Les cristaux d'urate monosodique qui précipitent dans les cavités articulaires sont l'agent étiologique de l'arthrite goutteuse. L'interaction directe entre ces cristaux et les neutrophiles humains, les leucocytes les plus abondants de la circulation sanguine, est essentielle pour le déclenchement de la crise de goutte aigüe. Par ailleurs, un élément important de cette pathologie est l'infiltration massive de neutrophiles dans l'articulation touchée, où ils peuvent représenter jusqu'à 95 % des cellules présentes dans le liquide synovial et où ils sont présents dès les étapes précoces de l'inflammation. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que la stimulation de neutrophiles humains avec des cristaux d'UMS mène à l'activation précoce des isoformes classiques des protéines kinases C. Cette activation des protéines kinases C joue un rôle central dans la signalisation en affectant d'une part les protéines tyrosines kinases, particulièrement la kinase Syk, et d'autre part les protéines tyrosines phosphatases, en particulier SHP-1. L'activation des protéines kinases C est nécessaire à la mise en place de plusieurs réponses fonctionnelles des neutrophiles, soit la sécrétion de facteurs chimiotactiques et la dégranulation. En outre, la stimulation de neutrophiles humains par les cristaux d'urate monosodique permet également l'activation de la protéine tyrosine phosphatase SHP-2 pouvant possiblement jouer un rôle positif dans la régulation des éléments de signalisation induits par cette stimulation.

Le tabagisme demeure le principal contributeur au développement de plusieurs maladies, tel que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). La MPOC est caractérisée par un déclin des fonctions pulmonaires progressif et peu réversible associé à une inflammation chronique, surtout neutrophilique. Alors que les neutrophiles sont cruciaux pour la défense de l'hôte, le dogme général stipule que l'inflammation pulmonaire induite par l'exposition à la fumée de cigarette est responsable de la destruction pulmonaire. Toutefois, cette thèse propose que les neutrophiles et les processus de l'immunité innée sont plutôt bénéfiques dans le maintien de l'homéostasie pulmonaire en contexte tabagique. Premièrement, nous avons évalué le rôle des neutrophiles dans la régulation de l'inflammation et l'homéostasie du surfactant chez des souris exposées à la fumée de cigarette. Puisque le tabagisme endommage le surfactant pulmonaire, nous avons investigué l'internalisation du surfactant par les neutrophiles. En incubant les cellules du lavage bronchoalvéolaire (LBA) avec du surfactant fluorescent ou en administrant du surfactant marqué par voie intranasale chez des souris exposées à la fumée de cigarette, nous avons observé que les neutrophiles internalisent le surfactant in vitro et in vivo. Afin d'explorer l'impact de l'absence des neutrophiles sur la réponse inflammatoire et sur l'homéostasie du surfactant en contexte tabagique, nous avons administré un anticorps qui déplète les neutrophiles (anti-Gr-1 ou anti-Ly6G) chez les souris. Nous avons constaté que les souris déplétées de leurs neutrophiles pendant l'exposition ont des niveaux plus élevés de cytokines inflammatoires et de protéines de surfactant dans le LBA. De plus, leurs macrophages alvéolaires expriment davantage d'ARNm de Mmp12 qui code pour une métalloprotéinase liée à l'emphysème. Nos résultats démontrent que les neutrophiles participent à la clairance du surfactant et semblent jouer un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire en contexte tabagique. Notre deuxième objectif visait à investiguer l'impact du statut tabagique sur l'efficacité d'un traitement biologique et l'adaptation pulmonaire à la fumée de cigarette. Alors que l'impact du statut tabagique n'est pas toujours considéré dans les études cliniques en MPOC, quelques études ont observé que l'efficacité des traitements biologiques diffère entre les fumeurs actifs et les ex-fumeurs. En utilisant un modèle d'exposition à la fumée de cigarette répétée, nous avons démontré qu'il existe une adaptation pulmonaire à la fumée de cigarette, menant à une diminution de la neutrophilie et des niveaux de cytokines dans le LBA. Toutefois, l'administration d'un anticorps neutralisant l'IL-1α pendant l'exposition interfère avec cette adaptation et décale la réponse inflammatoire suite à une cessation tabagique (recrudescence de la neutrophilie, augmentation des niveaux de cytokines et augmentation de l'expression de Mmp12). À l'inverse, l'administration du même traitement pendant la cessation tabagique améliore ces paramètres. En tout, ces données indiquent que l'inhibition des voies centrales à la réponse inflammatoire, tel qu'avec l'anti-IL-1α, pendant l'exposition interfère avec l'adaptation alors que le traitement pendant la cessation tabagique encourage la résolution et le retour à l'homéostasie. Finalement, nous voulions atténuer l'inflammation pulmonaire sans interférer avec la défense de l'hôte via l'administration d'un peptide antimicrobien en contexte tabagique. Puisque l'inhibition de la réponse inflammatoire peut augmenter la susceptibilité aux infections chez les patients MPOC, nous avons testé l'efficacité du peptide antimicrobien human β-defensin 2 (hBD-2) à moduler la réponse inflammatoire sans interférer avec la clairance bactérienne en contexte tabagique. Chez les souris exposées à la fumée de cigarette, l'administration de l'hBD-2 a diminué la neutrophilie et la signalisation pro-inflammatoire pulmonaire (analyse biopuce). De plus, dans un modèle d'exacerbation où des souris exposées à la fumée de cigarette ont été infectées avec une bactérie, on note une charge bactérienne moins élevée chez les souris traitées avec l'hBD-2 alors que l'infiltration des neutrophiles est aussi diminuée. Ces données suggèrent que l'hBD-2 pourrait être étudié chez les fumeurs et les patients MPOC puisqu'elle module la neutrophilie tout en supportant la défense de l'hôte. En conclusion, les résultats présentés suggèrent fortement que les neutrophiles et l'immunité innée jouent un rôle complexe, mais crucial, dans le maintien de l'homéostasie pulmonaire en contexte tabagique. Ainsi, dans le développement de thérapie pour la MPOC qui vise la neutrophilie, il faut prendre en considération l'importance des fonctions homéostatiques de l'immunité innée afin de préserver les processus de la défense de l'hôte. / Cigarette smoking remains the major contributor to pulmonary and systemic disease burden worldwide. In particular, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is strongly linked to tobacco smoking and is marked by largely irreversible lung tissue damage and neutrophilic pulmonary inflammation. The general dogma in the field is that inflammatory mediators, reactive oxygen species and proteases secreted by neutrophils during chronic inflammation are at the root of cigarette smoke-induced lung pathology. This thesis argues that neutrophils and the innate immune response play a beneficial role in the maintenance of pulmonary homeostasis during cigarette smoke exposure. Firstly, we sought to evaluate the contribution of neutrophils to pulmonary surfactant and inflammatory homeostasis during cigarette smoke exposure. As phagocytes, we wanted to assess the ability of neutrophils to clear surfactant damaged during cigarette smoke exposure. We treated immune cells from the bronchoalveolar lavage (BAL) fluorescently labeled surfactant or intranasally administered the labeled surfactant in mice and found that neutrophils actively internalize labeled surfactant both in vitro and in vivo in cigarette smoke-exposed mice. Next, we explored the effects of neutrophil depletion on an acute 4-day cigarette smoke exposure model via neutrophil-depleting antibody administration (anti-Ly6G or anti-Gr-1). Neutrophil depletion during cigarette smoking led to dramatically increased pro-inflammatory cytokine and surfactant protein levels in the BAL fluid (BALF). Furthermore, alveolar macrophages expressed elevated levels of Mmp12 mRNA, encoding for a metalloproteinase tightly linked to emphysema. Taken together, these data indicate that neutrophils actively internalize surfactant and seem to play a beneficial role in limiting/resolving the inflammatory response to cigarette smoke exposure. Our second objective was to investigate the impact of treatment timing and smoking status on treatment efficacy in the context of cigarette smoke exposure. Though clinical trials of COPD patients often fail to take smoking status into consideration, some studies have found that the efficacy of biologic treatments and cytokine inhibitors differs greatly based on patient smoking status, favouring either active smokers or ex-smokers. Firstly, we found that repeated exposure to cigarette smoke, where mice were exposed for 2 weeks followed by a 1-week smoking cessation period and then acutely re-exposed for 2 days, led to reduced BAL neutrophilia and cytokine levels compared to mice exposed only for 2 days. Interestingly, we found that administration of anti-IL-1α antibody during cigarette smoke exposure led to delayed inflammation (rebound neutrophilia and increased cytokine levels) as well as elevated Mmp12 expression, while treatment with the same antibody during the smoking cessation period improved these outcomes. These data suggest that neutrophilic inflammation is uncoupled from destructive processes in the lungs and that disruption of the innate immune response via anti-IL-1α during cigarette smoking interferes with pulmonary adaptation; conversely, treatment during smoking cessation effectively hastened inflammatory resolution. Thirdly, we sought to mitigate pulmonary inflammation while supporting host defense during cigarette smoking via treatment with an antimicrobial peptide. Since treatments that mitigate inflammation without interfering with normal host defense would be of great value in COPD, we assessed the effect of the antimicrobial peptide human β-defensin 2 (hBD-2) on the pulmonary response to cigarette smoke exposure. We found that in both acute and chronic mouse models, hBD-2 treatment significantly reduced pulmonary neutrophilia and normalized the expression of several pro-inflammatory signaling pathways in the lungs normally upregulated by cigarette smoke exposure, such as leukocyte migration, as assessed via microarray. To confirm that this reduction in neutrophil count was not associated with increased susceptibility to infection, chronically exposed mice treated with hBD-2 were infected with non-typeable Haemophilus influenzae (NTHi). We found that despite a dramatic reduction in neutrophilia, cigarette smoke-exposed mice administered hBD-2 had reduced bacterial load in the lungs compared to vehicle-treated mice, making it an interesting candidate for future clinical research. In all, the work presented herein strongly suggests that neutrophils and innate immune processes play a crucial role in the maintenance of pulmonary homeostasis during cigarette smoke exposure and that destructive processes in the lungs seem to be uncoupled from pulmonary neutrophilia. Therefore, the development of treatments that specifically target neutrophils should consider the importance of innate immune competence in pulmonary homeostasis and host defense.

Les neutrophiles représentent une composante fondamentale du système immunitaire. En effet, il est bien connu qu'ils sont essentiels à la défense de l'organisme contre les agressions microbiennes. En plus de leurs fonctions anti-microbiennes classiques, les neutrophiles, via la sécrétion de cytokines (incluant les chimiokines), jouent un rôle prépondérant dans l'initiation et la modulation de la réponse immunitaire. Lors d'une infection ou d'une blessure, les neutrophiles agissent à titre de premier répondant et migrent rapidement au site de l'aggression. La production rapide de cytokines par les neutrophiles permet le recrutement additionnel de neutrophiles au site inflammatoire et celui d'autres populations leucocytaires, tout en modulant les fonctions de ces dernières. La génération de cytokines par les neutrophiles est induite par une vaste gamme de stimuli: agonistes d'origine microbienne, facteurs chimiotactiques, cytokines, chimiokines et facteurs de croissance. Ces signaux inflammatoires induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation menant ultimement à l'activation de facteurs transcriptionnels. L'expression des gènes de cytokines inflammatoires doit être finement régulée afin qu'il y ait une production adéquate de ces médiateurs. Elle repose, en grande partie, sur le recrutement de facteurs transcriptionnels capables de se lier à des séquencescibles sur les promoteurs de ces gènes.Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l'identification des facteurs de transcription impliqués, ainsi que des sentiers de signalisation en amont, dans l'expression de gènes encodant des cytokines chez le neutrophile humain. Dans le premier chapitre de la section résultats, nous avons montré que l'expression génique des cytokines dépend fortement de l'activation du facteur de transcription NF-[kappa]B. Celui-ci contrôle l'expression inductible de tous les gènes étudiés. De plus, nous avons montré que la génération de ces cytokines chez les neutrophiles dépend fortement de l'activation des voies p38 MAP kinases (aux niveaux transcriptionnel et traductionnel) et MEK/ERK (au niveau traductionnel seulement). Dans le deuxième chapitre, nous avons étudié l'expression et la localisation des différents facteurs de transcription de la famille C/EBP, de même que l'activation de C/EBP[bêta] via sa phosphorylation en Thr 235 chez les neutrophiles humains. Grâce à la surexpression d'un répresseur des C/EBP (A-C/EBP2N3T) chez les cellules PLB-985 granulocytiques, nous avons montré l'importance de la famille de C/EBP dans la production de MIP-1[alpha], de MIP-1[bêta] et d'IL-8 chez les neutrophiles humains.Les facteurs C/EBP ne semblent toutefois pas impliqués dans la production de TNF-[alpha] par ces cellules. La surexpression d'un mutant de C/EBP[bêta] (C/EBP[bêta] T235A) chez ces mêmes cellules nous a par ailleurs permis de déterminer que la phosphorylation de cet acide aminé est essentielle à la production des chimiokines MIP-1[alpha], MIP-1[bêta] et IL-8. Nous démontrons enfin une association constitutive de C/EBP[bêta] et de C/EBP[epsilon] avec le promoteur de l'IL-8 chez les neutrophiles primaires humains. Un des éléments déclencheurs de la transcription de ce gène serait probablement l'induction de la phosphorylation de C/EBP[bêta] sur les promoteurs géniques. Enfin, dans le troisième chapitre de la section résultats, nous explorons le rôle de la MAPK p38 dans la production de cytokines chez les neutrophiles. Nous y identifions quelques-uns de ses substrats impliqués dans la transcription et la traduction de cytokines inflammatoires. Ainsi, nous avons determiné que la MAPK p38 participe à l'activation des facteurs de transcription C/EBP[bêta] et CREB, probablement via l'activation des kinases MSK-1 et RSK. Nous avons également établi l'impact de la phosphorylation de la Ser 133 de CREB sur la production de cytokines chez les neutrophiles humains. Finalement, nous avons documenté l'activation de la kinase MNK1 par la MAPK p38, et son rôle dans la régulation traductionnelle des cytokines. L'ensemble de ces travaux a permis d'identifier des molécules-clés dans la génération de cytokines, plus particulièrement de chimiokines, chez le neutrophile humain. Nos travaux ont donc contribué de manière substantielle à nos connaissances des mécanismes transcriptionnels et traductionnels gouvernant l'expression de gènes précoces chez le neutrophile. Nos résultats permettront en outre l'identification de cibles thérapeutiques potentielles qui pourraient servir à atténuer l'inflammation chronique observée dans de nombreuses pathologies où les neutrophiles prédominent.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'implication des polynucléaires neutrophiles (PN) dans l'hémostase n'est pas un concept nouveau, mais requière encore beaucoup d'éclaircissements. Des données attribuent à ces cellules à la fois une capacité à favoriser (voire à déclencher) les mécanismes et une capacité à limiter voire éliminer le caillot de fibrine. Pour expliquer leur implication, une contribution des enzymes granulaires, et essentiellement la cathepsine G (Cath G) et l'élastase (HNE), est fréquemment citée. L'objet de ces travaux est d'étudier chez des sujets sains l'impact des PN humains et des 2 enzymes granulocytaires (Cath G et HNE) sur la coagulation, à l'aide de tests globaux : thromboélastométrie rotative et test de génération de thrombine. Le potentiel procoagulant des PN a aussi été étudié en thrombinographie chez des patients atteints de syndrome myéloprolifératif (SMP) JAK2V617F positif. Dans les systèmes choisis, les PN font preuve d'une activité procoagulante claire, permettant notamment une réduction systématique du temps de coagulation et une augmentation du travail thrombinique total. Cette activité procoagulante est proportionnelle à la concentration en PN et est exacerbée après stimulation préalable par le fMLP, mais elle n'est pas liée à une activité facteur tissulaire. La Cath G et l'HNE permettent également toutes deux une réduction du temps de coagulation, mais elles font preuve à la fois d'effets procoagulants (par inactivation des inhibiteurs comme le TFPI) et anticoagulants (par inactivation du facteur V ou par dégradation de la (du) fibrin(ogèn)e). Enfin, les données de ce travail ne mettent pas en évidence une hypercoagulabilité liée aux PN dans le contexte de SMP. / Polymorphonuclear neutrophils (PMN) are the most abundant nucleated cells in blood. Their involvement in haemostasis – in particular in coagulation and clot formation – is not a new concept, but is not yet fully understood. Many data from the literature indicate that these cells can enhance (even trigger) coagulation, whereas others indicate it can impair fibrin formation and facilitate clot elimination. Among the hypotheses explaining this involvement, attention has focused on PMN granules enzymes, in particular, Cathepsin G (Cath G) and elastase (HNE). We first aim at studying in healthy subjects the impact of PMN as well as Cath G and HNE on coagulation by use of global tests: rotative thromboelastometry (ROTEM®) and thrombin generation test (CAT®). Second, procoagulant potential of PMN is investigated using CAT® in patients affected by myeloproliferative disorders (MPD), with presence of JAK2V617F mutation. Under our conditions, PMN show an unambiguous procoagulant activity, inducing systematically a decrease in clotting time, along with an increase in total thrombin work. This activity is proportional with PMN concentration; fMLP-induced PMN stimulation enhances also it, but this is not related to tissue factor activity. Both Cath G and HNE induce a decrease in clotting time, but support procoagulant (by inactivation of inhibitors such as TFPI) as well as anticoagulant activity (by inactivation of factor V or fibrin(ogen) degradation). At last, data obtained don't show MPD-associated hypercoagulability which can be attributed to PMN.

La déstabilisation de la plaque d’athérosclérose reste de nos jours un problème majeur, malgré les progrès récents dans sa compréhension. Les neutrophiles sont des acteurs puissants de l’immunité innée capables d’altérer les plaques. Un chimio-attractant majeur des neutrophiles, le leucotriène B4, pourrait être un des contributeurs potentiels de la déstabilisation des plaques en particulier dans l’endotoxémie, elle-même associée aux accidents cardiovasculaires. L’objectif de ce travail a été de définir le rôle du leucotriène B4 dans l’attraction des neutrophiles dans la plaque au cours de l’endotoxémie et de déterminer si les neutrophiles peuvent basculer l’équilibre qui maintient les plaques stables. Nous avons montré que le recrutement des neutrophiles médié par le leucotriène B4 a un impact délétère sur la stabilité des plaques au cours de l’endotoxémie en favorisant l’apoptose et la dégradation de fibres matricielles. En conclusion, cette étude ouvre la voie vers de nouvelles approches thérapeutiques visant à cibler l’axe leucotriène-neutrophiles dans la maladie athérosclérotique. / Atherosclerotic plaque destabilisation remains an important issue, in spite of the recent advances in its comprehension. Neutrophils are powerful innate immune actors capable of altering plaques. In this context, the leukotriene B4, one of the main chemoattractants of neutrophils, has been proposed as a potential contributor to plaque destabilisation. A particular context in which these two actors are closely linked is endotoxemia, itself associated with plaque destabilisation This work was aimed at determining whether leukotriene B4 plays a role in the chemoattraction of neutrophils in plaques during endotoxemia and at assessing whether neutrophils can tip the balance which maintains plaques stable. We have herein evidenced that the recruitment of neutrophils mediated by leukotriene B4 has a deleterious impact upon plaque stability during endotoxemia by promoting apoptosis and degrading matrix fibres. In conclusion, this study paves the way to novel therapeutic approaches aimed at targeting the axis leukotriene-neutrophil in atherosclerotic disease.

La drépanocytose est une maladie génétique du globule rouge, due à une mutation ponctuelle du gène β de la chaine de l’hémoglobine. Néanmoins, la physiopathologie de la maladie va bien au-delà des anomalies érythrocytaires, avec notamment un dysfonctionnement vasculaire et leucocytaire qui font toute la complexité de la maladie. Au cours de ce travail, nous avons étudié le rôle de l’endothéline-1, peptide vaso-constricteur impliqué de nombreuses pathologies notamment vasculaires, sur l’activation et l’adhérence des polynucléaires neutrophiles dans la drépanocytose. Nous avons travaillé à la fois sur un modèle murin de drépanocytose (les souris SAD) et sur des échantillons sanguins de patients. Sur le modèle animal, nous avons réalisé des expériences de microscopie intravitale, permettant de tester in vivo l’effet des antagonistes des récepteurs ETA et ETB à l’endothéline sur le recrutement des polynucléaires neutrophiles. Sur les échantillons de sang de patients drépanocytaires, nous avons testé in vitro l’adhérence en flux des neutrophiles à l’endothélium vasculaire en réponse au blocage des récepteurs ETA et ETB. Nous avons enfin étudié l’expression des récepteurs ETA et ETB à la surface des neutrophiles et les voies de signalisations découlant de leur activation.Sur le modèle de souris drépanocytaire, l’inhibition des récepteurs ETA, mais surtout ETB permet de limiter le recrutement leucocytaire important provoqué par un stimulus inflammatoire. Ces résultats confirment le rôle d’ETA et celui, plus inattendu, d’ETB dans toutes les étapes d’adhérence des polynucléaires neutrophiles et dans leur transmigration tissulaire en contexte drépanocytaire.Sur des échantillons humains, nous avons confirmé le rôle crucial d’ETB dans l’adhérence des polynucléaires neutrophiles. Nous avons également confirmé la présence de récepteurs ETA et ETB à la surface des neutrophiles. Le récepteur ETB active une voie de signalisation responsable d’une mobilisation du calcium intra cytoplasmique, mais indépendante de l’activation de la phospho-inositide 3-kinase. Enfin, nous avons montré la capacité de ces cellules à synthétiser et excréter elles-mêmes de l’endothéline-1, pérennisant ainsi probablement la réponse inflammatoire et le recrutement leucocytaire. En conclusion, notre travail a permis de mettre en évidence le rôle important du récepteur ETB dans le recrutement des polynucléaires neutrophiles dans la drépanocytose. Ces données suggèrent que les antagonistes des récepteurs à l’endothéline pourraient être bénéfiques en prévention des phénomènes vaso-occlusifs chez les patients drépanocytaires. / Sickle cell disease is a genetic disorder affecting red blood cells, due to a point mutation in the β chain of the hemoglobin gene. However, the pathophysiology of the disease goes well beyond the erythrocyte abnormalities, including vascular and white blood cell dysfunctions that contribute to the complexity of the disease. In this project, we investigated the role of endothelin-1, a powerful vasoconstrictor peptide involved in many vascular diseases, on activation and adhesion of neutrophil in sickle cell disease.We worked on both a mouse model of sickle cell disease (SAD mice) and blood samples from patients. In mice, we performed intravital microscopy experiments, to test the in vivo effect of endothelin receptor antagonists ETA and ETB on neutrophils recruitment. On blood samples from patients with sickle cell disease, we tested in vitro adhesion of neutrophils to vascular endothelium in response to the blocking of ETA and ETB receptors. Finally, we studied the expression of ETA and ETB receptors on neutrophils and the signaling pathways resulting in their activation.In our mouse model of sickle cell disease, the inhibition of both endothelin receptors ETA and ETB limits the major leukocyte recruitment caused by an inflammatory stimulus. These results confirm the role of ETA and the more unexpected important role of ETB in all stages of neutrophil adhesion and transmigration in sickle cell context.On human samples, we demonstrated the crucial role of ETB in neutrophils adhesion. We also confirmed the expression of ETA and ETB receptors on neutrophils. ETB receptor activates a signaling pathway responsible for intracytoplasmic calcium mobilization, but not involving the activation of phosphoinositide 3-kinase. Finally, we have shown the ability of neutrophils to synthesize and secrete endothelin-1, which can contribute to sustain the inflammatory stimulation and increased leukocyte recruitment.In conclusion, our work has highlighted the important role of ETB receptor in the recruitment of neutrophils in sickle cell disease. These data suggest that the antagonists of endothelin could be beneficial in prevention of vaso-occlusive events in sickle cell patients.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2006. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 mars 2007). Bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 mars 2007). Bibliogr.