No description available.

Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC), which accounts for 80% of all lung cancer cases, is associated with resistance to chemotherapy and poor prognosis. Exploitation of NSCLC-upregulated pathways that can either be targeted by novel therapeutics or used to improve the tumour-delivery of current chemotherapeutics are required. Among the matrix metalloproteinases (MMPs) that are essential for tumour development, MMP10 is a potential candidate as a therapeutic target based on its expression and contribution to NSCLC development. This research aims to explore the expression and functions of MMP10 in the tumour microenvironment of NSCLC and evaluate the potential of MMP10 as a target for therapeutic intervention. Herein, MMP10 expression at gene and protein levels were analysed in a panel of NSCLC cell lines using RT-PCR and Western blotting analysis. To determine MMP10 functional relevance, an in vitro angiogenesis assay using cell conditioned media was carried out. To identify specific peptide sequences for the design of prodrugs rationalised to be MMP10 activated, in vitro substrate cleavage studies were performed using a mass spectrometry approach to differentiate between MMP10 and the structurally similar MMP3. This study demonstrates that MMP10 is highly expressed in NSCLC and that high levels of MMP10 are associated with induction of angiogenesis, a crucial process supporting tumour growth. In addition to the achievement of having been able to differentiate between closely similar MMP3 and MMP10 through carefully monitoring the hydrolysis rate of compound 444259 (a known MMP substrate), data generated herein provides the basis for further studies to exploit MMP10 as a prodrug-activator. / Full text was made available at the end of the embargo period, 12th Dec 2019

Microfluidics is a versatile tool with many applications in biology. Its ability to manipulate small volumes of liquid precisely has led to the development of many microfluidic assay platforms. They could handle small amounts of samples and carry out analysis with high sensitivity and throughput. Microfluidic assays have provided new insights into scarce biological samples at higher resolution. In this thesis, we developed microfluidic tools to conduct low input ChIP-seq and ChIRP-seq. We applied them to a variety of samples profiling different targets. The native MOWChIP-seq platform was developed to map RNA polymerase II, transcription factors and histone deacetylase binding in 1,000-50,000 cells. We examined mouse prefrontal cortex and cerebellum using this technology. We found extensive differences that correlated with distinct neurological functions of the brain regions. The same platform and workflow were used to profile five key histone modifications in human lung tumor and normal tissue samples. Integrative analysis with gene expression data revealed extensive chromatin remodeling in lung tumor. Spatial histone modification mapping was conducted in mouse neocortex in a similar fashion. We generated an epigenomic tomography that demonstrated the molecular state of the brain in 3D. Lastly, we developed a microfluidic version of the ChIRP-seq process which successfully conducted the assay using only 500K cells. This improvement makes ChIRP-seq in tissue samples feasible. / Doctor of Philosophy / Microfluidics is a type of technology that can control small volumes of liquid in a miniature system. It can carry out reactions on very small scales with higher precision and sensitivity than conventional methods. Microfluidics has found many uses in the field of biology, especially dealing with samples available in limited quantities. These low input microfluidic platforms have helped researchers gain new knowledge on many complex questions. In this thesis, we developed microfluidic tools to carry out low input ChIP-seq and ChIRP-seq. These are two established techniques used to map where certain targets are located on the genome of an organism. These targets include specific chemical modifications to the wrapper protein of DNA (histone modification), proteins that take part in transcription and expression of genes (RNA polymerase II, transcription factors) and other molecules. Our nMOWChIP-seq system removed the need for fixation by chemicals. It was able to examine RNA polymerase II, transcription factors and other enzymes using 1,000-50,000 cells. Traditional ChIP-seq requires more than 10 million cells and time-consuming chemical treatment steps. Our technology greatly improved sensitivity and ease of use. We also used this platform to test five important histone modifications in human lung tumors and healthy tissues. We constructed a spatial map of histone modification in mouse brain by analyzing slices of the cortex. Finally, we developed a microfluidic version of ChIRP-seq process to map locations of long non-coding RNAs in cultured human cells. The cells needed for a successful test were reduced to 500K from 20 million of the original workflow.

[ES] A pesar de los nuevos avances en el tratamiento del cáncer de pulmón, su tasa de incidencia y mortalidad siguen en cabeza en todo mundo. Concretamente, el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa casi el 85% de todos los cánceres de pulmón, siendo su supervivencia a 5 años muy reducida. En base a dicho escenario, el objetivo principal de este trabajo es el de caracterizar de manera exhaustiva los exosomas secretados por las células del CPNM. Se sabe que estas microvesículas están involucradas en números procesos celulares, por lo que pueden contener gran cantidad de información acerca de las características moleculares del tumor. Para ello se han empleado cultivos primarios y líneas comerciales crecidas en diferentes condiciones, así como muestras de sangre periférica obtenida de los pacientes con CPNM. Un primer screening llevado a cabo en los exosomas secretados in vitro, ha permitido obtener un gran número de mRNAs y miRNAs relacionados con diferentes procesos biológicos y vías de señalización. Además, algunos genes como FDFT1 y SNAI1 han destacado por su sobreexpresión en exosomas procedentes de las células crecidas en formación de tumoresferas (modelos 3D), las cuales están enriquecidas en población de células madre tumorales. A su vez, otros marcadores presentes en el interior de estas microvesículas, se han mostrado relacionados con dos de los subtipos histológicos más frecuentes: adenocarcinoma (LUAD) y carcinoma escamoso (LUSC). Posteriormente, para validar los hallazgos obtenidos en exosomas, los marcadores más significativos fueron analizados in silico en una cohorte de muestras de tejido, compuesta por 661 pacientes con CPNM (TCGA database). Estos resultados han revelado una asociación entre la expresión del gen SNAI1 y la supervivencia de estos pacientes (OS y RFS p<0.05). Además, los genes XAGE1B, SEPP1 y TTF-1 (previamente determinados en exosomas), mantienen una relación significativa con el grupo de pacientes LUAD; mientras que CABYR, RIOK3 y CAPRIN1 se mantienen sobrexpresados en LUSC (Mann-Whitney test p<0.05). Estos marcadores también se han analizado en una cohorte de 186 pacientes con CPNM procedentes del Hospital General Universitario de Valencia, donde se corroboró la asociación de SNAI1 con la supervivencia de los pacientes en estadios tempranos (RFS en pacientes LUAD, p<0.05), así como la sobreexpresión de CABYR y RIOK3 en pacientes LUSC, y de XAGE1B y TTF-1 en LUAD. Por otra parte, el aislamiento de los exosomas presentes en la sangre periférica de pacientes en estadios avanzados, ha permitido identificar otros marcadores asociados a caracterísiticas clínico-patológicas relevantes. A su vez, el contenido de estas microvesículas ha sido empleado para la detección de mutaciones génicas ligadas al manejo clínico del CPNM. En resumen, los resultados obtenidos en este trabajo ponen de manifiesto el potencial de los exosomas como fuente de biomarcadores para el estudio de las diferentes etapas de desarrollo del CPNM. Estas microvesículas ofrecen una visión completa y en tiempo real, de las características de la enfermedad, pudiendo ser aisladas de forma repetida y mediante técnicas mínimamente invasivas. / [CA] A pesar dels avanços recents en el tractament del càncer de pulmó, les seues taxes d'incidència i mortalitat continuen sent altes a nivell mundial. Concretament, el càncer de pulmó de cèl·lules no petites (CPNM) representa gairebé el 85% de tots els càncers de pulmó, amb una taxa de supervivència a 5 anys molt limitada. Donat aquest escenari, l'objectiu principal d'aquest estudi és caracteritzar de manera exhaustiva els exosomes secretats per les cèl·lules de CPNM. Aquestes microvesícules estan involucrades en nombrosos processos tumorals i poden contenir una gran quantitat d'informació sobre les característiques moleculars de la malaltia. Per aconseguir-ho, es van utilitzar cultius primaris i línies cel·lulars (cultiu en diferents condicions), juntament amb mostres de sang perifèrica obtingudes de pacients amb CPNM. Un cribratge inicial en exosomes secrets in vitro va permetre identificar una quantitat significativa de mARNs i miARNs relacionats amb diversos processos biològics i vies de senyalització. A més, alguns gens com FDFT1 i SNAI1 van destacar per la seua sobreexpressió en exosomes derivats de cèl·lules crescuts en formació de tumorsferes (models 3D), que estan enriquides en poblacions de cèl·lules mare tumorals. A més, s'han trobat marcadors en aquestes microvesícules associats amb dos dels subtipus histològics més comuns: adenocarcinoma (LUAD) i carcinoma escamós (LUSC). Posteriorment, per validar els resultats obtinguts en exosomes, es van analitzar in silico els marcadors més significatius en una cohort de teixit de CPNM de la base de dades TCGA. Aquests resultats van revelar una associació entre l'expressió del gen SNAI1 i la supervivència dels pacients (OS i RFS, p <0,05). A més, l'expressió dels gens XAGE1B, SEPP1 i TTF-1 (prèviament identificats en exosomes) va mantenir una relació significativa amb el grup LUAD, mentre que CABYR, RIOK3 i CAPRIN1 van continuar sobreexpressats en els pacients de LUSC (prova de Mann-Whitney, p <0,05). Aquests marcadors també es van analitzar en una cohort de 186 pacients amb CPNM de l'Hospital General Universitari de València, on es va confirmar l'associació de l'expressió de SNAI1 i la supervivència dels pacients en estadi precoç (RFS en pacients de LUAD, p <0,05), així com la sobreexpressió de CABYR i RIOK3 en pacients de LUSC, i de XAGE1B i TTF-1 en LUAD. D'altra banda, els exosomes presents en mostres de sang de la cohort d'estadis avançats van permetre la identificació d'altres biomarcadors associats a característiques clíniques rellevants dels pacients. A més, la càrrega exosomàtica també es va utilitzar per detectar mutacions genètiques relacionades amb el tractament clínic del CPNM. En resum, els resultats obtinguts en aquesta tesi destaquen el potencial dels exosomes com a font de biomarcadors per a l'estudi de les diferents etapes del desenvolupament del CPNM. Aquestes microvesícules ofereixen una visió completa i en temps real de les característiques moleculars de la malaltia i poden ser obtingudes de manera repetida i amb una mínima invasió. / [EN] Despite recent advancements in lung cancer treatment, its incidence and mortality rates remain high worldwide. Specifically, non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for nearly 85% of all lung cancers, with a 5-year survival rate of 20%. Given this scenario, the primary objective of this study is to comprehensively characterize the exosomes secreted by NSCLC cells. These microvesicles are known to be involved in numerous tumoral processes, potentially containing a wealth of information about the molecular characteristics of the disease. To achieve this, primary cultures and cell lines, along with peripheral blood samples obtained from NSCLC patients were used. An initial screening in exosomes secreted in vitro allowed the identification of a significant number of mRNAs and miRNAs, related to various biological processes and signaling pathways. Moreover, some genes such as FDFT1 and SNAI1 stood out due to their overexpression in exosomes derived from cells grown in tumorspheres formation (3D models), which are enriched in cancer stem cell population. Additionally, markers found within these microvesicles were associated with two of the most common histological subtypes: adenocarcinoma (LUAD) and squamous cell carcinoma (LUSC). Subsequently, to validate the findings seen in exosomes, the most significant markers were analyzed in silico in an NSCLC tissue cohort from the TCGA database. These results revealed an association between the expression of SNAI1 and patient survival (OS and RFS, p<0.05). Furthermore, XAGE1B, SEPP1, and TTF-1 expression (previously identified in exosomes) maintained a significant relationship with the LUAD group, while CABYR, RIOK3, and CAPRIN1 remained overexpressed in LUSC patients (Mann-Whitney test, p<0.05). These markers were also analyzed in a cohort of 186 NSCLC patients from the University General Hospital of Valencia. The association of SNAI1 expression and the survival of early-stage patients (RFS in LUAD patients, p<0.05) was confirmed, as well as the overexpression of CABYR and RIOK3 in LUSC patients, and of XAGE1B and TTF-1 in LUAD. Furthermore, exosomes present in blood samples of the advanced-stage cohort, allowed the identification of other biomarkers associated with clinically relevant characteristics of the patients. Moreover, exosomal cargo was also used to detect gene mutations related to the clinical management of NSCLC. In summary, the results obtained in this thesis highlight the potential of exosomes as a source of biomarkers for the study of the different stages of NSCLC development. These microvesicles offer a comprehensive and real-time view of the disease's molecular features and can be obtained repeatedly and in a minimally invasive way. / Duréndez Sáez, ME. (2024). Liquid Biopsy in non-small cell lung cancer: exosomes as a tool for the study of biomarkers [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203438

No description available.

Les néoplasies pulmonaires demeurent la première cause de décès par cancer au Québec représentant près de 6000 décès par année. Au cours des dernières années, la radiothérapie stéréotaxique d’ablation (SABR) s’est imposée comme un traitement alternatif à la résection anatomique pour les patients inopérables atteints d’un cancer pulmonaire non à petites cellules de stade précoce. Il s’agit d’une modalité de traitement qui permet d’administrer des doses élevées, typiquement 30-60 Gy en 1-8 fractions, dans le but de cibler précisément le volume de traitement tout en épargnant les tissus sains. Le Centre Hospitalier de l’Université de Montréal s’est muni en 2009 d’un appareil de SABR de fine pointe, le CyberKnife™ (CK), un accélérateur linéaire produisant un faisceau de photons de 6 MV dirigé par un bras robotisé, permettant d’administrer des traitements non-coplanaires avec une précision infra-millimétrique. Ce mémoire est dédié à la caractérisation de certains enjeux cliniques et physiques associés au traitement par CK. Il s’articule autour de deux articles scientifiques revus par les pairs. D’une part, une étude prospective clinique présentant les avantages de la SABR pulmonaire, une technique qui offre un excellent contrôle tumoral à long terme et aide au maintien de la qualité de vie et de la fonction pulmonaire. D’autre part, une étude de physique médicale illustrant les limites de l’acquisition d’images tomodensitométriques en auto-rétention respiratoire lors de la planification de traitement par CK. / Lung neoplasia remains the leading cause of cancer death accounting for nearly 6,000 deaths per year in Quebec. In recent years, stereotactic ablative radiotherapy (SABR) has emerged as an alternative treatment to anatomical resection for inoperable patients suffering from early stage non-small cell lung cancer. This technique can deliver highly focused doses such as 30-60 Gy in 1-8 fractions in order to target precisely the treatment volume while sparing healthy tissue. In 2009, the Centre Hospitalier de l’Université de Montréal acquired a robotic SABR apparatus, the CyberKnife™ (CK), a linear accelerator mounted on a moving arm producing non-coplanar photon beams of 6 MV with millimetric precision. This thesis presents two scientific peer reviewed articles adressing some clinical and physical challenges with CK. On one hand, a clinical prospective study reporting the advantages of lung SABR, a technic that offers excellent long-term tumor control and helps maintain the quality of life and lung function. On the other hand, a medical physics study exposing the limits of computed tomography scan acquisition in breath-holding for CK treatment planning.

Immunogenic cell death (ICD) is characterized by presence of specific molecules including surface exposed calreticulin (CRT) and the heat shock proteins HSP70 and HSP90. Release of ATP and high- mobility group box protein 1 (HMGB1) belongs to other typical characteristics. For induction of ICD in lung cancer cells high-hydrostatic pressure (HHP) was used. Treatment by HHP induces expression of immunogenic markers CRT, HSP70 and HSP90 on the cell surface. HHP also induces secretion of ATP to the extracellular milieu. Dendritic cells (DC) pulsed with HHP-treated tumor cells showed fenotypic maturation characterized by upregulation of maturation molecule CD83, costimulation molecules CD80 and CD86, chemokine receptor CCR7 and MHC class II molecule HLA-DR. Pulsed DCs have also higher rate of phagocytosis of HHP-treated tumor cells and they induce lower numbers of regulatory T cells compared to immature DCs. Moreover, activation of caspases (-8, -9, -3) and other proteins (phosphorylation of eIF2α) which are crucial in ER-stress mediated apoptotic pathway, was observed after HHP treatment. Using wide range of methods it was confirmed that HHP treatment is able to induce ICD in lung cancer cell lines, fenotypic and functional characteristics were described and the decreased induction of regulatory T-lymphocytes...

Introduction Le cancer bronchique est un problème de santé publique en étant la première cause de décès par cancer dans le monde. Il reste de mauvais pronostic avec une résistance au Cisplatine qui est inéluctable dans l’histoire naturelle de la maladie. Nous nous sommes intéressés à l’association du CDDP aux inhibiteurs de la Poly(ADP-ribose) polymérase. Les inhibiteurs pharmacologiques de PARP sont source d’optimisme en oncologie clinique en monothérapie pour des tumeurs déficientes pour une voie de réparation de l’ADN et en association aux cytotoxiques classiques.Matériel et méthodes Nous avons généré 9 clones résistants au CDDP après culture de la lignée A549 dans des faibles doses de CDDP. Deux inhibiteurs pharmacologiques de PARP, CEP8983 (CEP) et PJ34 (PJ), ainsi que des siRNA spécifiques de PARP1 sont utilisés pour l’inhibition de PARP. L’apoptose est mesurée en cytométrie de flux par l’intermédiaire du potentiel membranaire de la mitochondrie DiOC6(3) et la perméabilisation de la membrane plasmique est évaluée par l’iodide de propidium. Le test de clonogénicité permet d’évaluer la capacité des cellules à échapper à la mort et à former une colonie. L’activité métabolique des cellules est mesurée par la mesure de clivage du sel de tetrazolium WST-1. L’immunofluorescence sur cellules fixées a permis d’étudier les dommages de l’ADN (γH2AX), la voie intrinsèque de l’apoptose (l’activation de la caspase 3 et la libération du cytochrome c) et la recombinaison homologue (BRCA1, RAD51). En Western Blot nous avons mesuré l’expression et l’activité de PARP (PAR) ainsi que l’expression d’acteurs de la réparation par excision de base (BER) (XRCC1 and polymérase β). Nous avons développé une méthode de détection de PAR en immunohistochimie sur des tissus inclus en paraffine. Résultats Nous avons trouvé un effet synergique pour l’association du CDDP aux inhibiteurs de PARP in vitro. De façon inattendue nous avons observé que les clones résistants au CDDP développent une addiction à PARP et sont spécifiquement tués par l’inhibition de PARP contrairement à la lignée parentale. Ces clones exhibent une hyperexpression et une hyperactivité de PARP. La réponse aux inhibiteurs de PARP corrèle plus précisément avec l’activation plutôt qu’avec l’expression de PARP, pointant que PAR est un biomarqueur plus précis que PARP. Nous avons observé que l’hyperactivation de PARP accompagne une résistance induite au CDDP et prédispose à une sensibilité aux inhibiteurs de PARP dans d’autres lignées de cancer bronchique (H460 et H1650), de mésothéliome (P31), de cancer de l’ovaire (TOV112D) et de col (HeLa). Dans des expériences in vivo nous avons noté que dans les xénogreffes obtenues à partir de clones résistants au CDDP, l’expression de PAR est stablement retrouvée en immunohistochimie. Ces tumeurs répondaient à l’inhibition de PARP par le PJ en diminuant l’expression de PAR. Les clones résistants au CDDP sensibilisés aux I PARP ont une recombinaison homologue conservée, cependant ont un déficit dans les étapes terminales du BER.Conclusion Nous avons identifié un effet synergique pour l’association des inhibiteurs de PARP au CDDP de des lignées de cancer bronchique. Nous avons observé une dépendance à PARP dans des lignées de cancer bronchique résistantes au CDDP et déficientes pour l’élongation du BER. Nous postulant que PAR est un biomarqueur spécifique de la réponse aux inhibiteurs de PARP. / Introduction Driven by the facts that non small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer-related morbidity and mortality worldwide and that NSCLC patients often develop resistance against Cisplatin (CDDP)-based therapies, we addressed the question of the combination therapy of CDDP with poly(ADP-ribose) polymerases (PARP) inhibitors. Inhibitors of PARP have raised great expectations for the treatment of a variety of cancers, either as monotherapeutic agent against DNA repair-deficient tumours or combined to DNA-damaging compounds.Material and methods We generated nine CDDP-resistant clones by prolonged exposure to low dose CDDP of the A549 NSCLC parental cell line. Two distinct PARP inhibitors, CEP8983 (CEP) and PJ34 (PJ) as well as PARP1 knockdown with small interfering RNAs (siRNAs) were used for PARP inhibition. Apoptosis was measured by the simultaneous assessment for the loss of the mitochondrial transmembrane potential (m) and the breakdown of the plasma membrane using the m-sensitive fluorochrome DiOC6(3) and the vital dye propidium iodide, respectively. Moreover clonogenic survival was assessed. In vitro assessments of the enzymatic activity of cells were based on the reduction of the colorless tetrazolium salt. Immunofluorescence microscopy determinations were performed with antibodies specific for DNA damage (γH2AX), intrinsic apoptosis (cleaved Caspase-3 and cytochrome c), and homologous recombination (RAD51 and BRCA1). Immunoblotting was assed for PARP1 expression and activity (PAR) and base excision repair (BER) effectors (XRCC1 and polymerase β). We developed an immunohistochemical staining method that specifically detects PAR on paraffin-embedded cell pellets and tissue sections.Results We found that PARP inhibitors and PARP1 siRNAs synergized with CDDP in the killing of NSCLC cells in vitro. Unexpectedly, CDDP-resistant NSCLC cell clones developed addiction to PARP hyperactivation, thereby becoming susceptible to apoptosis induction by PARP inhibition. We showed that these cisplatin-resistant clones, exhibited high PARP protein levels and increased PARP activity, leading to an increased poly-ADP ribosylation of cellular proteins, as compared to their parental, cisplatin-sensitive counterparts. These cisplatin-resistant cells become susceptible to cell death as induced by PARP inhibition, correlating with the hyperactivity of PARP (elevated PAR levels) more accuratly than with the overexpression of PARP. Suggesting that PAR levels may constitute a more accurate biomarker than PARP to predict the sensitivity of cells to PARP inhibition. We expanded the observation that cisplatin resistance causes PARP upregulation and hyperactivation and subsequent sensitization to PARP inhibition to additional five human cancer cell lines including two NSCLC (H1650 and H460), one mesothelioma (P31), one ovarian (TOV112D) and one cervical cancer (HeLa) cell line. To get further insight into this issue, we generated in vivo experiments. Tumors derived from CDDP-resistant cells were characterized by elevated levels of PAR suggesting that PAR levels are preserved during tumor formation. Those PAR-overexpressing tumors responded to the administration of PJ in vivo with a consistent reduction in PAR immunoreactivity. CDDP resistant clones that are specifically killed by PARP inhibitors assessed efficient homologous recombination repair however deficient BER elongation.Conclusion We showed a beneficial effect for the association therapy of PARP inhibitors with CDDP in several NSCLC cell lines. We have identified an addiction to PARP in CDDP resistant cell lines with deficient BER elongation. We postulate that PAR is a specific predictive biomarker for the response to PARP inhibitors.

Contexte. Le cancer bronchopulmonaire (CBP) demeure la première cause de mortalité par cancer dans le monde. Malgré l’espoir suscité par le développement des thérapies ciblées, son pronostic demeure sombre, particulièrement dans les cas de CBP à petites cellules (CBP-PC) et de CBP non à petites cellules (CBP-NPC) présentant une activation de l’oncogène KRAS. Matériel et Méthodes. Nous avons mené 3 études successives, visant à (i) radiosensibiliser des modèles de CBP-PC par l’ajout d’un inhibiteur de BCL2, (ii) cibler des modèles de CBP-NPC mutés KRAS par l’association d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de RAF, et (iii) créer un modèle préclinique orthotopique murin de CBP reproduisant la progression tumorale observée en clinique. Résultats. Dans la première étude, l’inhibiteur de BCL2 oblimersen a présenté un effet radiosensibilisant sur des modèles de CBP-PC, in vitro et in vivo. Dans la seconde étude, l’association de l’inhibiteur de mTOR everolimus et de l’inhibiteur de RAF/VEGFR RAF265 a présenté un effet synergique sur des lignées cellulaires de cancers présentant la double mutation de KRAS et de PIK3CA, in vitro et in vivo. Dans la troisième étude, l’injection orthotopique d’une lignée bioluminescente de CBP-NPC chez des souris nude a permis d’établir des tumeurs intra pulmonaires évoluant vers une extension métastatique ganglionnaire et hématogène, et de détecter la présence de cellules tumorales circulantes. Conclusion. L’association d’un inhibiteur de BCL2 à la radiothérapie est une stratégie intéressante dans le CBP-PC, l’association d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de RAF/VEGFR est une stratégie intéressante dans le CBP-NPC présentant une double mutation KRAS-PIK3CA, mais ces données doivent être confirmées sur des modèles orthotopiques afin de gagner en pertinence avant d’envisager un transfert en clinique. / Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer-related mortality worldwide. Activation of phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-AKT and Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue (KRAS) can induce cellular immortalization, proliferation, and resistance to anticancer therapeutics such as epidermal growth factor receptor inhibitors or chemotherapy. This study assessed the conséquences of inhibiting these two pathways in tumor cells with activation of KRAS, PI3K-AKT, or both. We investigated whether the combination of a novel RAF/vascular endothelial growth factor receptor inhibitor, RAF265, with a mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor, RAD001 (everolimus), could lead to enhanced antitumoral effects in vitro and in vivo. To address this question, we used cell lines with different status regarding KRAS, PIK3CA, and BRAF mutations, using immunoblotting to evaluate the inhibitors, and MTT and clonogenic assays for effects on cell viability and proliferation. Subcutaneous xenografts were used to assess the activity of the combination in vivo. RAD001 inhibited mTOR downstream signaling in all cell lines, whereas RAF265 inhibited RAF downstream signaling only in BRAF mutant cells. In vitro, addition of RAF265 to RAD001 led to decreased AKT, S6, and Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 phosphorylation in HCT116 cells. In vitro and in vivo, RAD001 addition enhanced the antitumoral effect of RAF265 in HCT116 and H460 cells (both KRAS mut, PIK3CA mut); in contrast, the combination of RAF265 and RAD001 yielded no additional activity in A549 and MDAMB231 cells. The combination of RAF and mTOR inhibitors is effective for enhancing antitumoral effects in cells with deregulation of both RAS-RAF and PI3K, possibly through the cross-inhibition of 4E binding protein 1 and S6 protein. We then focus on animal models. Preclinical models of NSCLC require better clinical relevance to study disease mechanisms and innovative therapeutics. We sought to compare and refine bioluminescent orthotopic mouse models of human localized NSCLC. Athymic nude mice underwent subcutaneous injection (group 1-SC, n = 15, control), percutaneous orthotopic injection (group 2-POI, n = 30), surgical orthotopic implantation of subcutaneously grown tumours (group 3-SOI, n = 25), or transpleural orthotopic injection (group 4-TOI, n = 30) of A549-luciferase cells. Bioluminescent in vivo imaging was then performed weekly. Circulating tumour cells (CTCs) were searched using Cellsearch® system in SC and TOI models Group 2-POI was associated with unexpected direct pleural spreading of the cellular solution in 53% of the cases, forbidding further evaluation of any localized lung tumour. Group 3-SOI was characterized by high perioperative mortality, initially localized lung tumours, and local evolution. Group 4-TOI was associated with low perioperative mortality, initially localized lung tumours, loco regional extension, and distant metastasis. CTCs were detected in 83% of nude mice bearing subcutaneous or orthotopic NSCLC tumours. Transpleural orthotopic injection of A549-luc cells in nude mouse lung induces localized tumour, followed by lymphatic extension and specific mortality, and allowed the first time identification of CTCs in a NSCLC mice model.

L’efficacité de la chimiothérapie contre la croissance tumourale repose sur l'induction d'une mort des cellules tumourales dite immunogène. Les cellules tumourales mourantes agissent alors comme un vaccin thérapeutique en stimulant une réponse immunitaire anti-tumourale capable de contrôler, voire d'éliminer, les cellules cancéreuses résiduel. Les trois marqueurs principales de la mort cellulaire immunogène (MCI), sont (i) l'exposition pré-apoptotique de la calréticuline (CRT) à la surface des cellules, (ii) la sécrétion de l'ATP pendant l'apoptose qui dépend du processus d'autophagie, et (iii) le relargage post-apoptotique de la protéine non-histone de fixation à la chromatine HMGB1 (High Mobility Group B1). CRT, ATP et HMGB1 se lient respectivement à CD91, au récepteur purinergique P2RX7 (Purinergic Receptor P2X, ligand-gated ion channel 7) et au récepteur TLR4 (Toll-like Receptor 4) situés à la surface des cellules dendritiques. En retour, ces interactions initient respectivement la phagocytose des cellules mourantes, la production de l'interleukine-1β et la cross-présentation des antigènes tumouraux aux lymphocytes T.Notre laboratoire a précédemment démontré que la chimiothérapie adjuvante présente une efficacité réduite chez des patients atteints de cancers colorectaux et du sein portant un polymorphisme d'un seul nucléotide ou SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) compromettent la fonction des gènes P2RX7 et TLR4, notamment rs3751143 (496Glu>Ala) pour le gène P2RX7 et rs4986790 (299Asp>Gly) pour le gène TLR4.Compte tenu des ces résultats que mettent en évidence la relation étroite entre l’efficacité de la chimiothérapie anticancéreuse et un système immunitaire opérationnel, nous avons décidé d'étudier l'effet de ces SNPs, soit sur la survie globale soit sur la survie sans événement, chez des patients atteints de cancer pulmonaire non à petites cellules ou NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) et de cancers de la tête et du cou ou HNSCC (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma). De plus, nous avons porté notre attention sur un autre SNP affectant le gène ATG16L1 (Autophagy-related 16-Like 1), notamment rs2241880 (300Thr>Ala) qui compromet l’activité d’un gène fondamental dans le processus d’autophagie.Dans les cancers NSCLC, les allèles mutants "perte de fonction" des gènes ATG16L1, P2RX7 et TLR4 n'affectent pas la survie globale, indépendamment du type de chimiothérapie administrée. Au contraire, les patientes atteintes de HNSCC, portant au moins un allèle "perte de fonction" d’ATG16L1 et TLR4, présentent un taux de survie sans récidive inferieure par rapport aux patients qui présentent un genotype sauvage. Ce travail décrit pour la première fois un biomarqueur prognostique pour ce type de cancer.De plus, nous avons pu définir, par génotypage à haut débit, une signature de SNPs prédictive de la réponse à la chimiothérapie neoadjuvantes à base d'anthracyclines et des taxanes chez les patients atteints de cancer du sein. En particulier, la combinaison des deux paramètres clinicopathologiques classiques (âge lors du diagnostic et récepteur aux œstrogènes) avec les génotypes rs1076669 du gène ECE1 (Endothelin Converting Enzyme 1; 341Thr>Ile) et rs2277413 du gène PZP (Pregnancy-Zone Protein; 813Val>Ala) a permis de définir trois grandes catégories des patients et leur probabilité respective d'atteindre la réponse complète pathologique après traitement.L'identification de nouveaux biomarqueurs associés à une absence/diminution de réponse à la chimiothérapie apparaît critique pour choisir des alternatives thérapeutiques appropriées et éviter les effets secondaires indésirables chez les non-répondeurs. / Successful chemotherapeutics can induce a type of tumour cell death that is immunogenic, implying that patient’s dying cancer cells function as a therapeutic vaccine and elicit an anti-tumour immune response that controls the residual disease. The three main hallmarks of immunogenic cell death (ICD) are the pre-apoptotic exposure of calreticulin (CRT) on the cell surface, the autophagy-dependent secretion of ATP during the blebbing phase of apoptosis and the post-apoptotic release of the chromatin-binding non-histone protein high mobility group B1 (HMGB1). CRT, ATP and HMGB1 interact with CD91, purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel, 7 (P2RX7) and Toll-like receptor 4 (TLR4), respectively, on the surface of dendritic cells (DCs), thus promoting the engulfment of dying cells, the production of IL-1β and the cross-presentation of tumour-associated antigens to T cells, respectively.Our laboratory has demonstrated that adjuvant chemotherapy exhibits a reduced efficacy in breast and colorectal cancer patients bearing single-nucleotide polymorphisms (SNPs) that compromise the function of P2RX7 or TLR4, such as rs3751143 in P2RX7 (Glu496Ala) and rs4986790 in TLR4 (Asp299Gly).Driven by these results, underpinning the intimate relationship between the success of anti-cancer chemotherapy and an operational immune system, we decided to investigate the effect of these SNPs on disease outcome among non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients. Additionally, we focused our attention on a SNP in autophagy related 16-like 1 (ATG16L1), namely rs2241880 (Thr300Ala), which compromises the activity of one pivotal autophagic gene. In NSCLC patients, loss-of-function ATG16L1, P2RX7 and TLR4 alleles do not affect overall survival, irrespective of the administration and type of chemotherapy. Conversely, HNSCC patients bearing at least one loss-of-function ATG16L1 or TLR4 allele exhibit a reduced disease-free survival when compared to their wild-type counterparts. This is the first report highlighting a putative prognostic biomarker for this malignancy. Furthermore, taking advantage of a high throughput genotyping study, we delineated a SNP-based signature that predicts the response of breast cancer patients to anthracycline- and taxane-based neoadjuvant chemotherapy. Particularly, the combination of two classical clinicophatological parameters (age at diagnosis and estrogen receptor) and genotype at the ECE1 (rs1076669 Thr341Ile) and PZP (rs2277413 Val813Ala) loci allowed us to define three broad categories with a correspondent probability of achieving pathological complete response. The identification of new biomarkers associated with a reduced/absent response to chemotherapy appears critical for selecting appropriate therapeutic alternatives, and avoiding undesired side effects among non-responders.