La picoalgue verte marine Ostreococcus tauri est un eucaryote minimal développé en système modèle et qui a servi de ressource de gènes en biologie des lipides. Des informations détaillées sur ces caractéristiques lipidiques étaient cependant manquantes. Lors de ma thèse j’ai caractérisé le glycérolipidome d’O. tauri et ai cherché à déterminer quelles sont les cibles enzymatiques responsables de la dynamique des acides gras (FA) et de la régulation du métabolisme lipidique en réponse à des modifications de l’environnement (carences nutritives et refroidissement). O. tauri présente des caractéristiques uniques de composition en lipides et en FA mixtes entre les algues vertes et les Chromalveolates, et a été validé comme espèce modèle pour la classe des Mamiellophyceae. L’acide docosahexaénoïque (DHA) est confiné dans les lipides présumés extraplastidiaux : le phosphatidyldimethylpropanethiol (PDPT) et le bétaïne-lipide diacylglyceryl-hydroxymethyl-trimethyl-β-alanine (DGTA), tous deux marqueurs lipidiques des Chromalveolates. Les lipides plastidiaux de type procaryotique sont caractérisés par une prépondérance de FA polyinsaturés (PUFA) en C18 n-3, le 18:5 n-3 étant restreint aux galactolipides. Le 16:4 n-3, PUFA typique des galactolipides des microalgues vertes, est également un composant majoritaire des lipides extraplastidiaux chez O. tauri. Les triacylglycérols (TAG) présentent tout le panel d’acides gras d’O. tauri et leurs combinaisons moléculaires indiquent une origine plastidiale majoritaire. La carence azote provoque une forte accumulation de TAG, notamment des espèces présentant des combinaisons sn-1/sn-2 en 18:X/16:X et s'accompagne d'un transfert de carbone du phosphatidylglycérol (PG) et du monogalactosyldiacylglycérol (MGDG) aux TAG ce qui indique une contribution croissante de la voie plastidiale à la synthèse des TAG. Des expériences préliminaires de RT-qPCR sur des gènes du métabolisme des TAG révèlent une forte activation transcriptionnelle de certaines diacylglycérol acyltransférases (DAGT). Les carences nutritives répriment sévèrement l’activité Δ6 désaturase, générant une inversion du ratio 18:3/18:4 dans les lipides plastidiaux qui se répercute dans les TAG. La régulation fine et dynamique de ce ratio suggère un rôle important du 18:3 et du 18:4 dans les membranes plastidiales. Le refroidissement engendre une augmentation spécifique du 18:5 des galactolipides. La recherche active de la désaturase responsable de ce phénotype par une approche d'expression de gènes candidats en systèmes homologue et hétérologues (S. cerevisiae, N. Benthamiana) a conduit à l’indentification de deux Δ6 désaturases plastidiales jamais caractérisées dans d'autres systèmes. Celles-ci possèdent des spécificités non redondantes et originales entre elles et par rapport à l'acyl-CoA-Δ6 d'O. tauri. / The marine green picoalga Ostreococcus tauri is a minimal eukaryote implemented as model system that has been used as gene resource for lipid biology. Detailed information about its lipidic features was however missing. During my PhD, I characterized O. tauri glycerolipidome and associated dynamics under environmental stresses such as nutrient starvations and chilling and investigated transcriptional variations of putative target enzymes responsible for these changes. O. tauri which could be validated as model for related species of the class Mamiellophyceae, was found to display unique lipidic features related to both green and Chromalveolates microalgae. Docosahexaenoic acid (DHA) is confined to presumed extraplastidial lipids i.e. phosphatidyldimethylpropanethiol (PDPT) and the betaine lipid diacylglyceryl-hydroxymethyl-trimethyl-β-alanine (DGTA); all of these compounds are hallmarks of Chromalveolates. Plastidial lipids found to be of prokaryotic type are characterized by the overwhelming presence of C18 n-3 polyunsaturated FA (PUFA), 18:5 n-3 being restricted to galactolipids. C16:4 n-3, an FA typical of green microalgae galactolipids, also was a major component of O. tauri extraplastidial lipids. Triacylglycerols (TAGs) display the complete panel of FAs, and their molecular combinations designate a major plastidial origin of DAG precursors. Nitrate starvation greatly increases TAG content, in particular 18:X/16:X (sn-1/sn-2) combinations, and was associated with the transfer of carbon from phosphatidylglycerol (PG) and monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) to TAG indicating an increased contribution of the plastidial pathway to the TAG synthesis. Preliminary RT-qPCR experiments on TAG metabolism genes revealed an important transcriptional activation of some diacylglycerol acyltransferases (DGAT). Nutrient starvations severely repress Δ6 desaturase activity and result in the inversion of the 18:3/18:4 ratio in plastidial lipids that was feedback into TAG. The fine-tuning and dynamic regulation of the 18:3/18:4 ratio suggests an important physiological role of these FAs in photosynthetic membranes. Chilling generates an increase of 18:5 in galactolipids. The active quest for the desaturases responsible for this phenotype was achieved by expressing candidate genes in homologuous and heterologous (S. cerevisiae, N. Benthamiana) systems and led to the identification of two yet uncharacterized plastidial Δ6 desaturases. These desaturases display original and non-redundant specificity between each other and with the previously characterized in O. tauri Δ6 acyl-CoA desaturase.

Der Abbau der PBS unter Stickstoffmangel ist in Cyanobakterien ein ubiquitärer Mechanismus. Essenziell für den Abbau ist das Protein NblA. Das in Nostoc sp. PCC 7120 gut untersuchte ~7 kDa große Protein interagiert als Homodimer mit den PBS und dem Chaperon ClpC. Soweit bekannt kodieren alle Cyanobakterien ein essenzielles NblA-Protein. Der Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803, dagegen kodiert mit NblA1 und NblA2 sogar zwei für den PBS-Abbau entscheidende Proteine. In dieser Arbeit konnte erstmalig durch in vitro und in vivo Interaktionsstudien mithilfe von pull down-Versuchen und FRET gezeigt werden, dass NblA1 und NblA2 als biologisch aktive Form ein Heterodimer bilden. In vitro-pulldown-Versuche zeigten für Synechocystis eine Interaktion des Heterodimers mit den PBS und ClpC. Durch die Ausbildung dieses ternären Komplexes markiert NblA1/NblA2 die PBS für den Abbau durch eine Clp-Protease mit ClpC als Chaperonpartner. In Photobionten gibt es eine Reihe von clp-Genen, so besitzen Cyanobakterien vier proteolytische clp Untereinheiten. Aus diesen bilden sich gemischte Heptamere aus je zwei Clp-Untereinheiten. Zwei lösliche, im Cytoplasma vorkommende Proteasen wurden bis jetzt zweifelsfrei identifiziert, eine dritte, an der Thylakoidmembran assoziierte Protease wird außerdem vermutet. Diese putative Protease, vermutlich aus dem Chaperon ClpC und den proteolytischen Untereinheiten ClpP1 und ClpR aufgebaut, wurde heterolog exprimiert. Mittels Koreinigung konnte ein funktioneller proteolytischer Kern gereinigt werden, der zusammen mit dem Chaperon ClpC eine aktive Clp-Protease bildet. Durch Größenausschlusschromatografie und Untersuchungen zur Proteaseaktivität konnte diese dann erstmalig charakterisiert werden. Des Weiteren zeigten in vitro-Degradationsversuche mit der aktiven Protease zweifelsfrei, dass das NblA1/NblA2-Heterodimer durch ClpC-ClpP1/ClpR abgebaut wird. Der Abbau von NblA1/NblA2 kann demnach auch ohne ein Substrat durch die Protease erfolgen. / The degradation of pycobilisomes under nitrogen deficiency, which is visible as a color change from blue green to yellow green, is an ubiquitary mechanism. Essential for the degradation is the small NblA protein. The well characterized NblA protein from Nostoc sp. PCC 7120 builds as biological active form a homodimer and interacts with the phycobilisomes and ClpC. However, the model organism Synechocystis sp. PCC 6803 possess two nblA genes, nblA1 and nblA2, which are both essential for phycobilisome degradation. In this work it could be shown by interaction studies and Förster resonance energy transfer that NblA1 and NblA2 builds as biological active form a heterodimer. Furthermore it could be shown that the NblA proteins form a ternary complex with ClpC (the HSP100 chaperone partner of Clp proteases) and phycobiliproteins in vitro. This complex is susceptible to ATP-dependent degradation by a Clp protease. Clp proteases of Cyanobacteria consist, besides the chaperones ClpC and ClpX of three different proteolytic subunits (ClpP1, 2, 3) and the ClpP variant ClpR which lacks the catalytic triad typical of Serine-type proteases. In Synechococcus 7942 two Clp proteases could be identified by gel filtration and immunoblot analyses, which provided evidence that each protease consists of a unique proteolytic core comprised of two separate Clp subunits, one core consisting of ClpP1 and ClpP2, and the other of ClpP3 and ClpR, in which subunits ClpP1/ClpP2 interact with ClpX and the ClpP3/ClpR protease with ClpC. In addition to these two soluble proteases, a third, membrane associated proteolytic complex is assumed, consisting of ClpP1 and ClpR. In Synechocystis 6803, homologs of the Clp machinery could be found by BLAST analyzes. This putative ClpP1/ClpR protease could be characterized in vitro by size-exclusion chromatography and degradation assays. Furthermore it could be shown a degradation of the NblA1/NblA2 heterodimer by the protease.

Cette thèse présente différents cas d'acclimatation d'une espèce de phytoplancton (Isochrysis sp.) à des modifications de son environnement physico-chimique avec une attention particulière portée sur la composante lipidique de la réponse aux changements. Dans ce contexte nous avons étudié les lipides à la fois comme des produits (triacylglycerol) et des acteurs (glycolipides) de la photosynthèse. Tout d'abord, nous avons étudié l’influence de plusieurs types de limitation par l'azote sur la teneur en lipides neutres des algues. Nous avons montré que la relation entre la disponibilité de l’azote et la teneur en lipide n'était pas monotone et qu'elle présentait un caractère hystérétique. Les cellules d’Isochrysis sp. n’accumulent des lipides neutres que transitoirement lors du passage d'une croissance forte vers une croissance faible. Nous nous sommes ensuite intéressé aux relations qui existent entre le cycle nycthéméral et l'accumulation de réserves énergétiques sous forme de lipides et de sucres. Les réserves sont accumulées pendant le jour en disproportion du reste du carbone et consommées pendant la nuit pour alimenter la division cellulaire et la croissance nocturne. La carence en azote dans ces conditions nycthémérales ne provoque pas d’accumulations significatives de lipides. Les variations diurnes de la teneur en lipides neutres sont plus importantes que les variations obtenues en carence. A travers ces différentes expériences nous avons pu mettre en évidences les relations qui existaient entre l'environnement, la croissance, et l'accumulation de réserves. La compréhension de ces mécanismes a permis de déterminer les conditions environnementales qui favorisent la production d’huile en vue d’une utilisation biocarburant. Nous avons aussi étudié l'influence des conditions de croissance sur la composition des glycolipides des membranes des chloroplastes. Les résultats montrent que les changements de la teneur en MGDG, DGDG et SQDG et de l’insaturation des acides gras de ces lipides accompagnent les modifications d’activité photosynthétique des cellules en limitation azotée et en cycle Jour/Nuit. / This thesis presents various cases of acclimation of a phytoplankton species (Isochrysis sp.) to changes in growth conditions, with special emphasis on the lipid response to those changes. In this context we have studied lipids as both products (triacylglycerol) and actors (glycolipids) of photosynthesis. First, we studied the influence of several types of nitrogen limitation on the neutral lipid content of algae. We showed that the relationship between nitrogen availability and lipid content was not monotonous and presented a hysteretic behaviour. Isochrysis sp. cells accumulated neutral lipids only transiently during the transition from high growth to low growth. We were also interested in the relationship between the circadian cycle and the accumulation of energy reserves as fats and sugars. Reserves were accumulated during the day and consumed during the night to provide energy for cell growth and division. Nitrogen deficiency under alternative light did not lead to significant accumulations of neutral lipids. Through these experiences we could understand the relationship between environment, growth, and accumulation of reserves. These results allowed us to identify the environmental conditions that enhance oil production for biofuel use. We also studied the influence of growth conditions on the composition of glycolipids that comprises chloroplast membranes. Changes in MGDG, DGDG and SQDG contents and in their fatty acids unsaturation were linked to changes in photosynthetic characteristics when growth conditions are modified (L/D cycle, N-limitation). Glycolipids are likely to be important actors of photosynthetic acclimation to environmental changes.

Exocyst is a protein complex composed of eight subunits, evolutionarily conserved in yeasts, animals, and plants. The main function of exocyst is to mediate the tethering of secretory vesicles to the plasma membrane. However, the involvement of exocyst in some other processes, especially in autophagy, has been recently discovered. Plant exocyst is specific because most of its subunits have multiple paralogs. The most diversified subunit is EXO70, which is encoded by 23 paralogous genes in Arabidopsis thaliana. In this thesis, I dealt with subunit AtEXO70E2 (AT5G61010), which has been localized to double-membrane compartments considerably reminiscent of autophagosomes. These compartments were named EXPOs (for exocyst-positive organelles) and described as a component of unconventional protein secretion pathways. There are also hints that EXO70E2 could play a role in autophagic processes. However, details of this relationship remained unexplored. For my experiments, I used stably transformed lines of A. thaliana and transiently transformed leaves of Nicotiana benthamiana. I performed numerous colocalization experiments, applied various pharmacological treatments to the studied lines, and analyzed a mutant line in the EXO70E2 gene. According to my observations, protein EXO70E2 is expressed especially...

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Les triacylglycérols d'algues (TAG) représentent une source prometteuse de biocarburants. Les principales étapes de la synthèse des acides gras et du métabolisme du TAG des algues ont été déduites de celles des plantes terrestres, mais on en sait peu sur les sources de carbones et d’énergie intervenant dans la synthèse de lipides de réserve. Nous avons donc étudié la synthèse des acides gras chez l’algue modèle Chlamydomonas reinhardtii en utilisant une combinaison d'approches génétiques, biochimiques et microscopiques. Plus précisément, j'ai d'abord examiné la localisation subcellulaire de gouttelettes de lipides dans des cellules d'algues exposées à une forte lumière, conditions où une plus grande quantité de pouvoir réducteur est produite. J'ai ensuite contribué à mettre en évidence que la bêta-oxydation des acides gras est un processus peroxysomal, et que pendant une carence en azote réalisée en conditions photoautotrophe, des mutants dépourvus de la malate déshydrogénase 2 peroxysomale (mdh2) accumulent 50% plus TAG que les souches parentales. Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence l'importance du contexte redox cellulaire sur la synthèse lipidique. Cette étude a également permis de révéler l’existence d'un échange d’énergie entre le peroxysome et le chloroplaste. Enfin, en caractérisant des mutants déficients dans la dégradation des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA), j'ai montré que le catabolisme des BCAAs joue un double rôle dans la synthèse de TAG en fournissant des précurseurs carbonés et de l'ATP. L'ensemble de ces travaux ouvert de nouvelles pistes pour l'amélioration génétique future de souches d'algues pour la production de biocarburants. / Algal triacylglycerols (TAG) represent a promising source for biofuel. The major steps for fatty acid synthesis and TAG metabolism have been deduced based on that of land plants, but little is known about carbon and energy sources. To address this question, we investigated fatty acid synthesis in algal cells using a combination of genetic, biochemical and microscopic approaches in the model microalga Chlamydomonas reinhardtii. Specifically, I first examined subcellular localization of lipid droplets in algal cells exposed to high light, a condition favoring production of reducing power. Secondly, I contributed to put on evidence that the beta-oxidation of fatty acids is a peroxisomal process, and that during photoautotrophic nitrogen starvation, knock-out mutants of the peroxisomal malate dehydrogenase 2 (mdh2) made 50% more TAG than parental strains, highlighting the importance of cellular redox context on lipid synthesis. This study also revealed for the first time the occurrence of an energy trafficking pathway from peroxisome to chloroplast. And finally, by characterizing mutants defected in degradation of branched-chain amino acids (BCAAs), I showed that BCAA catabolism plays a dual role in TAG synthesis via providing carbon precursors and ATP. Taken together, this work highlighted the complex interplay between carbon and energy metabolism in green photosynthetic cells, and pointed future directions for genetic improvement of algal strains for biofuel productions.