avaliações clínicas o G3 foi sempre superior ao G1 e G2, sendo que na última avaliação clínica individual, os animais pertencentes ao G3 não apresentavam nenhum sintoma clínico. O G2 teve um menor número de órgãos afetados e de alterações macroscópicas, seguido pelo G3, sendo que no primeiro não foram observadas lesões em órgãos-alvo, como pulmão e cérebro. O grupo com maior número de lesões e órgãos afetados foi o G1. Nos parâmetros retroisolamento e UFCs, o G3 foi superior aos outros tratamentos, seguido pelo G2, sendo que o pior grupo, ou seja, aquele que teve um maior número de isolamentos e maior quantificação de UFCs foi o G1. Conforme os resultados obtidos os tratamentos G2 e G3 foram os mais eficazes para a remissão da criptococose experimental, no entanto, G3 apresentou uma superioridade na maioria dos parâmetros avaliados. Portanto, de acordo com os resultados obtidos, a associação de fluconazol ao imunomodulador ß (1-3) glucana pode ser uma alternativa benéfica em considerável quantidade de pacientes com criptococose. / Cryptococcosis is a systematic sub acute or chronic mycotic condition that affects the nasal cavity, paranasal tissues and the lungs of humans, as well as domestic and wild animals, which can spread to the central nervous system, skin, and other organs. Considering the therapeutic difficulties in treating this mycosis in small animals, which include toxicity, resistance towards traditionally used antifungals, and the extended treatment of this condition, this study aimed to evaluate the ß (1-3) glucan immunomodulator efficacy when used both alone and in association with fluconazole in the treatment of experimental cryptococcosis. One Hundred albino UFPel strain mice (Mus musculus), divided into five groups of 20 animals each, were used. The treatment of these animals with experimental cryptococcosis was started seven days following inoculation. The control group (G1) was treated with 0,1 ml sterile distilled water. The fluconazole group (G2) was treated with 5 mg/kg fluconazole; the fluconazole associated with ß glucan (1-3) group (G3) was treated with 5 mg/kg fluconazole associated with 0,5 mg ß (1-3) glucan ; the group glucan dose I (G4) was treated with 0,5 mg ß (1-3) glucan, and the group glucan dose II (G5) was administered 0,25 mg ß (1-3) glucan. After the six-week treatment clinical follow-up, the aimals were euthanized and necropsied for anatomopathological evaluation of organs, quantification of fungal colony-forming units (FCUs), retro isolation and histopathological evaluation. In clinical evaluations, G3 was always superior to G1 and G2, and in the last individual clinical evaluation, G3 animals did not show any clinical symptoms. G2 had a smaller number of affected organs and microscopic alterations, followed by G3. In G2, target organ lesions, such as those in the lungs and brain, were not found. Considering retro isolation and FCU parameters, G3 was superior to other treatments, followed by G2; the worst group, that is, the one with the highest isolation occurrence and greatest FCU quantification, was G1. According to the results obtained, treatments G2 and G3 were the most efficient in experimental cryptococcosis remission; however, G3 was superior in most parameters evaluated. Therefore, according to the results obtained, the association of fluconazole with the ß (1-3) glucan immunomodulator can be a beneficial alternative to a considerable number of cryptococcosis-bearing patients.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-11T19:43:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T09:34:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T09:34:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-03-08 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Secondary metabolites that have been discovered from the plant kingdom are major sources of innovative therapeutic agents for infectious diseases. Plants have been demonstrated to present important biological activities and are considered as potential clinical application when show compatibility with the human organism. Hymenaea courbaril Linnaeus var. stilbocarpa a tree known as jatoba, presents chemicals products obtained from their leaves, stem, fruit and seeds that are used in folk medicine. Antimicrobial and cytotoxic activity of this plant is little known. An initial screening was performed to evaluate the in vitro susceptibility to sap and compounds of H. courbaril against dermatophytes and Cryptococcus isolates. The sap and the compound fisetin were more active and thus they were used to determine the in vitro susceptibility against eighteen dermatophytes and twenty-six Cryptococcus isolates. The results of in vitro susceptibility assay showed antifungal activity of H. courbaril against all fungi studied. The sap of H. courbaril showed minimal inhibitory concentrations (MIC) ranging between 32-128 μg/mL for dermatophytes and 8-256 μg/mL for complex C. neoformans yeast. The compound of H. courbaril fisetin inhibited the growth of dermatophytes and of Cryptococcus in concentration of 4-128 μg/ml, and of 8 a 128 μg/ml, respectively. In vitro cytotoxicity assays of sap and compound were performed with fibroblast 3T3-A31 by using the technique of absorption of the dye neutral red. Cytotoxicity assays showed that sap and compound have an low toxicity on these cells. The sap and the compound showed IC50 values of 109 μg/mL of 158μg/mL, respectively. The results of this study are relevant and promising because they show that the “fisetin” present a good biological activity for fungi, and is a compound biocompatible with basal cells of mammals. Products with such concentrations of MIC and IC50 can be considered of great value for further pharmacological studies. / As plantas e seus metabólitos secundários são uma grande fonte de inovação de agentes terapêuticos para inúmeras enfermidades, incluindo doenças infecciosas. Plantas de uso popular apresentam atividade biológica em potencial, sendo que devem ser consideradas a importância da aplicação clínica e a compatibilidade com o organismo humano. Hymenaea courbaril Linnaeus var. stilbocarpa uma árvore conhecida como jatobá, possui produtos químicos obtidos de suas folhas, tronco, frutos e sementes que são usadas na medicina popular, no entanto atividade antifúngica e a citotoxicidade desta planta ainda é pouco conhecida. Uma triagem inicial foi realizada para avaliação da suscetibilidade in vitro com a seiva e compostos de H. courbaril sobre isolados de dermatófitos e Cryptococcus. A seiva e o composto fisetina apresentaram-se mais ativos e desta forma foram usados para determinar a suscetibilidade de dezoito isolados de dermatófitos e vinte e seis de Cryptococcus. A seiva de H. courbaril apresentou concentrações inibitórias mínima (CIMs) que variaram de 32 a 128 μg/mL para os dermatófitos e de 8 a 256 μg/mL para as leveduras do complexo C. neoformans. O composto fisetina foi capaz de inibir os dermatófitos em CIMs que variaram de 4 a 128μg/mL e as leveduras do complexo C. neoformans em CIMs que variaram de 8 a 128 μg/mL. A avaliação da citotoxicidade in vitro com fibroblastos 3T3-A31 foi realizada para a seiva e o composto fisetina usando a técnica de absorção do corante vermelho neutro. Por este método foi possível verificar que a seiva de H. courbaril apresentou um IC50 de 109 μg/mL e o composto de 158μg/mL Os resultados encontrados neste estudo são relevantes e promissores, pois mostram que esta planta apresenta uma boa atividade biológica para fungos, além de possuir um composto isolado biocompatível com celulas basais de mamíferos. Produtos com tais concentrações de CIM e IC50 podem ser considerados de grande valor para posteriores estudos farmacológicos.

Objetivando estudar o perfil fenotípico de leveduras mantidas em banco de microrganismos de Cryptococcus neoformans, 40 cepas de origem clínica e 44 de origem ambiental foram escolhidas aleatoriamente. As cepas passaram por tipagem bioquímica para diferenciação em C. neoformans e C. gattii, e dentre as cepas clínicas 90% foram tipadas como C. neoformans e 10% como C. gattii, já dentre as cepas ambientais 95,5% foram C. neoformans e 4,5% C. gattii. As cepas cepas que foram positivas no teste bioquímico para C. gattii passaram por tipagem molecular (PCR-RFLP) e verificou-se que apenas quatro cepas eram realmente C. gattii (VGII), e duas outras C. neoformans (VNI e VNIII). Quando estudado os fatores relacionados a virulência, todas as cepas tanto clínicas quanto ambientais foram produtoras de fosfolipase, sendo que cepas de origem clínica produziram essa enzima em maior quantidade. Todas as cepas tanto clínicas quanto ambientais foram produtoras da enzima protease e todas também apresentaram intensidade de cor da colônia ( melanização). Quando avaliado a espessura capsular in vitro todas apresentaram cápsula, das cepas clínicas, 67% apresentaram cápsula média e das ambientais 70%. Quando avaliado a sensibilidade aos antifúngicos pelo métodos E-test todas as cepas clínicas e ambientais foram sensíveis aos antifúngicos anfotericina B, cetoconazol, fluconazol, voriconazol e posoconazol. O itraconazol também foi testado e apresentou cepas sensíveis à droga, porém uma cepa clínica e duas ambientais tiveram classificação dose dependente. Destacamos que a fosfolipase poderia ser usada como um marcador fenotípico para o complexo Cryptococcus neoformans e uma correta identificação das culturas mantidas em banco de microrganismos é necessário. / Aiming to study the phenotypic profile of yeasts maintened in stock culture identified as Cryptococcus neoformans, 40 clinical and 44 environmental strains, were chosen ran domly. The strains had undergone biochemical typing for differentiation as C. neoformans and C. gattii. Among the clinical strains 90% were typed as C. neoformans and 10% as C. gattii, already among the environmental strains were 95,5% C. neoformans and 4,5% C. gattii. The strains thah were positive in biochemical test for C. gattii underwent molecular typing (PCR-RFLP) and found that only four strain were actually C. gattii (VGII) and two other C. neoformans (VNI and VNII). When the factors related to virulence were studied, both the clinical and environmental strains were phospholipase positive but the clinical strains produced a greater amount of this enzyme. All strains were both clinical and environmental production of protease and also showed an intensity colony color (melanization). When the thickness of the capsule was evaluated, all of it showed a capsule, from the clinical strains 67% had an average capsule and from environmental strains 70% had an average capsule. When assessed by sensitivity to antifungal by E-test method all clinical and environmental strains were sensitive to the anphotericine B, ketoconazole, fluconazole, voriconazole and posoconazole. Itraconazole was tested and the samples showed drug sensitive-strains. We point out that phospholipase production would be used as marked to C. neoformans complex and a correct identification of strains maintened in stock culture is necessary.

Criptococose é uma doença causada pelo fungo C. neoformans que têm grande importância atualmente, devido ao aumento da população imunocomprometida,. Além disso, existem poucas opções terapêuticas contra micoses profundas. Neste trabalho foi avaliado se a via de biossíntese do triptofano seria um bom alvo para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Com o uso da tecnologia de RNA de interferência, concluiu-se que esta via de síntese é essencial para a sobrevivência desta levedura, sendo, portanto, um ótimo alvo. Ainda neste estudo, demonstrou-se que a letalidade decorre da baixa captação de triptofano pelas permeases de aminoácidos, as quais sofrem repressão catabólica pela fonte de nitrogênio e efeito negativo da temperatura. Foram testados dois inibidores específicos que atuam sobre a antranilato sintase e a triptofano sintase, duas enzimas cruciais para a conversão do corismato em triptofano. Ambos compostos causaram inibição do crescimento de C. neoformans e C. gattii. / Cryptococcosis is a disease caused by C. neoformans, currently of great importance due to the increase in immunocompromised population. Furthermore, there are few therapeutic options for treating this disease. This study evaluated the tryptophan biosynthetic pathway as a possible target for the antifungal development. By using RNA interference technology we concluded that this metabolic pathway is essential for the survival of this yeast, and, therefore, it is a good target. In the same study, it was demonstrated that lethality results from the low uptake of the tryptophan amino acid by permeases, which undergo nitrogen catabolite repression and negative effect of temperature. Two specific inhibitors acting on the anthranilate synthase and tryptophan synthase, two key enzymes for the conversion of chorismate into tryptophan were tested. Both compounds caused growth inhibition of C. neoformans and C. gattii.