Previously, we have demonstrated that nicotinamide (NAm), a neuroprotective soluble B-group vitamin, improves recovery of function following traumatic brain injury (TBI). However, no prior studies have examined whether NAm is beneficial following continuous infusions over seven days post-TBI. The purpose of this study was to investigate the preclinical efficacy of NAm treatment as it might be delivered clinically; over several days by slow infusion. Rats were prepared with either unilateral controlled cortical impact (CCI) injuries over the somatosensory cortex (SMC) or sham procedures and divided into three groups: CCI-NAm, CCI-vehicle, and sham. Thirty minutes following CCI, Alzet osmotic mini-pumps were implanted subcutaneously. NAm was delivered at a rate of 50 mg/kg/day for seven days immediately post-CCI. On day seven following injury, the pumps were removed and blood draws were collected for serum NAm and nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) analyses. Starting on day two post-CCI, animals were tested on a battery of sensorimotor tests (bilateral tactile adhesive removal, locomotor placing, and limb-use asymmetry). Statistical analyses of the tactile removal and locomotor placing data revealed that continuous administration of NAm significantly reduced the initial magnitude of the injury deficit and improved overall recovery compared to the vehicle-treated animals. NAm treatment also significantly decreased limb-use asymmetry compared to vehicle-treated animals. Continuous infusion of NAm resulted in a significant serum elevation in NAm, but not NAD+, as well as significantly attenuated cortex tissue loss than un-treated animals. The NAm-treated group also had the lowest number of glial fibrillary acidic protein (GFAP) positive cells. No detrimental effects were seen following continuous infusion. The present results suggest that NAm delivered via a clinically relevant therapeutic regimen may truncate behavioral damage following TBI. Thus our results offer strong support for translation into the clinical population.

AN ABSTRACT OF THE THESIS OF AIDAN CHRISTIE SMITH, for the MASTER OF ARTS degree in PSYCHOLOGY, presented on OCTOBER 27th, 2017, at Southern Illinois University Carbondale. TITLE: EFFECTS OF NICOTINAMIDE ON MICROGLIAL RESPONSE IN JUVENILE RATS AFTER CONTROLLED CORTICAL IMPACT MAJOR PROFESSOR: Dr. Michael J. Hylin Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of death, cognitive and behavioral disability in children in industrialized nations. Preclinical trials of nicotinamide (NAM) treatment provide neuroprotection and reduced inflammatory responses in adult models of TBI. The primary goal of this study was to address the neuroprotective effects of NAM in the developing brain, specifically, the microglial response that occurs following injury. Animals received a bilateral craniotomy with a single cortical contusion injury over the parietal lobe and were treated with either 500mg/kg of nicotinamide or 0.9% saline via intraperitoneal injection. Animals received three injections, 15 minutes, 24 hours, and 48 hours after injury, and were sacrificed at 4 time points, 3 hours, 72 hours, 1 week, or 1 month following injury. Brains were then used for histological assessment for microglial activity. The results show that NAM attenuates the activation of microglia after CCI. Over the course of time, saline treated animals had a marked increase in microglia at 72 hours and remained elevated after 1 week. In NAM treated animals however, there was no significant increase in the number of microglia at any time point. It is suggested here that NAM has a great effect on the inflammatory response. Further studies are needed to examine NAM’s effects on behavior and functional recovery.

Thesis: Ph. D., Massachusetts Institute of Technology, Department of Chemistry, 1980 / Vita. / Includes bibliographical references. / by Victor Manuel Rios-Mercadillo. / Ph. D. / Ph. D. Massachusetts Institute of Technology, Department of Chemistry

The levels of total nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), and their redox states were determined as the function of growth in S. cerevisiae. Cells growing in a medium containing 0.8% glucose exhibit two phases of exponential growth, utilizing glucose and ethanol, respectively. The NAD pool is 50% reduced during both stages of growth while the NADP pool is 67% reduced in glucose growth and 48% reduced in ethanol growth. The NAD/NADP ratio is constant during growth on glucose and a two-fold increase in the NAD/NADP ratio occurs upon exhaustion of glucose. The increased ratio is maintained during growth on ethanol. This alteration in the regulation of the relative levels of NAD and NADP may be due to a change in the regulation of NAD kinase and/or NADP phosphatase activities. These changes may be related to the redox state of the NADP pool.

Nous avons montré, aussi bien in vitro que in vivo, l’impossibilité de la reprogrammation directe des macrophages en cellules béta, et ce en en utilisant les facteurs publiés dans la littérature actuelle comme étant déterminants et importants pour la différenciation en cellules béta du pancréas. Les macrophages préalablement transduits par des virus, ont été cultivés dans des conditions spécifiques visant à mimer le microenvironnement pancréatique, ou injectés dans le pancréas des souris afin de faciliter la reprogrammation. De plus, l’échec dans la reprogrammation des lignages, la culture des macrophages en présence de composés régulant la différentiation des cellules béta induit la formation d’organoïdes. Ces “clusters” de cellules montrent une forte inhibition du potentiel prolifératif comme a été démontré par l’arrêt du cycle cellulaire. Le criblage de différents composés a permis l’identification de la nicotinamide (vitamine B3) comme étant la molécule responsable de l’inhibition de la progression du cycle cellulaire. Les analyses transcriptomiques ont montré l’augmentation de l’expression des inhibiteurs du cycle cellulaire ainsi que la réduction des niveaux d’expression des régulateurs positifs, confirmant que la nicotinamide régule négativement le cycle cellulaire. De manière intéressante, nous avons montré que ce phénomène est réversible, étant donné que le retrait de la nicotinamide résulte en un réengagement dans le cycle cellulaire et la formation de colonies. Ces résultats indiquent le possible rôle de la nicotinamide dans la régulation du potentiel prolifératif des macrophages Maf-DKO. / We have shown here that direct reprogramming of macrophages into beta cells was not possible, both in vitro and in vivo, using pancreatic fate determinants already reported in current literature. Transduced macrophages were cultured in specific conditions or injected into the murine pancreas, aiming to mimic the pancreatic microenvironment as a reprogramming inducer. Besides this failure in lineage reprogramming, culturing macrophages with compounds regulating beta cell differentiation induced the formation of organoids. These cell clusters showed strong inhibition of the proliferative potential, as demonstrated by the arrest of their cell cycle. Screening of the different compounds, allowed the identification of nicotinamide as the responsible molecule for the inhibition of cell cycle progression. Transcriptomic analysis depicted an increased expression of cell cycle inhibitors along with reduced levels of positive regulators, confirming the nicotinamide-induced negative regulation of cell cycle. Most importantly, we have demonstrated that this phenomenon was a reversible proliferation inhibition, since withdrawal of nicotinamide resulted in cell cycle re-entry and rescue of the colony formation phenotype. Together these results indicate a possible role of nicotinamide (Vitamin B3) in the regulation the Maf-DKO macrophages proliferative ability. Further investigations are needed to assess a role for Nicotinamide in controlling the biology of wild-type macrophages, and determine the molecular pathways controlling this transient phenomenon.

A protein exhibiting NADH oxidase and NADH peroxidase activity has been isolated from Lactobacillus casei in high purity. Evidence obtained through gel filtration, electrophoresis, and electrofocusing indicates that the two activities are characteristic of a single tetrameric protein with an approximate molecular weight of 240,000.

Les maladies neurodégénératives se caractérisent par une déconnexion synaptique et une dégénérescence des axones (DA) précoces, menant à la mort spécifique d’une population neuronale. Les niveaux intracellulaires de NAD+, co-facteur essentiel dans le maintien de l’intégrité axonale, sont fortement diminués lors de ces pathologies. L’augmentation des taux de NAD+ est ainsi une stratégie thérapeutique dans la prévention de ces maladies. La capacité du nicotinamide riboside (NR) à retarder la DA dans le système nerveux périphérique (SNP) ainsi que la récente mise en évidence d'une conversion extracellulaire du NAD+ en NR dans des lignées cellulaires et dans le SNP soulignent l'intérêt de ce précurseur du NAD+. Mon projet de thèse repose sur la caractérisation des effets du NAD+ et du NR lors de la DA dans des neurones du système nerveux central (SNC). A partir d'un modèle d'excitotoxicité mis au point en dispositifs microfluidiques, nous montrons pour la première fois que le NR protège de la DA dans des neurones corticaux de manière plus efficace que le NAD+. Cet effet différentiel a également été validé dans un modèle ischémique in vivo. De manière surprenante, lors d'une neurodégénérescence induite par une déplétion aigüe en NAD+, un effet protecteur total à la fois du NAD+ et du NR a été mis en évidence. L'analyse de la voie de conversion extracellulaire a ainsi révélée une adaptation du métabolisme du NAD+ et de sa conversion en NR en fonction du paradigme neurotoxique. En conclusion, ce travail démontre un fort effet protecteur du NR dans le SNC et ouvre de nouvelles voies thérapeutiques dans la prévention des processus neurodégénératifs. / Synaptic and axonal degeneration (AxD) are major events in neurodegenerative diseases. Levels of NAD+, an important coenzyme for axonal integrity, are strongly reduced in different degeneration models so enhancing cellular NAD+ is one of the numerous therapeutic strategies against neuronal pathologies. Nicotinamide riboside (NR) is a good NAD+ precursor as it has already been shown to delay AxD in peripheral nervous system (PNS) and extracellular NAD+ conversion to NR was previously described in cell lines and in PNS. During my thesis project, we analyzed the role of NR metabolism to prevent degeneration processes in cortical neurons. Using an excitotoxicity model developed in microfluidic devices, we showed for the first time that both NAD+ and NR delay AxD in cortical neurons, with a more potent effect for NR. We confirm this differential effect in an in vivo ischemic model. Moreover, NR effect is mainly restricted to the axonal compartment and intracellular NAD+ depletion is reverted after NR application, suggesting that axonal integrity is totally dependent on NAD+ local metabolism. Furthermore, in a complete NAD+ depletion paradigm, NAD+ and NR have surprisingly the same strong effect, protecting equally neuronal death and AxD. Examination of the extracellular pathway suggest that NAD+ conversion to NR is limited in excitotoxicity but effective in the NAD+ depletion model. These results reveal that NR and NAD+ metabolism depend on the neurotoxic paradigm. Our results demonstrate that NR has a strong and local neuroprotective effect on AxD in several neurotoxic processes. These findings open new therapeutic strategies to prevent neurodegenerative diseases.

Dans le cadre de l’étude de la régulation de la synthèse de la cytokine pro-inflammatoire TNF-alpha dans les cellules myéloïdes stimulées aux lipopolysaccharides, nous avons pu mettre en évidence que l’effet anti-inflammatoire du nicotinamide (NAM) sur la production de cette cytokine s’opère au niveau de l’état de phosphorylation de la MAPK p38. Une diminution de la concentration intracellulaire de NAD entraine également une inhibition de la phosphorylation de la MAPK p38 en réponse aux lipopolysaccharides. De plus, une étude pharmacologique plus ciblée suggère que les sirtuines, une famille d’enzymes consommatrices de NAD, sont impliquées dans cette régulation. Nos résultats indiquent que ce processus s’effectuerait par un contrôle de l’expression des gènes mkp-1 et pac-1 codant pour des « dual-phosphatases » modulant l’état de phosphorylation des MAPKs. Enfin, nos données indiquent que l’effet anti-inflammatoire du NAM s’opère aussi par une régulation de l’efficacité traductionnelle du messager du TNF-alpha impliquant un raccourcissement de la queue poly(A) du messager. En conclusion, l’ensemble de nos données montre une complexité importante dans la régulation de la production de TNF-alpha dans les cellules myéloïdes par des enzymes consommatrices de NAD, dont les sirtuines. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les recherches menées au sein de notre laboratoire ont montré que la Nicotinamide Phosphoribosyltransférase (Nampt) est surexprimée lors de l’activation de plusieurs cellules immunes. Cette surexpression est surprenante si l’on considère que cette enzyme intervient dans le métabolisme de base de toute cellule (immune et non immune) en participant à la synthèse du cofacteur NAD. Au cours de ce travail, nous avons essayé de comprendre quelle est la contribution de cette enzyme aux fonctions immunes. <p>Puisque les souris génétiquement invalidées pour le gène de la Nampt meurent à un stade embryonnaire précoce nous avons invalidé ce gène de façon conditionnelle uniquement dans les lymphocytes T et B. Nos résultats suggèrent que la délétion de la Nampt dans les cellules T et B compromet leur survie. <p>De plus, nous avons testé l’effet d’un inhibiteur spécifique de la Nampt sur la sécrétion de TNF par des macrophages et des cellules dendritiques. Nos résultats montrent que l’inhibition de la Nampt s’accompagne d’une diminution du taux de NAD intracellulaire et, parallèlement, d’une réduction de la quantité de TNF&61537; synthétisé. De même, nous avons montré qu’en augmentant le taux de NAD cellulaire il est possible d’augmenter la quantité de TNF&61537; produit, ce qui laisse supposer que la capacité de la cellule à synthétiser du TNF&61537; serait directement liée à son contenu en NAD. Cette régulation semble impliquer une étape post-transcriptionnelle puisque l’ARNm du TNF&61537; ne paraît pas être affecté par ces traitements. Puisque le taux de NAD peut influencer directement l’activité d’enzymes NAD-dépendantes, et en particulier l’activité des enzymes de la famille des sirtuines, nous nous sommes demandés si une sirtuine était impliquée dans la synthèse du TNF&61537; Une approche pharmacologique et une approche génétique nous ont permis de montrer que SIRT6 serait capable d’augmenter la production de TNF&61537; à une étape traductionnelle. Cette conclusion semble être confirmée par le fait que des cellules dendritiques dérivées de souris invalidées pour le gène SIRT6 produisent moins de TNF&61537; en réponse à un stimulus microbien par rapport à des cellules sauvages. <p>En conclusion nos observations suggèrent la Nampt, en affectant le niveau intracellulaire de NAD, joue un rôle important dans le contrôle de la production du TNF&61537; par les cellules de système immunitaire<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Age-related increases in arterial stiffness are mediated in part by mitochondrial dysfunction. Sirtuin 3 (SIRT3) is a mitochondrial NAD+-dependent deacetylase that regulates mitochondrial function. SIRT3 deficiency contributes to physiological dysfunction in a variety of pathological conditions. Here, we tested the hypothesis that age-associated arterial stiffness, assessed by aortic pulse wave velocity (PWV), would be accompanied with decreased renal and aortic SIRT3 expression and activity due to decreased NAD+ levels. We further tested whether boosting NAD+ concentration with nicotinamide riboside (NR), a NAD+ precursor, for 6 months would reverse the effects of aging. Old (~26 mo, n = 9) C57BL/6 male mice had higher PWV vs. young (6 mo, n = 10) (448 ± 14 vs 382 ± 13, p < 0.005), which was associated with reduced arterial SIRT3 protein (0.365 ± 0.088 AU’s vs 1.000 ± 0.000); p < 0.05). Furthermore, SIRT3 deficient male mice demonstrated higher PWV compared to age-matched control mice (480 ± 21 n = 6 vs. 391 ±12 n = 7, p < 0.005). Aortic SIRT3 protein was negatively correlated with PWV (r=-0.7798, p < 0.005). Old mice also exhibited reduced kidney SIRT3 protein (0.73 ± 0.10 AU’s) compared to young controls (1.00 ± 0.00; p = 0.0192) and reduced NAD+ (918.6 ± 50.5 pmol/mg vs. young 1302.0 ± 56.6 pmol/mg, p = 0.0036). Old mice supplemented with NR had increased NAD+ concentration in kidney tissue (1303.0 ± 90.2 pmol/mg) however, had no effect on normalizing age-associated arterial stiffness (402 ± 18 old with NR vs 418 ± 15 old; p = 0.78). Here we show for that SIRT3 protein correlates with aortic stiffness and may be required for the maintenance of healthy arteries and for the first time that supplementation with NR, a commercially available supplement, ameliorates age-associated decreases in renal NAD+ demonstrating therapeutic potential in kidney disease.