Le bisphénol A (BPA) est une molécule dérivée du plastique, considéré comme un perturbateur endocrinien (PE) pour sa capacité de liaison aux récepteurs nucléaires (RNs). Il est associé à des troubles neurodéveloppementaux, probablement en raison de la présence de certains RNs dans le cerveau des vertébrés. Les PEs peuvent également affecter les invertébrés marins, dont les ascidies, mais leur mode d'action reste inconnu. Mon projet de thèse a pour but d’étudier la toxicité du BPA sur le développement embryonnaire de l'ascidie Phallusia mammillata. Tout d’abord, j’ai évalué l’expression des RNs de P. mammillata et j’ai trouvé que 5 d’entre eux (COUP, ERR, PPAR, PXR/VDR) sont exprimés dans le cerveau de l’ascidie (= vésicule sensorielle) ou à proximité (TR). Ils correspondent majoritairement aux orthologues humains connus pour lier le BPA. Puis, j’ai évalué la toxicité du BPA au cours du développement et constaté qu’il est toxique de façon dose-dépendante. En effet, j’ai montré que de faibles doses de BPA induisent une toxicité neurodéveloppementale en affectant la différenciation de l'organe sensoriel pigmenté de l’ascidie. Ce phénotype est spécifique aux bisphénols. Enfin, l’étude d’agonistes et d’antagonistes de l’estrogen-related receptor (ERR) a montré des phénotypes correspondant à ceux obtenus avec le BPA. J’ai trouvé que Pm-ERR est exprimé dans la vésicule sensorielle de la larve, autour de l'organe sensoriel pigmenté. Il semble donc que Pm-ERR est impliqué dans ce phénotype. Toutefois, la présence des autres RNs que j’ai identifiés soulève la possibilité de leur implication dans le développement de l’ascidie et/ou de la toxicité de PEs. Ils ne doivent donc pas être négligés. / Bisphenol A (BPA) is a plastic-derived molecule that is now considered an endocrine disruptor (ED). BPA impair hormonal systems via binding to nuclear receptors (NRs) and it has been linked to neurodevelopmental disorders, possibly due to the presence of some NRs in the vertebrate brain. BPA has been reported to affect marine invertebrates such as ascidians, but how is BPA acting is not known. My PhD project is aimed at deciphering the toxicity of BPA on embryonic development of the marine invertebrate chordate Phallusia mammillata (Tunicata). Firstly, I assessed the embryonic expression of P. mammillata NRs and found that 5 are expressed within the ascidian brain (also called sensory vesicle, SV) (COUP, ERR, PPAR, PXR/VDR) or nearby (TR). Interestingly, the human orthologues of most of these NRs are known to bind BPA. Secondly, I assessed BPA toxicity during P. mammillata embryonic development and found that BPA is toxic in a dose-dependent manner. I also show that at micromolar doses BPA induces neurodevelopmental toxicity by impairing differentiation of the ascidian pigmented sensory organ (PSO). I further show that this phenotype is specific to bisphenols. Finally, estrogen-related receptor (ERR) agonists and antagonists partially phenocopied BPA phenotype. Interestingly, I found that Pm-ERR is expressed in the larval SV close to the ascidian PSO, thus suggesting an involvement of Pm-ERR in the BPA phenotype. Furthermore, the complex pleiotropic action of BPA together with the presence of other NRs in the ascidian larval brain raises the possibility that these NRs are involved both in ascidian brain development and EDs toxicity, thus they should not be overlooked.

5 Abstract Genetic mechanisms of regulation of gene expression form the basis for proper development, function of organisms and their responses to variable life conditions. However, they are relatively slow. Life processes that require a fast response to the changing environmental and metabolic conditions are mostly executed on the level of proteins especially their posttranslational modifications and protein- protein interactions.The goal of the experimental work that led to the presented thesis consisted in exploitation of the model organism Caenorhabditis elegans for analysis of regulation of gene expression by transcription factors from the protein family of nuclear receptors. The model system C. elegans enables very efficient experimental procedures in the field of genetics, genomics and functional analysis of phenotypes. In the experimental work connected with this thesis, I studied the regulation of gene expression under specific experimental conditions from the perspective of advanced functional proteomics and I focused on the employment of separation methods and methods of advanced proteomics, especially by mass spectrometry.In the first part of the work, I characterized the nuclear receptor NHR-60 on the protein level. This nuclear receptor is expressed as two protein forms with a mass of 50 kDa...

Les récepteurs nucléaires font partie d’une famille de protéine multigénique agissant comme facteurs de transcription qui, en réponse à la liaison d’un ligand, régulent l’expression de gènes cibles impliqués dans une variété de fonctions physiologiques. Cependant, les récepteurs nucléaires orphelins, qui n’ont pas de ligand connu, peuvent également être régulées par des modifications post-traductionnelles (PTMs) comme la SUMOylation et la phosphorylation. La famille des NR4A, incluant Nurr1, Nur77 et Nor1, sont des récepteurs orphelins dépendant grandement des PTMs au niveau de l’AF-1 afin de moduler leurs activités essentielles dans la différenciation, le développement et le métabolisme des fonctions neurologiques. En particulier, il est connu que les PTMs permettent le recrutement de cofacteurs comme l’isomérase Pin-1, une enzyme recrutée par des motifs phospho-sérine/thréonine-proline qui catalyse l’isomérisation cis/trans du lien avec la proline. Notre laboratoire a récemment identifié un site de SUMOylation atypique nommé pSuM (phosphorylation-dependent Sumoylation Motif) possédant une extension phosphorylable de motif sérine/thréonine-proline au niveau du domaine AF-1 (Activation Function-1) de certains récepteurs nucléaires, soutenant un processus de régulation transcriptionnelle des récepteurs via la SUMOylation et la phosphorylation. Le récepteur Nor1 possède un motif pSuM dont le rôle exact de la SUMOylation et l'implication de Pin-1 comme régulateurs de l’activité de Nor1 dans les mécanismes de neuroprotection reste inconnu. Ainsi nos objectifs sont de déterminer et caractériser le mécanisme de recrutement et l'impact de Pin-1 sur la régulation de Nor1 ainsi que de déterminer le rôle de Pin-1 sur l’expression des gènes cibles impliqués dans la neuroprotection. Nos résultats démontrent que l’isomérase Pin-1 favorise l’expression de gène impliquées dans la neuroprotection comme Eno3, Nrip1 et Atf3 via un mécanisme dépendant de la SUMOylation et de la phosphorylation qui permet la régulation positive de l’activité transcriptionnelle de Nor1 dans un modèle de cellules neuronales de souris. En conclusion, les résultats de ce travail permettent d’identifier l’isomérase Pin-1 comme un nouveau cofacteur de Nor1 impliqué dans le contrôle de l’expression génique associé à la neuroprotection et démontre un mécanisme de régulation de Nor1 par la SUMOylation et la phosphorylation de l’extension du pSuM. / Nuclear receptors are part of a family of multigene proteins acting as transcription factors that, in response to ligand binding, regulate the expression of target genes involved in various physiological functions. However, orphan nuclear receptors, which have no known ligand, can also be controlled by post-translational changes (PTMs) such as SUMOylation and phosphorylation. The NR4A family, including Nurr1, Nur77, and Nor1, are orphan receptors highly dependent on PTMs at the AF-1 domain to modulate their essential activities in the differentiation, development, and metabolism of neurological functions. The PTMs of nuclear receptors allow the recruitment of cofactors such as the Pin-1 isomerase, an enzyme recruited by phospho-serine/threonine-proline motifs that catalyzes the cis/trans isomerization of the proline. Our laboratory has recently identified an atypical SUMOylation site named pSuM (phosphorylation-dependent Sumoylation Motif) characterized by a phosphorylation-sensitive extension of serine/threonine-proline pattern usually present in the AF-1 (Activation Function-1) domain of receptors and providing transcriptional regulation via SUMOylation and phosphorylation. As of now, the role of SUMOylation and Pin-1 as regulators of Nor1 activity in neuroprotection mechanisms remains unknown. Thus, our objectives were to determine and characterize the recruitment mechanism of Pin-1 and its impact on the transcriptional regulation of Nor1 as well as to determine the role of Pin-1 on the expression of target genes involved in neuronal integrity. Our results have shown that Pin-1 isomerase enhances the expression of genes involved in neuroprotection such as Eno3, Nrip1, and Atf3 through a SUMOylation and phosphorylation mechanism that upregulates the transcriptional activity of Nor1 in neuronal cells. In conclusion, this project identifies Pin-1 as a novel cofactor of Nor1 that is regulated by SUMOylation and phosphorylation of the pSuM extension, thus allowing a tight control over the transcription of genes involved in neuroprotection processes.

Les acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC) de la série n-3 jouent des rôles essentiels dans le fonctionnement du cerveau et notamment dans les processus de plasticité synaptique et de mémoire, altérés au cours du vieillissement. Il est maintenant bien admis que ces AGPI peuvent réguler la transcription génique en se liant à des récepteurs nucléaires spécifiques, les PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors), mais aussi aux récepteurs de l’acide 9-cis rétinoïque, les RXR (retinoid X receptors). En tant que partenaires communs d’hétérodimérisation des PPAR et des RAR (récepteurs de l’acide tout-trans rétinoïque), les RXR sont des acteurs clés de la modulation de l’expression génique par les acides gras et les rétinoïdes. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail de thèse était d’étudier, au cours du vieillissement chez le rat, les effets d’une supplémentation en AGPI-LC n-3 sur l’activité des voies de signalisation des acides gras et des rétinoïdes, les processus de plasticité cérébrale (plasticité synaptique et neurogenèse) et la mémoire spatiale. Nos principaux résultats montrent qu’une supplémentation en AGPI-LC n-3, pendant 21 semaines chez des rats à mi-vie, maintient dans l’hippocampe les niveaux d’expression des ARNm codant pour RXRγ et GAP-43 (protéine synaptique) altérés au cours du vieillissement. De plus les rats âgés supplémentés en AGPI-LC n-3 présentent une augmentation du nombre de néo-neurones hippocampiques et une amélioration de la mémoire spatiale de travail, comparés aux rats âgés contrôle. Les résultats de cette étude plaident en faveur d’un effet bénéfique des AGPI-LC n-3 sur la mémoire de travail au cours du vieillissement via notamment, une action sur la plasticité cérébrale. De plus, nos travaux suggèrent l’implication des RXR dans l’effet neuroprotecteur des AGPI-LC n-3, qui réguleraient l’expression de certains gènes cibles impliqués dans la plasticité synaptique et les processus de neurogenèse hippocampique. / Long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) of the n-3 series play essential roles in brain functions, including brain plasticity and memory processes which are altered during aging. It is now well accepted that these PUFA regulate gene transcription through binding and activating specific nuclear receptors such as PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors) and RXR (retinoid X receptors, which also bind 9-cis retinoic acid). As a common heterodimeric partner of both PPAR and RAR (all-trans retinoic acid receptors), RXR is a key factor in the modulation of gene expression by fatty acids and retinoids. In this context, the purpose of this work was to study the effects of a n-3 LC-PUFA supplementation on fatty acid and retinoid signalling pathways and on cerebral plasticity and spatial memory processes. Our main results show that n-3 LC-PUFA supplementation for 21 weeks in mid-life rats, maintains the mRNA levels of RXRγ and GAP-43 (synaptic protein) which were altered in aged rat hippocampus. Besides, supplemented aged rats exhibited increased numbers of newly generated neurons and improved spatial working memory, when compared with control aged rats. To summarize, our results support the neuroprotective effects of n-3 LC-PUFA during aging, in particular on cerebral plasticity and working memory. Furthermore, our works suggest the implication of RXR in the set up of these effects through notably the regulation of some target genes involved in synaptic plasticity and hippocampal neurogenesis processes.

<p>Žučne kiseline (ŽK) su strukturno raznoliki molekuli, koji pored uloge koju ostvaruju putem žuči, deluju i kao signalni molekuli i ostvaruju kako endokrina tako i parakrina dejstva. Činjenica da je do sada u terapijske svrhe primenjivana samo ursodeoksiholna kiselina (UDK), posledica je brojnih ograničenja u mogućnosti primene ostalih prirodnih ŽK, i ističe potrebu za otkrivanjem novih sintetskih ŽK i liganda. Cilj istraživanja bio je ispitivanje sintetske 12-monoketoholne kiseline (MK) i prirodne UDK u modelu holestaze i aloksanom izazvanog dijabetesa. Ispitivanja su vr&scaron;ena na pacovima soja Wistar. Analizirana je telesna masa, glikemija, pokazatelji jetrene funkcije (AST; ALT, &gamma;-GT, ukupni i direktni bilirubin), a iz homogenate jetre određen je intenzitet lipidne peroksidacije i aktivnost antioksidativnih enzima (CAT, GSH-Px, GSH-R, GSH-ST). Isečci tkiva jetre su histolo&scaron;ki obrađeni i bojeni hematoksilin-eozin metodom i histohemijskim metodama (retikulin, Mallory, Periodic Acid Schiff- Alcian Blue (PAS/AB)). Imunohistohemijski je ispitana proliferacija hepatocita (Ki-67), markeri apoptoze (p53, Bcl-2, Bcl-X, Bax) i ekspresija nuklearnog farnesoid X receptora (FXR). Rezultati istraživanja pokazuju da ispitivane ŽK pomažu očuvanje telesne mase u holestazi i dijabetesu, i značajno snižavaju glikemiju kod dijabetičnih jedinki. Parametri jetrene funkcije u holestazi i dijabetesu su regulisani primenom MK i UDK. Obe ŽK u značajnoj meri smanjuju intenzitet lipidne peroksidacije i pojačavaju enzimsku antioksidativnu odbranu hepatocita u holestazi i dijabetesu. Ekspresija markera apoptoze nije značajno promenjena izazvanjem modela holestaze i dijabetesa, kao ni primenom ispitivanih ŽK. Nasuprot tome, izazivanje holestaze i dijabetesa značajno smanjuje proliferaciju hepatocita, dok primena MK i UDK poni&scaron;tava ovaj efekat i značajno povećava proliferaciju hepatocita. Hiperglikemija u aloksanskom dijabetesu nije dovela do pojačane ekspresije FXR. Izazivanje holestaze kod zdravih i dijabetičnih životinja dovelo je do porasta ekspresije FXR, koja je redukovana primenom MK i UDK. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da sintetska 12-monoketoholna kiselina pokazuje slična hipoglikemijska, hepatoprotektivna i antioksidativna dejstva kao i prirodna ursodeoksiholna kiselina.</p> / <p>Bile acids (BAs) are structurally diverse molecules, which have theroles in the digestive system, which are exercised through the bile. Beside those, BAs act as a signaling molecules and achieve endocrine and paracrine effects. In addition to its own metabolism, bile acids modulate the metabolism of lipids and glucose. The fact that so far only ursodeoxycholic acid (UDC) is used for therapeutic purposes, speak clearly about of numerous limitations on the application of other natural BAs, and highlights the need to develop new synthetic Bas and ligands. The aim of this study was to investigate the influence of synthetic 12-monoketocholic acid (MC) and natural bila acid UDC in the model of cholestasis and alloxan-induced diabetes. Tests were performed on male Wistar rats. We analyzed the body mass, glucose, liver function tests (AST, ALT, &gamma;-GT, total and direct bilirubin). Using liver tissue homogenates we determined intensity of lipid peroxidation (by concentration of malondilaldehyde) and the activity of antioxidant enzymes (CAT, GSH-Px, GSH -R, GSH-ST). Liver tissue were histologically processed and stained with hematoxylin-eosin method and histochemical methods (reticulin, Mallory, Periodic Acid Schiff- Alcian Blue (PAS / AB)). Imunohistochemical examination included hepatocyte proliferation (Ki-67), markers of apoptosis (p53, Bcl-2, Bcl-X, Bax), and expression of the nuclear farnesoid X receptor (FXR). Results of the research show that MC prevented decrease in body mass during cholestasis and diabetes, and significantly reduced glycemia in diabetic animals. The liver function tests in cholestasis and diabetes are normalised by MC and UDC aplication. Both BAs significantly reduce lipid peroxidation and enhance enzymatic antioxidant defense of hepatocytes in cholestasis and diabetes. The expression of markers of apoptosis was not significantly changed in models of cholestasis and diabetes, as well as the application of the tested BAs. In contrast, in cholestasis and diabetes model, the proliferation of hepatocytes was significantly reduced, while the use of MC and UDC reversed this effect and significantly increased the proliferation of hepatocytes. Hyperglycemia in alloxan-induced diabetes did not lead to overexpression of FXR. Induction of cholestasis in healthy and diabetic animals resulted in an increase in the expression of FXR, which is reduced by using the MK and the UDC. Based on these results we can conclude that a synthetic 12-monoketocholic acid shows similar hypoglycemic, hepatoprotective and antioxidant effects as natural ursodeoxycholic acid.</p>

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation. / Three TRIM proteins (TRIpartite Motif), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) and PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), were studied in this thesis. TIF1α is a nuclear receptor coactivator and TIF1β is the universal corepressor of the KRAB-zinc finger repressor family of which, ZNF74 is studied here as a prototypic member. PML functions as a tumor suppressor and is the essential organiser of PML-NBs (PML-Nuclear Bodies) which are very dynamic nuclear macrostructures containing more than 40 proteins. The function of these three TRIM proteins is regulated by sumoylation, a post-translational modification involving the covalent linkage of SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) to specific targets lysine. In this thesis, we propose to develop new methods based on BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) to detect non-covalent nuclear protein interactions but also covalent linkage to SUMO in real time in living cells. To date, BRET was never used to assess non-covalent or covalent nuclear protein interactions. Studying transcriptionally active protein interactions represents a challenge by classical methods in particular when proteins have a tendency to aggregate (TRIM family) or when characterizing nuclear matrix proteins (ZNF74). In the first article, homo- and heterodimerisation of TIF1 α and β as well as their interaction with ZNF74 was assessed by BRET using full length proteins in living mammalian cells. We ascertained the heterodimerisation of TIF1α and β. Whereas ZNF74 interacts strongly with TIF1β, no interaction was detected with TIF1α. However, we unravelled the existence of ternary complexes involving ZNF74, TIF1α and TIF1β. This suggested that a mechanisms for cross-talk between nuclear receptors and KRAB-zinc finger proteins. Thus, we showed that BRET can be advantageously used as a non-transcription-based interaction system for studying transcriptionally active proteins, including nuclear matrix proteins, in living cells. Previous studies have shown that the sumoylation of PML (a tumour suppressor) is involved in its proteasome degradation that is As2O3-inducible and dependent on the polySUMO E3 ubiquitin ligase, RNF4. In the second article, we describe the development of a new application of the BRET method for the detection of covalent and non-covalent interactions with SUMO. Owing to this SUMO BRET assay, we established that the As2O3 / RNF4-mediated degradation of PML, not only depends on PML sumoylation as previously demonstrated, but also on the integrity of its SUMO binding domain. We also demonstrated that As2O3 which increases PML sumoylation, also enhances PML / RNF4 interaction. Our study revealed that most PML SBD non covalent interactions with sumoylated proteins required the phosphorylation of serines within PML SBD that were previously described as target sites for CK2 kinase and involved in PML degradation. Despites the involvement of PML SBD in RNF4-mediated degradation, these serines which function as an SBD phospho-switch, were not required for RNF4-mediated degradation. This suggested that CK2- and RNF4-mediated PML degradation represents two distinct pathways triggering PML ubiquitin / proteasome-dependent degradation. At last, our study led to the hypothesis that the recruitment of sumoylated PML at PML-Nuclear Bodies subnuclear structures via the PML SBD and / or possibly an E3 ubiquitin ligase activity other than RNF4 (PML itself being candidate) may favour PML degradation. Our study also stresses the dynamic involvement of three PML post-translational modifications, phosphorylation, sumoylation and ubiquitination in its degradation. A third article addressing the role of TIF1β sumoylation is presented in the Appendix. We characterized the 6 SUMO targets lysine of TIF1β and demonstrated that sumoylation is required for TIF1β transcriptional repressive activity. This is in part explained by the fact that TIF1β sumoylation is a pre-requisite for histone deacetylases recruitment since TIF1β repressive activity is partly dependent on histone deacetylases. We found that TIF1β sumoylation does not influence its homodimerisation or interaction with the KRAB box of KRAB zinc finger proteins recruiting TIF1β to promoters. TIF1β sumoylation is however relying on the integrity of TIF1β PHD finger and on its self-oligomerisation. Interestingly, we demonstrated that TIF1β sumoylation is positively regulated by its interaction with KRAB domain. It is thus suggested that KRAB-zinc finger proteins recruit TIF1β at DNA promoters where they trigger increase of TIF1β sumoylation and thus enhance its repressive activity.

L’adaptation de l’organisme à son environnement est essentielle à sa survie. L’homéostasie énergétique permet l’équilibre entre les apports, les dépenses et le stockage d’énergie. Un surplus calorique important dérègle ce processus et mène au développement du syndrome métabolique caractérisé, entre autres, par une obésité, un diabète de type II, des maladies cardiovasculaires et des dyslipidémies. La ghréline participe au maintien de l’équilibre énergétique durant le jeûne en stimulant la production de glucose par le foie et le stockage lipidique dans le tissu adipeux. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha, surexprimé en situation de jeûne, est impliqué dans l’induction de la production de glucose par le foie et l’oxydation des acides gras. Notre hypothèse est que ces deux acteurs clés du métabolisme énergétique constituent un axe de régulation commun. Dans cette étude, nous montrons que la ghréline participe à la régulation de PGC-1alpha. Son récepteur GHS-R1a, possédant une forte activité constitutive, est également impliqué de façon indépendante au ligand. GHS-R1a réduit l’activité transcriptionnelle de PGC-1alpha tandis que l’ajout du ligand inverse modérément cette action. L’effet de GHS-R1a corrèle avec l’acétylation de PGC-1alpha qui est fortement augmentée de façon dose-dépendante. La stabilité de PGC-1alpha est également augmentée par le GHS-R1a indépendamment de l’ubiquitine. La ghréline diminue la capacité de PGC-1alpha à lier PPARbeta, un récepteur nucléaire partenaire de PGC-1alpha. De plus, la ghréline réduit, de façon ligand-dépendante, la capacité de coactivation de PGC-1alpha sur PPARbeta dans les hépatocytes. L’ensemble de ces résultats identifie PGC-1alpha comme cible du signal de la ghréline et suggère un axe de régulation ghréline/PGC-1alpha/PPARbeta.Une meilleure compréhension de cet axe de régulation va permettre la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour faire face aux pathologies associées au syndrome métabolique. / The adaptation of an organism to its environment is essential to its survival. Energy homeostasis is defined as the balance between intakes, expenses and storage of energy. An excess of calories disrupts this process and leads to the development of the metabolic syndrome that is characterized by obesity, type II diabetes, cardiovascular diseases and dyslipidemia. During fasting, ghrelin participates in the maintenance of energy balance by stimulating hepatic production of glucose and lipid storage in adipose tissue. The transcriptional coactivator PGC-1alpha is overexpressed in the liver during fasting and is involves in the induction of the hepatic glucose production and fatty acid oxidation. Our hypothesis is that these two key performers in the energy metabolism constitute a common axis control. In this study, we show that ghrelin plays a role in the regulation of PGC-1alpha. The ghrelin receptor GHS-R1a is also involved because of its strong constitutive activity in absence of ligand. We found that GHS-R1a inhibited PGC-1alpha transcriptional activity whereas adding ghrelin to cells moderated this effect. PGC-1alpha activation by GHS-R1a correlated with a dose-dependent increase of PGC-1alpha acetylation. The stability of PGC-1alpha was also increased by ghrelin receptor in a manner involving the ubiquitin-independent proteasome pathway. Ghrelin decreased the ability of PGC-1alpha to bind to PPARbeta, one of its nuclear receptor partners. Furthermore, ghrelin decreased the ability of PGC-1alpha to coactivate PPARbeta in a ligand-dependent manner in hepatocytes. Together, these results identify PGC-1alpha as a metabolic target of GHSR-1a signaling and defines a new regulatory axis involving ghrelin/PGC-1alpha/PPARbeta in hepatocytes. A better understanding of this regulation axis will provide novel aspects in therapeutic targeting of diseases associated with the metabolic syndrome.

Movimentos coletivos prestam um papel fundamental na dinâmica e energética de biomoléculas em solução. Estes movimentos permitem o acoplamento de regiões significativamente distantes, apresentando considerável influência, por exemplo, no alosterismo para a formação de complexos macromoleculares e no funcionamento integrado de proteínas multidomínios como \"máquinas moleculares\". Neste trabalho de doutoramento, serão apresentados os resultados referentes à aplicação conjunta de técnicas experimentais biofísicas, de modelagem estrutural e de dinâmica molecular no estudo de dois sistemas para os quais estes movimentos coletivos demonstram considerável importância funcional. Para a interação do receptor nuclear do ácido 9-cis-retinóico com seu elemento responsivo específico no DNA (HRE), a comparação de estudos de dinâmica molecular com ensaios de afinidade por anisotropia de fluorescência sugere que a resistência inicial para a associação do monômero, seguida da acentuada colaboratividade na associação do dímero é regida por um impedimento da associação do domínio de ligação ao DNA (DBD) para o primeiro à sequência responsiva devido, em última análise, a uma não complementaridade dos modos coletivos mútuos. Este impedimento para a associação monomérica inicial é mais acentuado para o monômero 5\' (para o qual a menor especificidade de ligação à seqüência específica já é bem documentada), devido aos efeitos conjuntos de um \"defeito\" natural no empacotamento de bases da seqüência responsiva, que se manifesta mais significativamente na interface entre o meio-sítio 5\' e a seqüência espaçadora, e dos modos vibracionais entre os dois sítios decorrentes de seu faseamento relativo na topologia do DNA na seqüência responsiva, caracterizando um mecanismo \"chave e fechadura\" para a interação obrigatoriamente simultânea dos dois monômeros ao DNA. No segundo caso, um estudo integrado utilizando a técnica experimental de espalhamento de raios X a baixos ângulos e uma abordagem de modelagem estrutural baseada em dinâmica molecular foi realizado para a celobiohidrolase I de Trichoderma harziannum. Este estudo permitiu tanto a elaboração de um modelo estrutural de maior resolução para esta enzima de alto potencial biotecnológico como a constatação dos possíveis mecanismos moleculares a partir dos quais as glicosilações no peptídeo conector impõem restrições à orientação e modos vibracionais entre seus dois domínios de forma condizente com sua ação concertada na interação e no deslize da enzima sobre a superfície celulósica, ambos de fundamental importância para a processividade da enzima na hidrólise do substrato microcristalino. / Collective motions play a fundamental role in solution biomolecule dynamics and energetics. These movements can couple very distant regions in the protein structures affection, for instance, allosteric mechanisms, the establishment of macromolecular complexes, and on the integrated function of multidomain proteins as molecullar machines. In this thesis, we present results concerning to the joint use of experimental biophysical techniques, structural modeling and molecular dynamics simulations on the study of two systems for which these collective motions have substantial importance. First, we study the interaction of the nuclear retinoid X receptor with its specific DNA hormone response element (HRE) using a combination of molecular dynamics simulations and affinity assays performed by using fluorescence anisotropy. We find out that collective motions mediate the low binding affinity of monomers and the high cooperative binding of HRE dimers. The lower binding affinity of the monomer is more prominent for 5´ monomers. This occur due to an natural ineffective stacking of the last base pair step at the 5´-half-site and to the phasing of the two binding half-sites in the DNA topology, that impose a collective motions that tends to occlude the 5´ binding site. This behavior, in turn, is concurrent with the well known 3´ polarity and the decreased binding specificity to the 5´ half site for the hRXR&alpha; monomer. This same pattern impose a lock-and-key mechanisms dependent on the binding of the full dimer. Second, an integrated Small angle X ray scattering and molecular dynamics based structural modeling was used to comprehend the interdomain motions of cellobiohydrolase I of Trichoderma harziannum. We manage to build a refined model for this enzime, with important biotechnological potential. We also provide insights into molecular mechanisms of linker and glycosylation imposed restraints on the orientation and vibrational modes of the full-length enzyme, supporting a mechanism of sliding of on the cellulose surface. This mechanism is fundamental for the high processivity on the hydrolysis of microcrystalline cellulose.

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation. / Three TRIM proteins (TRIpartite Motif), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) and PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), were studied in this thesis. TIF1α is a nuclear receptor coactivator and TIF1β is the universal corepressor of the KRAB-zinc finger repressor family of which, ZNF74 is studied here as a prototypic member. PML functions as a tumor suppressor and is the essential organiser of PML-NBs (PML-Nuclear Bodies) which are very dynamic nuclear macrostructures containing more than 40 proteins. The function of these three TRIM proteins is regulated by sumoylation, a post-translational modification involving the covalent linkage of SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) to specific targets lysine. In this thesis, we propose to develop new methods based on BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) to detect non-covalent nuclear protein interactions but also covalent linkage to SUMO in real time in living cells. To date, BRET was never used to assess non-covalent or covalent nuclear protein interactions. Studying transcriptionally active protein interactions represents a challenge by classical methods in particular when proteins have a tendency to aggregate (TRIM family) or when characterizing nuclear matrix proteins (ZNF74). In the first article, homo- and heterodimerisation of TIF1 α and β as well as their interaction with ZNF74 was assessed by BRET using full length proteins in living mammalian cells. We ascertained the heterodimerisation of TIF1α and β. Whereas ZNF74 interacts strongly with TIF1β, no interaction was detected with TIF1α. However, we unravelled the existence of ternary complexes involving ZNF74, TIF1α and TIF1β. This suggested that a mechanisms for cross-talk between nuclear receptors and KRAB-zinc finger proteins. Thus, we showed that BRET can be advantageously used as a non-transcription-based interaction system for studying transcriptionally active proteins, including nuclear matrix proteins, in living cells. Previous studies have shown that the sumoylation of PML (a tumour suppressor) is involved in its proteasome degradation that is As2O3-inducible and dependent on the polySUMO E3 ubiquitin ligase, RNF4. In the second article, we describe the development of a new application of the BRET method for the detection of covalent and non-covalent interactions with SUMO. Owing to this SUMO BRET assay, we established that the As2O3 / RNF4-mediated degradation of PML, not only depends on PML sumoylation as previously demonstrated, but also on the integrity of its SUMO binding domain. We also demonstrated that As2O3 which increases PML sumoylation, also enhances PML / RNF4 interaction. Our study revealed that most PML SBD non covalent interactions with sumoylated proteins required the phosphorylation of serines within PML SBD that were previously described as target sites for CK2 kinase and involved in PML degradation. Despites the involvement of PML SBD in RNF4-mediated degradation, these serines which function as an SBD phospho-switch, were not required for RNF4-mediated degradation. This suggested that CK2- and RNF4-mediated PML degradation represents two distinct pathways triggering PML ubiquitin / proteasome-dependent degradation. At last, our study led to the hypothesis that the recruitment of sumoylated PML at PML-Nuclear Bodies subnuclear structures via the PML SBD and / or possibly an E3 ubiquitin ligase activity other than RNF4 (PML itself being candidate) may favour PML degradation. Our study also stresses the dynamic involvement of three PML post-translational modifications, phosphorylation, sumoylation and ubiquitination in its degradation. A third article addressing the role of TIF1β sumoylation is presented in the Appendix. We characterized the 6 SUMO targets lysine of TIF1β and demonstrated that sumoylation is required for TIF1β transcriptional repressive activity. This is in part explained by the fact that TIF1β sumoylation is a pre-requisite for histone deacetylases recruitment since TIF1β repressive activity is partly dependent on histone deacetylases. We found that TIF1β sumoylation does not influence its homodimerisation or interaction with the KRAB box of KRAB zinc finger proteins recruiting TIF1β to promoters. TIF1β sumoylation is however relying on the integrity of TIF1β PHD finger and on its self-oligomerisation. Interestingly, we demonstrated that TIF1β sumoylation is positively regulated by its interaction with KRAB domain. It is thus suggested that KRAB-zinc finger proteins recruit TIF1β at DNA promoters where they trigger increase of TIF1β sumoylation and thus enhance its repressive activity.

L’adaptation de l’organisme à son environnement est essentielle à sa survie. L’homéostasie énergétique permet l’équilibre entre les apports, les dépenses et le stockage d’énergie. Un surplus calorique important dérègle ce processus et mène au développement du syndrome métabolique caractérisé, entre autres, par une obésité, un diabète de type II, des maladies cardiovasculaires et des dyslipidémies. La ghréline participe au maintien de l’équilibre énergétique durant le jeûne en stimulant la production de glucose par le foie et le stockage lipidique dans le tissu adipeux. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha, surexprimé en situation de jeûne, est impliqué dans l’induction de la production de glucose par le foie et l’oxydation des acides gras. Notre hypothèse est que ces deux acteurs clés du métabolisme énergétique constituent un axe de régulation commun. Dans cette étude, nous montrons que la ghréline participe à la régulation de PGC-1alpha. Son récepteur GHS-R1a, possédant une forte activité constitutive, est également impliqué de façon indépendante au ligand. GHS-R1a réduit l’activité transcriptionnelle de PGC-1alpha tandis que l’ajout du ligand inverse modérément cette action. L’effet de GHS-R1a corrèle avec l’acétylation de PGC-1alpha qui est fortement augmentée de façon dose-dépendante. La stabilité de PGC-1alpha est également augmentée par le GHS-R1a indépendamment de l’ubiquitine. La ghréline diminue la capacité de PGC-1alpha à lier PPARbeta, un récepteur nucléaire partenaire de PGC-1alpha. De plus, la ghréline réduit, de façon ligand-dépendante, la capacité de coactivation de PGC-1alpha sur PPARbeta dans les hépatocytes. L’ensemble de ces résultats identifie PGC-1alpha comme cible du signal de la ghréline et suggère un axe de régulation ghréline/PGC-1alpha/PPARbeta.Une meilleure compréhension de cet axe de régulation va permettre la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour faire face aux pathologies associées au syndrome métabolique. / The adaptation of an organism to its environment is essential to its survival. Energy homeostasis is defined as the balance between intakes, expenses and storage of energy. An excess of calories disrupts this process and leads to the development of the metabolic syndrome that is characterized by obesity, type II diabetes, cardiovascular diseases and dyslipidemia. During fasting, ghrelin participates in the maintenance of energy balance by stimulating hepatic production of glucose and lipid storage in adipose tissue. The transcriptional coactivator PGC-1alpha is overexpressed in the liver during fasting and is involves in the induction of the hepatic glucose production and fatty acid oxidation. Our hypothesis is that these two key performers in the energy metabolism constitute a common axis control. In this study, we show that ghrelin plays a role in the regulation of PGC-1alpha. The ghrelin receptor GHS-R1a is also involved because of its strong constitutive activity in absence of ligand. We found that GHS-R1a inhibited PGC-1alpha transcriptional activity whereas adding ghrelin to cells moderated this effect. PGC-1alpha activation by GHS-R1a correlated with a dose-dependent increase of PGC-1alpha acetylation. The stability of PGC-1alpha was also increased by ghrelin receptor in a manner involving the ubiquitin-independent proteasome pathway. Ghrelin decreased the ability of PGC-1alpha to bind to PPARbeta, one of its nuclear receptor partners. Furthermore, ghrelin decreased the ability of PGC-1alpha to coactivate PPARbeta in a ligand-dependent manner in hepatocytes. Together, these results identify PGC-1alpha as a metabolic target of GHSR-1a signaling and defines a new regulatory axis involving ghrelin/PGC-1alpha/PPARbeta in hepatocytes. A better understanding of this regulation axis will provide novel aspects in therapeutic targeting of diseases associated with the metabolic syndrome.