Interações patógeno-hospedeiro geram alterações em diversos mecanismos, tanto no hospedeiro quanto no patógeno. Neste contexto, nas células do sistema imune do hospedeiro ocorre modulação para impedir o desenvolvimento de patógenos, culminado em sua eliminação, como no caso de infecções por Cryptococcus neoformans. Macrófagos alveolares constituem o primeiro tipo celular a responder à levedura, a qual, após a fagocitose, é capaz de se proliferar e disseminar no hospedeiro. Como mecanismo de defesa, células hospedeiras podem reduzir a concentração de micronutrientes essenciais para o patógeno, mecanismo conhecido por imunidade nutricional. Zinco (Zn) é o segundo metal de transição mais abundante e um micronutriente essencial para todos os organismos e, com isto, macrófagos podem responder a patógenos com redução dos níveis de Zn para auxiliar na eliminação de patógenos. A fim de avaliar se macrófagos respondem com privação de Zn a a fungos, a alteração na homeostase de Zn em macrófagos infectados por C. neoformans foi avaliada bem como a influência da ativação celular nesta resposta. Demonstramos que macrófagos respondem com privação de Zn à infecção por C. neoformans uma vez que ocorreu (i) diminuição nos níveis intracelulares de Zn livre em macrófagos infectados com a levedura viável, (ii) redução na expressão de importadores do metal, (iii) redução nos níveis de Zn livre em leveduras após exposição a macrófagos, (iv) aumento na proliferação no interior de macrófagos e diminuição da taxa de exocitose de C. neoformans em condições de disponibilidade de Zn. Tal modulação de Zn na resposta a C. neoformans foi exercida por alguns transportadores de Zn que respondem significativamente a condições de privação de Zn, principalmente os da família ZnT, e a privação de Zn como mecanismo de imunidade nutricional foi evidente em macrófagos ativados com IFN- e LPS. Macrófagos ativados com PMA não mostraram redução nos níveis intracelulares de Zn em reposta a C. neoformans ou modulação significativa nos níveis de transcritos de transportadores de Zn, como ZIP2 e ZnT7, em comparação a macrófagos ativados com IFN- e LPS. Além disso, de forma geral, macrófagos ativados continham maiores níveis intracelulares de Zn livre em comparação a macrófagos não ativados, sugerindo modulação do processo de ativação na homeostase de Zn em macrófagos J774.A1. / Host-pathogen interactions cause alterations on several mechanisms in both host and pathogen. In this context, host immune system cells are modulated to prevent pathogens growth, aiding in their elimination, as it occurs during Cryptococcus neoformans infections. Alveolar macrophages are the first cell type to respond to yeast infection. Once phagocytosed, cryptococcal cells are capable to proliferate and disseminate in the host. As a defense mechanism, host cells can reduce essential micronutrients concentration to the pathogen, a mechanism known as nutritional immunity. Zinc (Zn) is the second most abundant transition metal and an essential micronutrient for all organisms and thus, macrophages may respond to pathogens with reduced levels of Zn to aid pathogens elimination. In order to evaluate whether macrophages respond with Zn deprivation to fungi, alterations on Zn homeostasis in C. neoformans-infected macrophages was evaluated as well as the influence of cellular activation in this response. We demonstrate that macrophages respond with Zn deprivation to C. neoformans infection, as we could observe (i) a reduction of free intracellular Zn levels in macrophages infected with viable yeast, (ii) a reduced expression of Zn importers, (iii) a decreased free Zn concentration in yeasts exposed to macrophages, (iv) increased yeast proliferation within macrophages and decreased yeast exocytosis under Zn rich conditions. This Zn modulation in response to C. neoformans was exerted by some Zn transporters which respond significantly to Zn deprivation conditions, especially those of the ZnT family, and Zn deprivation as a nutritional immunity mechanism was evident in IFN- and LPS-activated macrophages. PMA-activated macrophages showed no reduction in intracellular Zn levels in response to C. neoformans or a significant modulation in Zn transporters transcript levels, such as ZIP2 and ZnT7, in comparision to IFN-- LPS-activated macrophages. In addition, in general, activated macrophages contained increased free intracellular Zn levels in comparision to non-activated macrophages, suggesting activation process modulation on Zn homeostasis in J774.A1 macrophages.

A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-09-13T15:57:01Z No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2013-10-03T11:53:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T11:53:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / O advento de pacientes portadores do HIV e de pacientes imunocomprometidos provocou um aumento na incidência de micoses fúngicas, como a criptococcose. Existem várias classes de antifúngicos disponíveis comercialmente para o tratamento dessas infecções que são utilizadas de acordo com a patologia e o patógeno. No entanto, são relatados casos de resistência a essas drogas e existe uma grande preocupação em relação aos efeitos adversos que elas podem causar nos pacientes. Nesse contexto, o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas poderia ser uma solução para a problemática atual das drogas disponíveis e isso requer o estudo de novos alvos moleculares. O gene ERG6 codifica a enzima esterol C-24 metiltransferase que atua na conversão de zimosterol em fecosterol. Constitui uma etapa que ocorre em fungos para a biossíntese do ergosterol, mas não ocorre nos hospedeiros animais, que possuem enzimas específicas para a conversão do zimosterol até colesterol. No presente trabalho, a função do gene ERG6 foi investigada e caracterizada no fungo Cryptococcus neoformans demonstrando que a ausência desse gene gera diversas alterações fenotípicas, tais como sensibilidade ao estresse osmótico, ao estresse oxidativo e maior susceptibilidade a diferentes drogas antifúngicas. Além disso, foi ainda observado que a capacidade de crescer em meios contento diferentes estressores de parede se mostra alterada. Em relação aos fatores de virulência conhecidos para C. neoformans, o fungo foi incapaz de crescer a temperatura de 37°C, porém não teve sua produção de cápsula ou melanina afetadas. No entanto, em testes para observação da sua capacidade de virulência in vitro utilizando macrófagos e in vivo com lagartas da espécie Galleria mellonella mostraram uma redução na virulência em mutantes de ERG6. Por fim a análise dos esteróis de membrana mostrou que ocorre uma alteração em toda a composição de esteróis da membrana celular. Dessa forma, por ser uma enzima encontrada principalmente em fungos, a Erg6 pode ser um alvo molecular potencial para drogas antifúngicas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The advent of HIV patients and immunocompromised patients caused an increase in the incidence of fungal mycoses, such as cryptococcosis. There are several antifungal agents commercially available for the treatment of such infections that are chosen based on the disease and the pathogen. However, cases of resistance are reported to these drugs and there is great concern about the adverse effects that they can cause on patients. In this context, the development of new antifungal drugs could be a solution to the current problem of the available drugs and it requires the study of potential molecular targets. The gene ERG6 encodes the sterol C-24 methyltransferase, an enzyme that acts on the conversion zimosterol in fecosterol. This is a step that occurs in fungi in the ergosterol biosynthesis, but does not occur in the animal hosts which have specific enzymes for the conversion of zymosterol to cholesterol. In this study, gene function of ERG6 was investigated and characterized in the Cryptococcus neoformans demonstrating the absence of this gene generates several phenotypic changes, such as sensitivity to osmotic stress, oxidative stress and increased susceptibility to different antifungal drugs. Furthermore, it was also observed that the ability to grow on media with different cell wall stressors was also altered. It was observed that the lack of ERG6 greatly affects the permeabillity of the membrane resulting in osmotic and oxidative stress sensitivity and changing antifungal drugs susceptibility. Furthermore, it was also observed that the ability to grow in medium with cell wall stressor was altered. About the virulence factor, C. neoformans was unable to grow at 37°C, but it had not affected the production of melanin or capsule. However, virulence tests in vitro with macrophages and in vivo with Galleria mellonella caterpillars showed a decrease in the virulence of ERG6 mutants. Finally, the membrane sterols analysis demonstrated a change in the membrane sterol composition. Thus, being an enzyme found especially fungi, the Erg6 may be a potential molecular target for antifungal drugs.

A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

O Complexo Cryptococcus neoformans compreende as espécies C. neoformans e C. gattii. Estas leveduras basidiomicéticas causam criptococose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Particularmente em fungos, proteínas ancoradas por Glicosilfosfatidilinositol (GPI-Ps) estão envolvidas em muitos aspectos da interação patógeno-hospedeiro, como adesão e invasão das células hospedeiras, modulação e evasão da resposta imune do hospedeiro e patogênese. Este trabalho tem por objetivo identificar proteínas ancoradas por GPI nas espécies do Complexo C. neoformans por análise in silico de suas sequências genômicas. Para isso, foi utilizado um conjunto de algorítimos para predição de GPI-Ps nas linhagens C. neoformans var. grubii (H99) e C. gattii (R265) através da análise de 6967 e 6210 seqüências de ORFs traduzidas, respectivamente. A classificação de uma proteína como sendo uma GPI-P seguiu o seguinte critério: a seqüência de aminoácidos apresentou (i) um peptídio sinal de secreção N-terminal; (ii) uma sequência sinal de ancoramento por GPI na extremidade C-terminal; (iii) ausência de domínios transmembrana internos. As seqüências foram obtidas no banco de dados genômicos do Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/science/data). Neste estudo, 63 proteínas foram identificadas como GPI-Ps em C. neoformans var. grubii (H99) e 47 em C. gattii (R265). Fosfolipase B1, Endo-1,3 -glucanases, Quitina desacetilases e Glioxaloxidases foram encontradas em ambas as espécies. Estas proteínas já foram previamente descritas como GPI-Ps, demonstrando que a metodologia empregada no estudo mostrou-se eficiente. As proteínas identificadas puderam ser, de maneira geral categorizadas funcionalmente, destacando-se aquelas envolvidas na biogênese e remodelamento da parede celular. Aproximadamente 70% das proteínas identificadas em ambas espécies não têm função conhecida, algumas tendo homólogas com outras proteínas fúngicas e outras sendo únicas da espécie. A identificação dessas proteínas será de extrema importância na elucidação de aspectos relacionados à patogênese e servirá de modelo para outras doenças causadas por fungos. / The Cryptococcus neoformans species Complex includes the Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii yeasts. These basidiomycete yeasts can cause disease in immunocompromised and immunocompetent patients, respectively. Notably in fungus, glicosylphosphatidilinositol-anchored proteins (GPI-Ps) are involved in different aspects of host-pathogen interaction, such as host cells adhesion and invasion, host immune response modulation and evasion and pathogenesis. In this work, we performed a systematic, genome-wide in silico identification of C. neoformans complex species GPI-Ps. A set of prediction tools was apllied for the screening of 6967 and 6210 predicted protein sequences from C. neoformans var. grubii (H99 strain) an C. gattii (R265 strain), respectively. The sequences were retrieved from the Broad Institute genome database (http://www.broadinstitute.org/science/data). The identification of putative GPI-Ps was based on the following criteria: i) the presence of an N-terminal signal peptide for secretion; ii) the presence of a C-terminal GPI-attachment site and iii) absence of internal transmembrane domains. A total of 63 putative GPI-Ps were identified in C. neoformans var. grubii and 47 proteins were identified as GPI-P in C. gattii. Proteins previously described as GPI-anchored, such as Phospholipase B1, Endo-1,3--glucanases, Chitin deacetylases and Glyoxaloxidases were identified in both species C. neoformans var grubii and C. gattii. The proteins identified could be classified in several functional categories, especially those involved in cell wall biogenesis and remodeling. About 70% of the GPI-Ps identified have unknown functions. Many of the putative GPI-Ps do not display conserved domains, but some possess have fungal orthologs homólogs while others are currently unique to specie. The GPI-P identification in Cryptococcus neoformans species complex is of extreme importance for elucidating aspects related to the pathogenesis and will serve as a model for others fungal diseases.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE ORIONALDA.pdf: 2127265 bytes, checksum: 6265bfc95f48ea602e76fd036eed1634 (MD5) Previous issue date: 2010-10-25 / Diferentes características fenotípicas como formação de cápsula polissacarídica, a expressão de lacase determinando a melanização em substratos fenólicos e produção de enzimas é prováveis fatores de virulência presentes nas espécies do complexo Cryptococcus neoformans. Neste trabalho foi avaliada a espessura da cápsula e da parede celular de isolados de C. neoformans. A atividade da fosfolipase e a suscetibilidade in vitro de C. neoformans à anfotericina B, voriconazol e ao extrato bruto da planta Pimenta pseudocaryophyllus foram também realizados para estes isolados. Os constituintes da célula como cápsula e parede celular foram ainda analisados quando sob a ação dos antifúngicose do extrato bruto da planta. A melanização das células foi obtida usando-se o meio mínimo adicionado de L-DOPA, a produção de fosfolipase foi feita em meio contendo gema de ovo, enquanto a suscetibilidade in vitro do microrganismo foi realizada pelo método de microdiluição em caldo seguindo o protococlo do CLSI. As células extraídas de um meio indutor de cápsula foram submetidas a uma concentração correspondente a 0,5 vezes da CIM obtida no teste de suscetibilidade in vitro, sendo medido o tamanho da cápsula e parede de 30 células de cada isolado e a média destes valores foi calculada. Os valores da espessura da cápsula de isolados de C. neoformans melanizados variaram de 1,20 a 1,90 &#956;m e de 2,63 a 5,12 &#956;m em não melanizados, quando submetidos ao meio de indução de cápsula. Com relação à parede, a variação foi de 0,80 a 1,09 &#956;m em células melanizadas e de 0,40 a 0,49 &#956;m em não melanizadas. A diferença para as medidas de cápsula, como de parede mostrou-se com valores estatisticamente significantes (p <0,05). Todos os isolados de C. neoformans foram capazes de produzir fosfolipase, sendo que os isolados melanizados apresentaram atividade desta enzima em 85,3%, enquanto nos não melanizados o percentual foi de 79,5%. A suscetibilidade do microrganismo melanizado ou não aos antifúngicos e ao extrato da planta mostrou-se equivalente, com a variação de CIM para voriconazol de 0,062-0,125 &#956;g/mL, 0,125-0,5 &#956;g/mL para anfotericina B e de 64 a 128 &#956;g/mL para o extrato bruto de P. pseudocaryophyllus. Os antifúngicos vorioconazol e anfotericina B e extrato bruto de P. pseudocaryophyllus, induziram redução de espessura da cápsula e parede celular de C. neoformans, quando comparados com o controle (ausência do fármaco ou da extrsto de planta) independente da presença ou não da melanina. As alterações verificadas na cápsula e parede celular de C. neoformans neste estudo poderão servir de guias para outras pesquisas direcionadas aos efeitos de antifúngicos na patogenia de criptococose.

La criptococosis es una micosis profunda que puede afectar al ser humano y a diversos animales. Tiene un curso crónico ó subagudo. El agente causal es una levadura capsulada llamada Cryptococcus neoformans. Este proceso puede presentarse en personas sanas, pero afecta sobre todo a sujetos inmunodeprimidos. La infección se inicia por la inhalación de las levaduras y diseminación por vía hematógena al sistema nervioso central.El objetivo principal de este trabajo ha sido de disponer de datos para conocer la epidemiología de la criptococosis en España.- Se han recopilado 184 cepas de 8 diferentes áreas geográficas de España, 128 de orígen clínico humano ( 95 % VIH + y ADVP), 13 de orígen animal, y 43 de muestras ambientales. - Se han estudiado muestras de polvo doméstico de 79 domicilios para comprobar si podían ser una fuente de infección. Seis muestras provenían de domicilios de pacientes con SIDA y criptococosis, 11 de pacientes VIH(+) sin criptococosis, y 62 de personas sanas. No se ha aislado C. neoformans en niguna muestra. El polvo doméstico no parece ser un reservorio de importancia para la transmisión de la criptococosis.- El estudio de las biovariedades mediante el crecimiento en medio de L-canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) junto con la asimilación de D-prolina y D-triptófano ha permitido demostrar por primera vez, la presencia en nuestro país de la variedad gattii de C. neoformans. Esta variedad produjo 5 brotes epidémicos de criptococosis en cabras en la provincia de Cáceres, con un alto porcentaje de animales afectados. Todas sufrían de síntomas respiratorios severos asociados a caquexia y síntomas neurológicos, y con un 100 % de mortalidad en los animales enfermos. Todas las cepas pertenecían al serotipo B.- Se obtuvieron sueros policlonales de los diferentes serotipos mediante inmunización de conejos. Se procedió por técnica de aglutinación al estudio del serotipado de todas las cepas. La distribución de los serotipos no es homogénea, varía según las regiones geográficas. El serotipo A es predominante, sin embargo hay una elevada tasa del serotipo D en las muestras clínicas y ambientales.- El estudio de las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) mediante la técnica de microdilución ha mostrado que el nivel global de resistencias es muy bajo. No se ha hallado ninguna cepa con CIM>1 mg/ml para anfotericina B. Las cepas del serotipo A mostraron menor sensibilidad. La 5-fluorocitosina ha resultado el antifúngico menos activo. El fluconazol ha mostrado menor actividad que el itraconazol. Tres cepas tenían CIM>64 mg/ml. El serotipo D mostró menor sensibilidad a los dos triazoles que el resto de los serotipos (P<0.00001). Las cepas de la var. gattii mostraron una sensibilidad uniformemente baja, y las ambientales tenían sensibilidades similares a las clínicas.- El método colorimétrico Sensititre utilizado para el estudio de las sensibilidades de 42 cepas de C. neoformans fué útil por su fácil ejecución y lectura de puntos de corte, sin embargo es un sistema que proporciona valores más bajos de CIM que el método de referencia.- Se determinaron las CIM de un nuevo antifúngico derivado de las sordarinas (GM 237354) en 190 cepas de C. neoformans. Se obtuvieron 5 cepas con valores de 2 mg/ml. La var. gattii es la que mostró menor sensibilidad. Se obtuvieron diferencias significativas entre los serotipos A y AD con respecto al serotipo B.- La aplicación de la técnica molecular del RAPD ha permitido demostrar que por lo menos coexisten 2 genotipos diferentes de la var. gattii aislada en cabras. Uno de los patrones parece ser el dominante, se ha hallado en todas los brotes epidémicos, mientras que el otro sólo se detectó en una zona. Con la misma técnica se ha podido discriminar entre diferentes aislamientos de un mismo paciente con criptococosis. / Cryptococcosis is a deep mycosis that can affect human beings and several types of animals. It can have either a chronic or a subacute course. Its causal agent is an encapsulated yeast called Cryptococcus neoformans. This process can appear in healthy humans although it mainly affects immunodepressed individuals. The infection begins by inhalation of the yeast and dissemination to the central nervous system by the haematogenous route.The main purpose of this study was to obtain information on the epidemiology of cryptococcosis in Spain.- One hundred and eighty-four strains were collected from eight different geographical areas in Spain. One hundred and twenty-eight strains were of human clinical origin (95% HIV + IDU), 13 of animal origin and 43 were environmental samples. - Samples of household dust proceeding from 79 homes were studied to check whether they could be a source of infection. Six samples proceeded from the homes of patients with AIDS and cryptococcosis, 11 from HIV(+) patients without cryptococcosis and 62 from healthy individuals. C. neoformans was not isolated in any of the samples. Domestic dust does not appear to be a reservoir of importance in the transmission of cryptococcosis.- The study of biovarieties using growth in L-canavanine-glycine-bromothymol blue (CGB) medium together with D-proline and D-tryptophan assimilation made it possible to prove, for the first time, the presence in our country of the Cryptococcus neoformans variety gattii. In the province of Cáceres, this variety produced five epidemic cryptococcosis outbreaks in goats, with a high percentage of affected animals. All the animals had severe respiratory symptoms associated with cachexia and neurological symptoms, with 100% mortality in sick animals. All were serotype-B strains.- Polyclonal serums of the various serotypes were obtained by immunisation of rabbits. The agglutination technique was used to carry out a serotyped study of all the strains. The distribution of the serotypes was not homogeneous but varied depending on the geographical regions. Serotype A was predominant although there was a high rate of serotype D in the clinical and environmental samples.- The study of the minimal inhibitory concentrations (MIC) using the microdilution technique proved that the global resistance level was very low. No strain with a MIC > 1 mg/ml was found for amphotericin B. Serotype-A strains showed less sensitivity. 5-fluorocytosine proved to be the least active antifungal agent. Fluconazol proved to be less active than itraconazole. Three strains had a MIC > 64 mg/ml. Serotype D showed less sensitivity to the two triazoles than the rest of the serotypes (P < 0.00001). All the strains of the gattii variety showed uniformly low sensitivity and the sensitivity of the environmental strains was similar to that of the clinical ones.- The colorimetric method Sensititre used for sensitivity testing in 42 strains of C. neoformans was useful because of its ease of implementation and breakpoint reading. However, this system gave lower values of MIC than the reference method. - The MICs of the new antifungal agent derived from sordarins (GM 237354) were determined in 190 strains of C. neoformans. Five strains with values of 2 mg/ml were obtained. The variety gattii is that which showed least sensitivity. Significant differences were obtained between serotypes A and D with respect to serotype B.- Application of the molecular technique RAPD demonstrated the coexistence of at least two different genotypes of the var. gattii isolated in goats. One of the patterns appears to be dominant, it is found in all epidemic outbreaks, whereas the other was only detected in one area. It was possible to distinguish between different isolations of a same patient with cryptococcosis using the same technique.

Thesis (Ph. D.)--University of Nevada, Reno, 1999. / Includes bibliographical references. Online version available on the World Wide Web.

Resumo: Nas últimas décadas, evidenciou-se aumento considerável de micoses de caráter invasivo e de difícil tratamento. A criptococose vem representando significativa causa de mortalidade, principalmente em indivíduos HIV positivos. É enfermidade causada por espécies de leveduras encapsuladas, Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, ambas as espécies constituindo-se nos agentes fúngicos mais frequentes a comprometer o sistema nervoso central (SNC). A disponibilidade de antifúngicos para a criptococose no mercado, atualmente é limitado, visto que em alguns casos, muitos deles são ineficientes e tóxicos. Além disso, adiciona-se também a diminuição de cepas sensíveis aos antifúngicos atuais, sendo um importante fator de complicação no tratamento dessas infecções. Neste estudo o gene ERG11 que codifica a proteína Lanosterol 14 C Desmetilase, alvo de fluconazol, de isolados clínicos seriados de C. neoformans recuperados de um paciente e um isolado de psitacídeo de C. gattii, que apresentaram valores de CIM elevadas (Concentração Inibitória Mínima) para o fluconazol, foi analisado. Para atingir este objetivo, os isolados clínicos sequenciais 26, 27 e 30 de um paciente do Rio de Janeiro, C. neoformans ATCC 90012 e o isolado do psitacídeo de C. gattii foram selecionados. O isolado C. gattii e os isolados 26, 27 e 30 de C. neoformans, caracterizados como sensível, intermediário e resistente in vitro a fluconazol, respectivamente, foram selecionados para análise de pontos de mutação na sequência do gene ERG11 através do sequenciamento dos produtos amplificados utilizando primers desenhados a partir da sequência do gene. A sequência do gene ERG11 do isolado 30 (resistente) apresentou um ponto de mutação e duas variações na sequência nucleotídica. A primeira, quando alinhada e comparada com a sequência do isolado 26 (sensível) e do gene de referência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the last decades, there was a considerable increase in invasive fungal infections of difficult treatment. Cryptococcosis has represented a significant cause of morbidity and mortality, especially among HIV positive individuals. It is a disease caused by encapsulated yeasts species, Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, both species becoming the most common fungal agents to compromise the central nervous system (CNS). The availability of commercial antifungals is currently restricted and many of them are ineffective and toxic. In addition, there was the emergence of resistant strains to the current antifungals and this is an important complicating factor in treating these infections. In this study, the ERG11 gene that encodes the protein alpha Lanosterol 14-demethylase, target of fluconazole of serial clinical isolates of C. neoformans recovered from a patient and an isolate of C. gattii of a parrot, which showed higher MIC values (Minimum Inhibitory Concentration) for fluconazole was analyzed. To achieve this goal, the sequential clinical isolates 26, 27 and 30 of a patient from Rio de Janeiro, C. neoformans ATCC 90012 and the isolate of C. gattii of the parrot were selected. Isolates 26, 27 and 30 susceptible (S), intermediate (I) and resistant (R) in vitro, respectively, and the isolation of C. gattii were selected for analysis of mutation points in the ERG11 gene sequence by sequencing of amplified products using primers designed from the sequence of the gene. The ERG11 gene sequence of isolate 30 (resistant) showed a mutation point and two variations in the nucleotide sequence. The first, when aligned and compared with the sequence of isolate 26 (susceptible) and the reference gene was significant and the other two changes were silent. When the sequence was translated into Lanosterol 14-alpha demethylase protein, we found that the mutation led to an amino acid exchange... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ana Marisa Fusco Almedia / Coorientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Marica de Souza Carvalho Melhem / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Mestre

A criptococose é uma doença invasiva capaz de apresentar-se de forma fatal podendo acometer pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos. Os agentes etiológicos Cryptococcus neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans apresentam distribuição cosmopolita, sendo as excretas de pombos o seu principal reservatório. Com o advento de terapias imunossupressoras e a pandemia de HIV, observou-se o aumento significativo de casos de pacientes com criptococose. Atualmente, o diagnóstico é baseado na apresentação clínica, na observação microscópica de líquor corado com tinta da Índia e/ou no isolamento em cultura. Neste trabalho desenvolveu-se um ELISA para detecção de anticorpos contra C. neoformans var. grubii em soro de pacientes utilizando como antígeno um extrato protéico total de uma linhagem clínica isolada de um paciente com criptococose (HC6). Foram testados através de ELISA 40 amostras de soros de pacientes com criptococose, sendo 67,5% positivos e 32,5% falsos negativos. Como controles negativos foram testados 82 amostras de soros de indivíduos hígidos, dos quais 26,82% apresentaram resultados positivos para os testes realizados. Para testar a reatividade cruzada, foram utilizadas 10 amostras de pacientes com histoplasmose (20% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com paracoccidioidomicose (66,6% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com candidose (13,3% de reatividade cruzada) e 7 amostras de pacientes com aspergilose (14,28% de reatividade cruzada). Visando solucionar o problema da reatividade cruzada, identificamos proteínas antigênicas de C. neoformans var. grubii por eletroforese bidimensional seguida por western blot e espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). Das 75 amostras analisadas, quatro foram identificadas: uma proteína hipotética, 2 isoformas de HSPs 70 e uma catalase-2. As proteínas identificadas apresentaram baixa similaridade com ortólogas de outros fungos patogênicos, sendo, dessa forma, possíveis alvos para a padronização do ELISA e diagnóstico da criptococose. / Cryptococosis is an invasive and potentially fatal disease. Cryptococcus neoformans is the etiological agent, which can affect both immunocompromised and immunocompetent individuals. C. neoformans var. grubii and C. neoformans var. neoformans are cosmopolitan and their major natural reservoir is the excrement from pigeons. With the advent of immunosupressor therapies and the pandemic HIV infection, a significant augmentation of cryptococosis cases in humans was observed. Nowadays cryptococcosis diagnosis is based on the clinical presentation, India ink sample preparation methods and/or in vitro culture isolation. In this work we had developed an ELISA to detect antibodies against C. neoformans var. grubii in serum from patients with cryptococcosis using as antigens a whole cell protein extract from a clinical cell line isolate (HC6). Sera from 40 patients with cryptococcosis were tested by ELISA. From these, 67.5% were positives and 32.5% were false-negatives. As a negative control 82 samples from health subjects were also tested, from these 26.82% were positives. To test cross-reactivity, samples from 10 patients with histoplasmosis (20% cross-reactivity), 9 from patients with paracoccidioidomicosis (66.6% cross-reactivity), 9 from patients with candidosis (13.3% cross-reactivity) and 7 from patients with aspergilosis (14.28% cross-reactivity) were tested. To solve the cross-reactivity problem, we searched immunogenic proteins which were specific to C. neoformans var. grubii applying two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE-PAGE) followed by western blot and mass spectrometry (MALDI-TOF MS). From the 75 sample analyzed, four were identified: one as a hypothetic protein, two HSPs 70 isoforms and the protein catalase 2. These proteins showed low similarity with orthologues from other pathogenic fungi, and are potential targets to further of the standardizing cryptococosis diagnosis by ELISA.