Objetivo: Determinar el perfil epidemiológico del cáncer de mama HER2- positivo en pacientes atendidos en el Hospital Nacional Hipólito Unanue entre Junio del 2012 a Junio del 2015. Material: revisión retrospectiva de fichas de notificación, (Directiva Sanitaria de Vigilancia Epidemiológica del Cáncer. Registros Hospitalarios) de 34 pacientes con cáncer de mama HER 2 – positivo entre Junio del 2012 a Junio del 2015, en el Hospital Nacional Hipólito Unanue, en la Unidad de cáncer de mama y patología mamaria. Resultados: la edad media fue de 48 años (11,76%), el tamaño tumoral más frecuente fue de 2 a 5 cm (47,06%), el grado histológico más frecuente corresponde a pobremente diferenciado (64,71%), el mayor porcentaje (61,76%) no tuvo recurrencia local, el mayor porcentaje (94,12%) no tuvo metástasis, el tratamiento más frecuente fue el de terapia doble (50,00%), que incluye mastectomía radical y quimioterapia. Conclusiones: La clasificación del cáncer de mama basada en parámetros inmunohistoquímicos (IHQ) permite una mejor definición del pronóstico.

El cáncer es una patología que cada vez se hace más prevalente a nivel mundial. El tipo de cáncer con la mayor tasa de prevalencia en pacientes del género femenino es el cáncer de mama. En el Perú, es el segundo tipo de cáncer más frecuente. El diagnóstico se realiza en estadíos avanzados (estadío III y IV), lo cual trae limitaciones en el manejo de las pacientes. Es por ello que la detección temprana es de suma importancia. Dentro de las pruebas evaluadas para su tamizaje, la de mayor sensibilidad diagnostica y a su vez la más costo-efectiva es la mamografía. Objetivo: Evaluar las mamografías de tamizaje realizadas en el Centro de Prevención y Diagnóstico del Cáncer en el INEN, para determinar su valor predictivo positivo como método de detección temprano de cáncer de mama. Método: Se realizó un estudio de enfoque cuantitativo, de diseño no experimental, de tipo transversal y retrospectivo en el Centro de Prevención y Detección del Cáncer del Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas durante Mayo 2013 a Abril 2014. Resultados: Se obtuvo que, de las biopsias realizadas (85) en las pacientes con mamografías BI-RADS 4 (99), 54 fueron positivas para lesiones cancerígenas, lo que hace que la mamografía tenga un valor predictivo positivo de 63.53%. Conclusión: En este estudio que las mamografías de tamizaje tienen un alto valor predictivo positivo para la detección del cáncer de mama

Objetivo: Determinar el perfil epidemiológico del Cáncer de Mama Triple Negativo en pacientes atendidos en el Hospital Nacional Hipólito Unanue entre Junio del 2012 a Junio del 2015. Material: Revisión retrospectiva de fichas de notificación, (Directiva Sanitaria de Vigilancia Epidemiológica del Cáncer. Registros Hospitalarios) de 42 pacientes con Cáncer de Mama Triple Negativo entre Junio del 2012 a Junio del 2015, en el Hospital Nacional Hipólito Unanue, en la Unidad de Cáncer de Mama y Patología Mamaria. Resultados: La edad media fue de 51 años (14,2%), estado menopáusico más frecuente fue el Pre Menopáusico (52.4%), el estadío patológico más frecuente fue Estadío III (54.8%), el tamaño tumoral más frecuente fue el que afecta a piel (47,06%), hubo compromiso axilar en un 81%, el grado histológico más frecuente corresponde a pobremente diferenciado (64,71%), el mayor porcentaje (50%) no tuvo recurrencia local, el mayor porcentaje (83.3%) no tuvo metástasis, el tratamiento más frecuente fue el de terapia doble (33.3%), que incluye mastectomía radical y quimioterapia. Conclusiones: La clasificación del cáncer de mama basada en parámetros inmunohistoquímicos (IHQ) permite una mejor definición del pronóstico.

La presente investigación tuvo como objetivo determinar si existe asociación entre los niveles de resiliencia y los niveles de los estilos de afrontamiento en mujeres con cáncer de mama de un hospital estatal de Chiclayo, 2013. El tipo de investigación es correlacional por asociación. Para su realización, se evaluó a 70 pacientes entre 25 y 60 años de edad, a quienes se les aplicó instrumentos para la recolección de datos como la escala de resiliencia de Wagnild y Young y el inventario de estimación de afrontamiento, COPE; de los cuales se estableció la confiabilidad, validez y baremación. Finalmente, se llegó a la conclusión que existe asociación altamente significativa entre los niveles de resiliencia y los niveles de los estilos de afrontamiento en mujeres con cáncer de mama de un Hospital Estatal de Chiclayo-2013.

La presente investigación tuvo como objetivo determinar si existe asociación entre los niveles de resiliencia y los niveles de los estilos de afrontamiento en mujeres con cáncer de mama de un hospital estatal de Chiclayo, 2013. El tipo de investigación es correlacional por asociación. Para su realización, se evaluó a 70 pacientes entre 25 y 60 años de edad, a quienes se les aplicó instrumentos para la recolección de datos como la escala de resiliencia de Wagnild y Young y el inventario de estimación de afrontamiento, COPE; de los cuales se estableció la confiabilidad, validez y baremación. Finalmente, se llegó a la conclusión que existe asociación altamente significativa entre los niveles de resiliencia y los niveles de los estilos de afrontamiento en mujeres con cáncer de mama de un Hospital Estatal de Chiclayo-2013. / Tesis

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Estudios previos han demostrado que derivados del ácido gálico unidos a trifenilfosfonio mediante una cadena alifática de diez carbonos son efectivos agentes citotóxicos, desacoplando la cadena transportadora de electrones del complejo ATP sintasa mitocondrial en células de adenocarcinoma murinas. En el presente trabajo se demostró dicho efecto en células de cáncer de mama humano, así como también se determinó la relación estructura-actividad de derivados de este compuesto. Fueron analizados derivados mono- y di-hidroxilados del ácido benzoico en diferentes líneas celulares de cáncer de mama humanas, las cuales se diferencian en su perfil metabólico y en la expresión de receptores de crecimiento y hormonales. Se observó que dos de los nuevos derivados presentan un mayor efecto citotóxico que los previamente estudiados, los cuales son 2-OH TPP+C10 y Gent TPP+C10, debido a una mayor actividad desacoplante de la fosforilación oxidativa. En forma exhaustiva fueron estudiadas las líneas celulares, MCF7 caracterizada por la presencia de receptores hormonales y la línea MDA-MB-231, la cual posee un fenotipo triple negativo con características metastásica y un metabolismo altamente glicolítico. Se evidenció que los derivados presentan un tropismo mitocondrial, afectando las funciones de este organelo debido a que son capaces de desencadenar una disminución del potencial de transmembrana mitocondrial, lo que conlleva a una disminución de la razón NAD(P)H/NAD(P)+ y una caída del ATP total, parcialmente compensada por la actividad de AMP-kinasa y adenilato kinasa. Como consecuencia, se desencadena una muerte de tipo apoptótica. Además, se observó que los derivados son capaces de inhibir la migración celular en la línea metastásica. La selectividad de estos compuestos fue evaluada al comparar el efecto citotóxico con la línea mamaria epitelial MCF 10F, demostrando que los compuestos 2-OH TPP+C10 y Gent TPP+C10 presentan selectividad a las concentraciones utilizadas, ya que no inducen una muerte significativa a las 48 horas, ni una caída del ATP total en las condiciones analizadas. Como conclusión, todas las moléculas analizadas presentan actividad citotóxica similar en células de cáncer de mama humanas; además, la modificación realizada al grupo farmacóforo la aumenta / Previous studies have shown that gallic acid derivatives bound to an aliphatic chain of ten carbons length to triphenylphosphonium are effective cytotoxic agents, inducing an uncoupler effect to the electron transport chain of the mitochondrial ATPsynthase complex in murine adenocarcinoma cells. The present work displays the effect of these derivatives in human breast cancer cells, as well as the study of the structure-activity relationship derived from these compounds. Mono- and di-hydroxyl derivatives of benzoic acid were analyzed in different human breast cancer cell lines, which differ in their metabolic profile, hormone receptors expression and growth. It was observed that two new derivatives exhibit greater cytotoxic effect than those previously studied, which are: 2-OH TPP+C10 and Gent TPP+C10, due to an increased activity of uncoupling oxidative phosphorylation process. Two cell lines were exhaustively studied, MCF7 characterized by the presence of hormone receptors and MDA-MB-231, which has a triple negative phenotype, metastatic features and a highly glycolytic metabolism. It was demonstrated that the derivatives possess a mitochondrial tropism, affecting the functions of this organelle because they are capable of triggering a decrease in mitochondrial transmembrane potential, leading to a decrease in NAD(P)H/NAD(P)+ ratio and drop of total ATP, partially offset by the activity of AMP-kinase and adenylate kinase. As a result, the intrinsic apoptotic death via is triggered. It was further noted that the derivatives are capable of inhibiting cell migration in metastatic cell line. The selectivity of these compounds was evaluated by comparing the cytotoxic effect with MCF 10F mammary epithelial cell line, showing that compounds 2-OH TPP+C10 and Gent TPP+C10 revealed selectivity at the concentrations used, as they did not induce significant death at 48 hours of treatment, or a drop of the total ATP in the conditions analyzed. In conclusion, all tested molecules shown similar cytotoxic activity on breast human cancer cell lines where, the modification in the pharmacophore moiety increased this activity

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica Aplicada / Memoria de título de bioquímico / A nivel mundial, el cáncer de mama (CM), es el más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en mujeres, representando el 23% del total de casos nuevos de cáncer y el 14% del total de muertes por cáncer. En Chile, también constituye la primera causa de muerte por cáncer en mujeres, y la mortalidad por esta causa, ha ido en aumento en las últimas dos décadas. Aún cuando la etiología exacta del CM es desconocida, existen múltiples factores de riesgo asociados al desarrollo de esta patología, siendo la historia familiar de CM el más importante. Actualmente se ha establecido que la predisposición heredada al CM, involucra la participación de 3 categorías de alelos de susceptibilidad, de acuerdo al perfil de riesgo que ellos confieren: 1.- Genes de alta penetrancia, 2.- Genes de moderada penetrancia y 3.- Alelos de baja penetrancia. Estos últimos, han sido objeto de gran interés por distintos grupos investigadores. Se trata de polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) que confieren bajo riesgo para el desarrollo de CM y que son relativamente comunes en la población, razón por la cual podrían explicar hasta el 22% de los casos de CM que no presentan mutaciones en los genes de alta y moderada penetrancia conocidos en la actualidad. Los SNPs rs3803662 (TOX3), rs13387042 (2q35) y rs13281615 (8q24) se han identificado como alelos de susceptibilidad de baja penetrancia para CM en diversos trabajos realizados principalmente en población Europea y Asiática, estableciéndose como alelo de riesgo a aquel que presenta menor frecuencia poblacional y describiéndose aumentos de riesgo para el desarrollo de la enfermedad que varían entre 1.05 – 1.65 veces. En el presente trabajo, mediante un estudio caso-control, se analizó la asociación entre estos SNPs y riesgo para CM familiar en población Chilena. Para esto, se realizó genotipificación de los SNPs rs3803662, rs13387042 y rs13281615 en 347 casos de CM y en 801 controles. Los casos de CM, se dividieron según historia familiar de CM (215 casos con CM familiar (subgrupo A), y 132 casos sin antecedentes familiares de CM, y con edad de diagnóstico temprano (≤ 50 años) (subgrupo B)). Se establecieron las frecuencias alélicas y genotípicas de cada polimorfismo, y se analizó su asociación con aumento del riesgo para CM, aplicando software estadísticos. Además se realizaron genotipos combinados entre los distintos SNPs en estudio y se analizó el efecto de estos, sobre el riesgo para CM. Los resultados obtenidos, mostraron que el alelo T del SNP rs3803662 y el alelo A del SNP rs13387042, se asociaron significativamente con aumento del riesgo para CM (OR: 1.44; IC95%: [1.20-1.74]; p<0.0001 y OR: 1.34; IC95%: [1.11-1.61]; p=0.0009, respectivamente). Además, se encontró que el alelo G del SNP rs13281615 (8q24), descrito en la literatura como el alelo de riesgo para CM, fue el alelo de mayor frecuencia en población Chilena. Sin embargo, este alelo no se asoció con aumento del riesgo para CM. En relación a los genotipos combinados, entre los SNPs rs3803662 y rs13387042, rs3803662 y rs13281615, y rs13387042 y rs13281615, se observó que el riesgo para CM aumentó a medida que aumentaba el número de alelos de riesgo. Además, en el subgrupo B, el genotipo combinado doble homocigoto de riesgo entre los SNPs rs3803662 y rs13387042 (T/T-A/A), presentó interacción génica en escala aditiva. Como conclusión de este trabajo se postula que, en población Chilena, el alelo T del SNP rs3803662 y el alelo A del SNP rs13387042, son alelos de susceptibilidad de baja penetrancia para el desarrollo de CM; que el riesgo que estos confieren, aumenta a medida que aumenta el número de alelos de riesgo; y que en mujeres jóvenes (≤ 50 años), sin antecedentes familiares de CM, existe interacción génica entre los SNP rs3803662 y rs13387042. / Worldwide, breast cancer (BC) is the most common and the leading cause of death by cancer in women, accounting for 23% of all new cancer cases and 14% of all cancer deaths. In Chile, it is also the leading cause of death by cancer in women, and mortality from this cause, has been increasing in the last two decades. Although the exact etiology of BC is unknown, there are many risk factors associated with the development of this disease, family history of BC being the most important. It has now been established that the inherited predisposition to BC, involves the participation of three categories of susceptibility genes, according to the risk profile they give: 1.- High penetrance genes, 2.- Moderate penetrance genes and 3.- Low-penetrance alleles. The latter have been the subject of great interest in various research groups. It relates to single nucleotide polymorphisms (SNPs) that confer low risk for the development of BC and are relatively common in the population; this could explain up to 22% of BC cases where there are no mutations in the genes of high and moderate penetrance currently known. The SNPs rs3803662 (TOX3), rs13387042 (2q35) and rs13281615 (8q24) have been identified as susceptibility alleles with low penetrance for BC in various studies done primarily in European and Asian population, establishing as risk allele the one with the lowest population frequency and describing increases on the risk for development of the disease ranging between 1.05 - 1.65 times. In this thesis, through a case-control study, it was examined the association between these SNPs and the risk of family BC on the Chilean population. For this, it was performed genotyping of SNPs rs3803662, rs13387042 and rs13281615 in 347 cases of BC and on 801 controls. BC cases were divided according to family history of BC (215 cases with family BC (subgroup A), and 132 cases with no family history of BC, and early diagnosis age (≤ 50 years) (subgroup B)). Using statistical software were established genotypic and allelic frequencies of each polymorphism, and analyzed their association with increased risk of BC. Combined genotypes were also carried out between different SNPs studied and the effect of these on the risk of BC was analyzed. The results obtained showed that the T allele of SNP rs3803662 and allele A of SNP rs13387042, were significantly linked with increased risk of BC (OR: 1.44; IC95%: [1.20-1.74]; p <0.0001 and OR: 1.34; IC95%: [1.11-1.61]; p = 0.0009, respectively). Furthermore, it was found that the G allele of SNP rs13281615 (8q24), described in the literature as the risk allele for BC, was the most frequent allele in Chilean population. However, this allele was not associated with increased risk of BC. Regarding combined genotypes among SNPs rs13387042 and rs3803662, rs13281615 and rs3803662, rs13387042 and rs13281615, it was observed that the risk of BC increased as the number of risk alleles increased. Furthermore, in subgroup B, double homozygous risk combined genotype between SNPs rs3803662 and rs13387042 (T/T-A/A), presented additive scale gene interaction. As conclusion of this studies it is postulated that, in Chilean population, the T allele of SNP rs3803662 and A allele of SNP rs13387042, are susceptibility alleles of low penetrance for the development of BC; that the risk they confer increases as it increase the number of risk alleles; and that on young women (≤ 50 years) with no family history of BC, gene interaction exists between rs3803662 and rs13387042.

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la principal causa de muerte en mujeres en el mundo. Este cáncer es una enfermedad heterogénea compuesta por varios sub-tipos biológicamente distintos, en los cuales la participación del metabolismo en la proliferación celular permanecen pobremente entendido. Además, las células tumorales exhiben una alta capacidad de remodelar su metabolismo frente a cambios en la disponibilidad de sustratos o algún estrés metabólico, siendo una respuesta adaptativa que promueve la sobrevida celular. Sin embargo, la participación del metabolismo mitocondrial en la proliferación y la inducción de un remodelamiento metabólico mediante la inhibición farmacológica de la cadena transportadora de electrones (CTE) para obtener efectos anti-proliferativos permanecen escasamente explorados en células de cáncer de mama. Los resultados sugieren que las líneas celulares de cáncer de mama, comparadas con las células no-tumorales, presentan diferencias en el metabolismo mitocondrial, exhibiendo reducida capacidad de reserva y funcionando su CTE en su máxima velocidad. Además, las células de cáncer de mama exhiben diferentes dependencias sobre la disponibilidad de glucosa y glutamina para mantener la proliferación y frente a la privación de glucosa, pueden remodelar la organización bioenergética hacia el metabolismo mitocondrial. De forma interesante, estos datos sugieren que el funcionamiento de la CTE en células tumorales podría ser esencial para funciones celulares y que su bloqueo podría tener efectos anti-tumorales selectivos. A partir de una serie de compuestos con estructura química de tipo quinona/hidroquinona, se identificó un compuesto (Cpd.7) con efecto anti-proliferativo selectivo hacia células de cáncer de mama murinas y humanas. Cpd. 7 fue identificado como un inhibidor no-competitivo de la actividad del complejo I, con un sitio de unión putativo en el brazo hidrofóbico cercano al sitio de unión de ubiquinona. Este compuesto inhibió la respiración mitocondrial dependiente del complejo I, disminuyó la razón NAD+/NADH, produjo despolarización mitocondrial, afectando solo a tiempos tempranos los niveles de ATP. En células tumorales, Cpd. 7 produjo un selectivo remodelamiento metabólico hacia un fenotipo glicolítico dependiente de AMPK, siendo un mecanismo de sobrevida. De forma interesante, la disponibilidad de sustratos y la flexibilidad metabólica exhibida por células tumorales son factores que determinan el efecto de Cpd. 7, variando entre un efecto citotóxico o anti-proliferativo. Cpd. 7 afecta selectivamente la proliferación de células de cáncer de mama, induciendo detención del ciclo celular y senescencia. Este efecto es debido los cambios en la razón NAD+/NADH producida por la inhibición de la respiración mitocondrial, alterando la síntesis de amino ácidos (especialmente aspartato), los cuales son requeridos como precursores para la síntesis de nucleótidos durante la proliferación. En conclusión, en este trabajo se demuestra que la inhibición de la CTE a nivel del complejo I por pequeñas moléculas produce efectos anti-proliferativos, los cuales son mediados por la inducción de un selectivo remodelamiento metabólico en células de cáncer de mama / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of death from cancer in women worldwide. This cancer is a heterogeneous disease comprised of several biologically distinct sub-types, in which the participation of the metabolism in the proliferation remain poorly understood. In addition, cancer cells exhibit a high capacity to remodel the metabolism in response to changes in the substrate availability or some metabolic stress, being an adaptive response that promote the cell survival. However, the participation of mitochondrial metabolism in the proliferation and the induction of a metabolic remodeling though the pharmacologic inhibition of the electron transport chain (ETC) to obtain anti-proliferative effect remains scarcely explored in breast cancer cells. Results suggest that the cell lines of breast cancer, compared to the non-tumoral cells, show differences in the mitochondrial metabolism, exhibiting reduced spare capacity and a high ETC activity. Moreover, breast cancer cells exhibit different dependence on glucose and glutamine availabilities to maintain the proliferation and under glucose deprivation, they can remodel the bioenergetic organization toward the mitochondrial metabolism. Interestingly, these data suggest that the ETC function in breast cancer cells may be essential for cellular functions and blocking may have selective anti-cancer effects. From a series of new compounds with chemical structure with quinone/hydroquinone scaffold, it was identified a compound (Cpd.7) with selective anti-proliferative effect toward murine and human breast cancer cells. Cpd. 7 was identified as a non-competitive inhibitor of complex I activity with a putative binding site in the hydrophobic arm next the binding site of ubiquinone. This compound inhibited the Complex I-dependent mitochondrial respiration, decreased the NAD+/NADH ratio, induced mitochondrial deporalization, affecting the ATP levels only at short time of exposition. In cancer cells, Cpd. 7 induced a selective metabolic remodeling toward a AMPK-dependent glycolytic phenotype, being a survival mechanism. Interestingly, the substrate availability and metabolic flexibility exhibited by breast cancer cells are determinants of the anti-cancer effect of Cpd.7, ranging from cytotoxic and anti-proliferative effects. Cpd. 7 selectively affects the proliferation of breast cancer cells, inducing cell cycle arrest and senescence. This effect occurs due changes in the NAD+/NADH ratio produced by the inhibition of the mitochondrial respiration, altering the amino acid synthesis (especially aspartate), which are required as precursors in the nucleotide synthesis during the proliferation. In conclusion, this work shows that the inhibition of ETC function at complex I level by small molecules produces anti-proliferative effects, which are mediated by the induction of a selective metabolic remodeling in breast cancer cells / Fondecyt; Fondap

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer de mama corresponde a una de las neoplasias malignas que más se asocia a mortalidad en el género femenino a nivel mundial. Aunque su incidencia ha disminuido gracias a la implementación de mamografías de exploración y aplicación de terapias adyuvantes, esta disminución no parece ser suficiente, ya que el desarrollo de metástasis aún sigue siendo responsable de más del 90% de las muertes asociadas a cáncer de mama, entre otros tipos de cáncer. La progresión de células tumorales hacia un estado metastásico implica la adquisición de características, tales como resistencia a apoptosis, migración e invasividad elevada etc. Teniendo en cuenta esto último, se ha descrito que muchas de estas características son potenciadas por la expresión de Caveolina-1 (CAV1), involucrando a esta proteína de la membrana en la progresión del cáncer. Específicamente en cáncer de mama avanzado se ha observado que una elevada expresión de CAV1 se asocia a una menor sobrevida del paciente. Por otro lado, estudios in vitro realizados en nuestro laboratorio en la línea celular de cáncer de mama metastásico humano, MDA-MB-231, han indicado que el silenciamiento de CAV1 conduce a una disminución en la migración, polarización y recambio de adhesiones focales en comparación con células MDA-MB-231 control. La pregunta que surge ahora es de qué manera CAV1 es capaz de promover migración e invasión, favoreciendo metástasis, considerando que este proceso en sí es ineficiente debido a que menos del 0,1% de las células diseminadas están implicadas en iniciar este proceso. Una de las respuestas puede deberse a que se genera el transporte de CAV1 junto a otras moléculas a través de vesículas xiii extracelulares (EVs), las cuales serían capaces de llevar a esta proteína como mensaje a células contiguas dentro del mismo microambiente tumoral o a células pertenecientes a tejidos distantes idóneos para la formación de un nicho pre-metastásico. En este contexto, se tienen registros de que vesículas de células de la línea celular MDA-MB-231 que contiene niveles endógenos elevados de CAV1 son capaces de promover migración en células de cáncer de mama humano carentes de CAV1, como MCF-7 de carácter no metastásico, pero se desconoce el contenido y su rol en este proceso. Estos antecedentes nos llevaron a plantear la hipótesis que: CAV1 en vesículas extracelulares aumenta el potencial migratorio e invasivo in vitro en células de cáncer de mama y metastásis in vivo en un modelo de xenotrasplante de cáncer de mama. Por consiguiente el objetivo principal de esta tesis fue evaluar la capacidad migratoria e invasora de células de cáncer de mama in vitro y el desarrollo de metástasis in vivo en un modelo de xenotrasplante mamario expuesto a EVs que contienen CAV1. Para abordar la hipótesis de trabajo se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Purificar y caracterizar vesículas extracelulares de las líneas celulares humanas de cáncer de mama metastásico y no metastásico; (2) Estudiar del efecto de EVs con CAV1 en las propiedades de migración e invasión in vitro en líneas celulares de cáncer de mama humano; (3) Evaluar el perfil proteómico de EVs de las sublíneas de cáncer de mama MDA-MB-231 WT, shC y shCAV1 y por último (4) Evaluar la capacidad metastásica en un modelo murino de xenotrasplante inoculado por la vía intraperitoneal con EVs que contienen CAV1. Los resultados mostraron la obtención de EVs enriquecidos en vesículas del tamaño de exosomas de <200 nm de diámetro a partir de medios condicionados de las líneas xiv celulares de cáncer de mama metástasico humano, MDA-MB-231 WT y MDA-MB-231(shC) que expresan niveles endógenos elevados de CAV1 y en células carentes de CAV1 como MDA-MB-231(shCAV1). Esta caracterización se complementó con imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión de las vesículas aisladas que mostró tamaños de vesículas de alrededor de 100 nm de diámetro en general y con el hallazgo de CAV1 en vesículas provenientes de MDA-MB-231 WT y shC y no así en vesículas de MDA-MB-231(shCAV1). Cabe añadir que se detectaron marcadores de EVs en todas las muestras mediante Western blot. Para evaluar el efecto biológico de vesículas que contienen o no CAV1 en células de cáncer de mama de carácter metastásico o no metastásico, se evaluaron parámetros de migración e invasión de estas células una vez expuestas a EVs. Los resultados indicaron que independiente del tipo celular utilizado como célula recipiente de EVs, aquellas células que son tratadas con EVs que contienen CAV1 aumentan su potencial migratorio e invasivo en comparación con células no tratadas o tratadas con EVs que no contienen CAV1. El análisis por espectrometría de masas reveló la presencia de proteínas específicas relacionadas con la adhesión celular, como Cyr61, tenascina (TNC) y S100A9 sólo en EVs de MDA-MB-231 WT y shC y no en EVs de MDA-MB-231 carentes de CAV1. De manera de evaluar el rol pro-metastásico de CAV1 en EVs en un modelo animal, se inyectaron estas vesículas junto con células de cáncer de mama metastásico o no metastásico por la vía intraperitoneal en un modelo murino denominado Carcinomatosis intraperitoneal. Los resultados indicaron que animales inoculados con células más EVs que contienen CAV1 presentaron un aumento en el número de células tumorales en el líquido ascítico hallado en la cavidad peritoneal junto con un aumento en la masa tumoral en bazo/páncreas y xv mesenterio en comparación con aquellos animales que no fueron tratados o tratados sólo con células o tratados con células más EVs que no contienen CAV1. Cabe recalcar que nuevamente el efecto de las EVs con CAV1 se dio independiente a que se inoculara junto con células de cáncer de mama que contenían o no CAV1 en el modelo murino. Esto nos lleva a sugerir que la importancia del efecto biológico de estas vesículas en la célula recipiente no sólo recae en la presencia de CAV1, sino que en el tipo de cargo molecular que puedan traer consigo CAV1 en estas vesículas / Breast cancer is the leading cause of cancer-related deaths in women. Although the incidence of this disease has decreased thanks to the implementation of screening mammograms and application of adjuvant therapies, this decrease does not seem to be enough, since the development of metastasis is still responsible for more than 90% of deaths associated with breast cancer, among other types of cancer. The progression of tumor cells towards a metastatic state implies the acquisition of characteristics, such as resistance to apoptosis, migration and high invasiveness, etc. Taking into account the latter, it has been described that many of these characteristics are enhanced by the expression of Caveolin-1 (CAV1), thereby implicating this membrane protein in the progression of cancer. Specifically in advanced breast cancer it has been observed that a high expression of CAV1 is associated with a shorter survival of the patient. On the other hand, in vitro studies conducted in our laboratory using the human metastatic breast cancer cell line, MDA-MB-231, have indicated that the silencing of CAV1 leads to a decrease in migration, polarization and focal adhesion turnover in comparison with control MDA-MB-231 cells. The question that arises is how CAV1 may promote migration, invasion and metastasis, considering that this process is very inefficient because less than 0.1% of the disseminated cells successfully establish a metastatic nodule. One possibility may be that CAV1 is present together with other molecules in extracellular vesicles (EVs), which serve as vectors to transport these components to adjacent cells within the same tumor microenvironment and/or to distant sites where they may condition xvii the pre-metastatic niche. Here, it should be noted that EVs from MDA-MB-231 cells reportedly promote migration of non-metastatic MCF-7 human breast cancer cells, but the precise content of these EVs and their role in this process were not defined. This led us to propose the following hypothesis: CAV1 in extracellular vesicles increases the migratory and invasive potential of breast cancer cells in vitro and in a breast cancer xenotransplant model in vivo. Therefore, the main goal of this thesis was to evaluate the migratory and invasive capacity in vitro and metastatic breast cancer cells in vivo in a xenotransplant model exposed to EVs containing CAV1. To address the working hypothesis, the following specific objectives were proposed: (1) To purify and characterize extracellular vesicles from human metastatic and non-metastatic breast cancer cell lines; (2) To study the effect of CAV1-containing EVs on migration and invasion in vitro of human breast cancer cell lines; (3) To evaluate the protein content by mass spectrometry of EVs from the three breast cancer sub lines MDA-MB-231 WT, shC and shCAV1; and finally (4) To evaluate the metastatic potential in vivo in a murine xenotransplant model inoculated intraperitoneally with EVs containing or not CAV1. The results showed that we were able to isolate an EV preparation enriched in vesicles of <200 nm in diameter, which is characteristic of exosomes. The EVs were purified from conditioned media of the human metastatic breast cancer cell lines, MDA-MB-231 and MDA-MB-231(shC), both expressing elevated endogenous levels of CAV1, as well as from cells lacking CAV1, such as MDA-MB-231(shCAV1) cells. This characterization was complemented by transmission electron microscopy of the isolated vesicles, which revealed that vesicles were around 100 nm in diameter. Finally, by western blotting, CAV1 was detected xviii together with exosome markers in vesicles from MDA-MB-231 WT and shC but not in MDA-MB-231(shCAV1) EVs. To evaluate the biological effects of vesicles with or without CAV1 on metastatic or non-metastatic breast cancer cells, migration and invasion parameters of these cells were evaluated following exposure to EVs. Regardless of the cell type that was used as a recipient cell, those cells that were treated with EVs containing CAV1 increased their migratory and invasive potential in comparison with cells that were either not treated or treated with EVs lacking CAV1. Analysis by mass spectrometry revealed the presence of specific proteins related to cell adhesion, such as Cyr61, tenascin (TNC) and S100A9 only in MDA-MB-231 WT and shC EVs but not in EVs from MDA-MB-231 lacking of CAV1. These results were confirmed by western blotting analysis. In order to evaluate the role of CAV1 in EVs in a murine carcinoma model, these vesicles were injected intraperitoneally together with metastatic or non-metastatic breast cancer cells into recipient mice. For animals inoculated with cells plus EVs containing CAV1, the number of tumor cells found in the ascitic fluid generated within the peritoneal cavity was dramatically increased. Also, a substantial increase in the tumor mass in spleen/pancreas and mesentery was observed in these mice compared to those animals that were either not treated, treated only with cells or treated with cells plus EVs that did not contain CAV1. It should be noted that again these effects of CAV1-containing EVs were observed regardless of whether the reciepient breast cancer cell type employed in these experiments expressed CAV1 or not. Thus, the biological effects of these vesicles in the recipient cell xix appear not to be attributable to CAV1 per se, but rather to depend on differences in the molecular cargos that are incorporated into EVs in the presence of CAV1

El cáncer es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo, y año a año aumentan las cifras de nuevos casos. Es un proceso complejo de proliferación celular no regulada, favorecido por la angiogénesis, que le brinda al tumor oxígeno, nutrientes y la posibilidad de eliminar productos catabólicos, lo que le permite crecer y eventualmente metastizar. Hace aproximadamente ocho décadas, se describió la inhibición de tumores malignos implantados en ratones, concomitantemente infectados con Trypanosoma cruzi y, en humanos, se observó el efecto antitumoral de la inoculación de extractos de este parásito. Sin embargo, no se identificó moléculas parasitarias responsables. Estudios más recientes mostraron el efecto antitumoral de Calreticulina de T.cruzi (TcCRT). Esta proteína es translocada desde el retículo endoplásmico a la zona de emergencia flagelar del parásito, donde inhibe al sistema del complemento, sirve de señal profagocítica, y media efectos antiangiogénicos que protegen al hospedero de agresiones neoplásicas. Calreticulina (CRT) de mamíferos tiene varias funciones intracelulares; como reguladora de la homeostasis del calcio, de la expresión de genes y del plegamiento de proteínas. Aunque, dependiendo del tipo tumoral, su sobreexpresión se ha asociado a mayor capacidad metastásica, su localización superficial, en general, es señal de daño, conduciendo a la fagocitosis de la célula y, en el caso de las células tumorales conduciría, además, a la activación de una respuesta inmune. Este proyecto propone que, al inhibir la angiogénesis, TcCRT recombinante (rTcCRT) genera un microambiente estresante para células tumorales. En respuesta, éstas translocan CRT murina (MmCRT) a la superficie celular. Por otra parte, rTcCRT inoculada podría unirse a la superficie de la células del tumor, generando señales profagocíticas, lo que mediaría una respuesta inmune, resultante en una mayor infiltración linfocitaria en el tejido tumoral, contribuyendo a un menor desarrollo de la neoplasia. Para abordar esta posibilidad se utilizó un modelo in vivo de adenocarcinoma mamario murino resistente a metotrexato (TA3-MTXR). Se obtuvo tejido tumoral de ratones, tratados o no con rTcCRT, se analizó la expresión del mRNA de MmCRT mediante qPCR y, por citometría de flujo, se analizó la cantidad de CRT en superficie y la infiltración linfocitaria. Se detectó una mayor cantidad de CRT en la superficie de las células del tejido tumoral de animales que recibieron rTcCRT, y una mayor infiltración de LTCD4+ y LTCD8+ en los mismos. Por otra parte, el tratamiento con rTcCRT no afectó los niveles de expresión del mRNA de MmCRT en el tejido tumoral. En síntesis, rTcCRT, modula la respuesta inmune, aumentando señales profagocíticas, la infiltración linfocitaria, conduciendo a la inhibición del crecimiento tumoral. / Cancer is a major cause of morbidity and mortality worldwide, and the number of new cases increases yearly. Cancer is a complex process of unregulated cell proliferation, favored by angiogenesis, which provides tumors with oxygen, nutrients and eliminates accumulation of catabolic products, allowing the tumor to grow and eventually metastasize. Eight decades ago, inhibition of malignant tumors implanted in mice concomitantly infected with Trypanosoma cruzi, was described and, on the other hand, antitumor effects of inoculated parasite extracts was observed in humans. However, it was not possible to identify the responsible parasite molecules. Recent studies showed the antitumor effect of T. cruzi calreticulin (TcCRT). This protein is translocated from the endoplasmic reticulum to the area of flagellum emergence in this parasite. There, it inhibits the complement system, serves as pro phagocytosis signal, and has antiangiogenic properties that protect the host from neoplastic aggressions. Calreticulin (CRT) from mammals has several intracellular functions; as a regulator of calcium homeostasis, gene expression and protein folding. Although, depending on tumor type, its overexpression has been associated with increased metastatic ability, in general, CRT surface location, is a sign of damage, leading to the phagocytosis of the cell by macrophages. In tumor cells, surface CRT would lead also, to activation of an immune response. In this project it is proposed that, by inhibiting angiogenesis, recombinant TcCRT (rTcCRT) generates a stressful microenvironment for tumor cells. In response, they translocate murine CRT (MmCRT) to the cell surface, as a sign of damage, or rTcCRT upon binding surface tumor cells, generates “eat me signals”, thus mediating an immune response, resulting in increased infiltration of lymphocytes in the tumor tissue, contributing to impaired development. To address this possibility, an in vivo murine methotrexate resistant (TA3-MTXR) mammary adenocarcinoma model was used. Tumor tissue was obtained from mice treated or untreated with rTcCRT, to analyze the mRNA expression of MmCRT by qPCR and, by flow cytometry, the expression of CRT surface and infiltrating lymphocytes was analyzed. The results show increased expression of CRT on the surface of tumor cells of animals receiving rTcCRT, and increased CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration in these treated tumors. Moreover, rTcCRT did not affect the levels of expression of messenger RNA of murine CRT in tumor tissues. In short, rTcCRT modulates the immune response, inducing “eat-me signals”, increased infiltrating lymphocytes, resulting inhibition of tumor growth.