Für das Rett Syndrom, eine der häufigsten genetischen Ursachen für mentale Retardie-rung bei Frauen, gibt es bisher keine kausale Therapie, obwohl gentherapeutische Studi-en mit konditionellen knockout Mäusen gezeigt haben, dass es sich um eine therapierbare Erkrankung handelt. Um neue Therapien entwickeln zu können, werden Mausmodelle benötigt, die auf den beim Menschen am häufigsten gefundenen Mutation beruhen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Mausmodell mit der häufigsten humanen Nonsense-Mutation R168X im Mecp2 Gen charakterisiert. Mit Hilfe dieses Mausmodells wurden dann die Therapieansätze der „Stop-Codon Readthrough-Therapie“ und einer Knochenmarktransplantation auf ihre Wirksamkeit in vitro und in vivo untersucht. Die Charakterisierung der Mauslinie zeigte, dass männliche MeCP2R168X-Mäuse im Gegensatz zu anderen MeCP2-Mausmodellen kein verkürztes MeCP2 Protein exprimieren. Desweiteren weisen männliche MeCP2R168X-Mäuse einen Phänotyp, inklu-sive der drastisch verkürzten Lebenspanne, auf, wie er bei bereits etablierten Mausmo-dellen für das Rett Syndrom beschrieben wurde. Dagegen zeigten weibliche, heterozy-gote MeCP2R168X-Mäuse nur einen sehr mild ausgeprägten Phänotyp verglichen mit bereits etablierten MeCP2-Mauslinien. Für die „Stop-Codon Readthrough-Therapie“ wurde die Effizienz der Aminoglykoside Geniticin, Gentamicin und Neomycin, der Komponenten NB54, NB84 und NB124, sowie der niedermolekularen Substanz PTC124 auf ihre Wirksamkeit bei der Induktion eines Readthroughs mit transfizierten HeLa-Zellen und MeCP2R168X/y-Mausohrfibroblasten in vitro untersucht. Dabei zeigte sich eine deutliche Steigerung der Readthrough-Effizienz der NB-Komponenten, gemessen an der detektierbaren Menge an MeCP2, mit zunehmender Generation (NB54 --> NB84 --> NB124) und gegenüber dem klinisch angewandten Gentamicin. Während die Behandlung mit Neomycin zu einem minimalen Readthrough-Produkt führte, zeigte die Behandlung mit PTC124 kei-nen messbaren Readthrough. Anschließend wurden männliche MeCP2R168X-Mäuse mit den in vitro getesteten Sub-stanzen, mit Ausnahme von Geniticin, behandelt. Die Expression eines MeCP2-Proteins voller Länge konnte durch keine der applizierten Substanzen induziert werden. Auch bei Behandlungen über einen längeren Zeitraum mit hohen Dosierungen, im Fall von Gentamicin nahe der LD50-Dosis und nachweisbarer intrazellulärer Aufnahme, konnte in den behandelten Tieren weder ein verkürztes noch ein MeCP2 Protein nativer Länge detektiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass für die „Stop-Codon Readthrough-Therapie“ für das Rett Syndrom neue Komponenten entwickelt werden oder andere Applikationswege gewählt werden müssen, da mit den derzeit verfügbaren Substanzen kein therapeutischer Erfolg erzielt werden kann. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Theorie einer gestörten Phagozytose MeCP2-defizienter Mikroglia, sowie die Therapie von MeCP2-defizienten Mäusen durch eine Knochenmarktransplantation überprüft. Dabei konnte weder in vitro noch in vivo eine Veränderung der Phagozytoseaktivität der MeCP2-defizienten Mikroglia nachgewiesen werden, wie sie von Derecki und Kollegen publiziert wurde. Die Transplantation von gesundem Knochenmark führte bei männlichen MeCP2R168X-Tieren zu keiner Verlängerung der Überlebensspanne oder einer allgemeinen Abmilde-rung der Symptomatik, wie sie ebenfalls von Derecki und Kollegen publiziert wurde. Bei weiblichen Tieren führte die Transplantation gesunden Knochenmarks zu einer Verschlechterung der motorischen Fähigkeiten. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit denen Ergebnissen der Arbeitsgruppen von An-drew Pieper, Antonio Bedalov und Jeffrey Neul, die in anderen Mausmodellen die Wir-kung der Knochenmarktransplantation untersuchten. Die Ergebnisse aller beteiligten Arbeitsgruppen legen daher nahe, dass eine Knochen-marktransplantation nach einer Ganzkörperbestrahlung keine geeignete Therapie für das Rett Syndroms darstellt.

Thesis (Ph.D.)--McMaster University (Canada), 1995. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 56-12, Section: B, page: 6729. Adviser: J. P. Capone.

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Entre 10% et 30% des maladies humaines sont liées à l'apparition d'une mutation non-sens (PTC). La synthèse protéique est alors arrêté prématurément. Cet arrêt peut être inhibé par des molécules inductrices de translecture qui permettent l’incorporation d’un ARNt suppresseur naturel au niveau du PTC (translecture). Le ribosome peut alors franchir le PTC et restaurer l’expression de la protéine.Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à la suppression des codons stop en caractérisant de nouvelles molécules inductrices de translecture et en analysant les mécanismes de la fidélité de la traduction.J’ai tout d’abord mis au point un système de criblage innovant avec lequel j’ai testé plus de 17 000 molécules et identifié la molécule TLN468. J’ai pu mettre en évidence que cette molécule est capable d’induire la réexpression d’une protéine p53 active.J'ai aussi caractérisé de nouveaux composés dérivés d’aminoglycosides. J’ai pu montré que le NB124 est capable d’induire l’apoptose de cellules tumorales via la réexpression de la protéine p53 tout ayant une toxicité bien plus faible que la gentamicine.En parallèle, j’ai développé une approche en molécule unique permettant d’étudier les erreurs programmées du ribosome (recodage). J’ai ainsi pu analyser la cinétique d’élongation des ribosomes eucaryotes et montré que l’initiation de la traduction sur un site d’entrée interne (IRES) ralentit le ribosome lors des premiers cycles d’élongation. / Nonsense mutations, also known as premature termination codons (PTCs) are responsible for 10% to 30% of all human genetic diseases. Nonsense translation suppression can be induced by readthrough inducers. The presence of such PTC leads to premature translation termination. These stop therapeutic strategies have emerged which attempt to use molecules that facilitate tRNA incorporation at the PTC (readthrough). The, translation continue in the same reading frame until the next stop codon. I first developed an innovative screening system I used to test more than 17,000 molecules and have identified one hit, TLN468 molecule. I have shown that this molecule is able to induce re-expression of an active p53 protein.I also characterized new compounds derived from aminoglycosides. I have shown that the NB124 induces apoptosis of tumor cells by re-expressing p53 protein while having a much lower toxicity than gentamicin.I developed a single molecule approach for studying the ribosome programmed errors (recoding). I was able to analyze the kinetics of elongation eukaryotic ribosomes and showed that the initiation of translation at an internal entry site (IRES) slows the ribosome during the first elongation cycle.

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno genético, sistêmico, com expressividade variável e herança autossômica dominante. Clinicamente manifesta-se devido ao desenvolvimento de hamartomas e hamártias em diferentes tecidos, principalmente no cérebro, rins, coração, pele e pulmões, podendo causar disfunção do órgão. Mutação em um de dois genes supressores tumorais, TSC1 ou TSC2, são responsáveis pelo TSC. Os genes TSC1 e TSC2 codificam para hamartina e tuberina, respectivamente. Ambas as proteínas interagem fisicamente formando um complexo citosólico que inibe mTOR (mammalian target of rapamycin). Testes moleculares para TSC1 e TSC2 são úteis para auxiliar no diagnóstico de casos clínicos difíceis, em aconselhamento genético e estudos de associação genótipo-fenotípica, além de permitirem a caracterização molecular de mecanismos patogenéticos da formação dos hamartomas e análises funcionais de seus produtos gênicos. Apesar de o diagnóstico de TSC ser basicamente clínico, a partir da revisão de seus critérios em 2012 por um grupo de especialistas, o achado de uma mutação em TSC1 ou TSC2 passou a ser considerado suficiente para o diagnóstico definitivo da doença. O estudo apresentado aqui é parte de um projeto em andamento para estabelecer condições ao desenvolvimento de análise de mutações causadoras de TSC nos genes TSC1 e TSC2. Nosso objetivo neste trabalho foi avaliar por sequenciamento de Sanger o DNA genômico de 28 pacientes brasileiros com diagnóstico definitivo de TSC, procedentes dos estados de São Paulo ou Paraná, tendo como alvo a sequência codificadora do gene TSC1, parte de seus segmentos intrônicos, o promotor basal, bem como o segmento imediatamente a 5\' deste. Sete pacientes (25%) apresentaram mutações de sentido trocado (nonsense) ou com deslocamento da leitura à tradução (frameshift) no gene TSC1. Entre 31 outras variantes de DNA encontradas, 23 são polimorfismos conhecidos e oito apresentaram frequência inferior a 1%, como verificado in silico entre mais de mil sequências de genomas humanos. Entre essas oito variantes de DNA novas ou raras, quatro foram detectadas em pacientes para os quais uma mutação patogênica havia sido identificada e, por isso, foram reclassificadas como polimorfismos. Duas e uma variantes de DNA do mesmo paciente flanqueavam um sítio de ligação em potencial para um fator de transcrição específico, a 5\' do promotor basal de TSC1. Por fim, uma nova variante de DNA na região não codificadora do éxon 2 do gene TSC1 foi predita com potencial para alterar um elemento candidato a acentuador de splicing. Em resumo, como observado em estudos anteriores, descrevemos aqui 25% dos pacientes com TSC apresentando mutações patogênicas na sequência codificadora do gene TSC1. Nossos dados mostraram quatro novas variantes de DNA em regiões potencialmente reguladoras da expressão do gene TSC1, que podem revelar-se como mutações patogênicas e, portanto, necessitam ser testadas experimentalmente / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a multisystem disorder, with variable expression and autosomal dominant inheritance. Clinically it is due to hamartia and hamartoma development in different tissues, notably in the brain, kidneys, heart, skin and lungs, causing organ dysfunction. Mutations in either tumor suppressor gene, TSC1 or TSC2, are responsible for TSC. TSC1 and TSC2 genes code for hamartin and tuberin, respectively. Both proteins physically interact forming a cytosolic complex that inhibits the mammalian target of rapamycin (mTOR). TSC1 and TSC2 molecular testing has been useful in diagnosing clinically challenging cases, in genetic counseling and genotype/phenotype association studies, besides evaluation of the molecular basis of hamartoma formation and functional analyses of both gene products. Although TSC diagnosis is basically clinical, since the 2012 specialist panel review the finding of a TSC1 or TSC2 mutation has been considered sufficient for the definite diagnosis of the disease. The results presented here are part of an ongoing project to establish conditions for TSC1 and TSC2 mutation studies. Our first aim is to evaluate by Sanger sequencing TSC1 coding sequence, and an average of 132 base pairs of intronic regions next to exon boundaries from TSC patients, in addition to the gene core promoter. We present preliminary results of a sample of 28 patients with definite TSC diagnosis, from São Paulo and Paraná states. Seven patients (25%) displayed TSC1 nonsense or frameshift mutations. Among 31 other DNA variants identified, 23 were known polymorphisms, and eight had frequencies below 1% as verified in silico among more than a thousand human genomes. Out of eight novel or rare DNA variants, four were detected in patients for whom a pathogenic mutation had been found. Two and one additional DNA point variants from the same patient flanked a putative transcription factor binding site. Finally, a novel DNA variant residing in the TSC1 noncoding exon 2 was predicted to change the sequence potential to behave as a splicing enhancer. In summary, similar to previous studies, we describe 25% of TSC patients with mutations in the TSC1 coding sequence. Differently from other reports, our data disclose four novel DNA variants in TSC1 potentially regulatory regions that are likely to unravel novel pathogenic mutations, and thus need to be experimentally tested

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno genético, sistêmico, com expressividade variável e herança autossômica dominante. Clinicamente manifesta-se devido ao desenvolvimento de hamartomas e hamártias em diferentes tecidos, principalmente no cérebro, rins, coração, pele e pulmões, podendo causar disfunção do órgão. Mutação em um de dois genes supressores tumorais, TSC1 ou TSC2, são responsáveis pelo TSC. Os genes TSC1 e TSC2 codificam para hamartina e tuberina, respectivamente. Ambas as proteínas interagem fisicamente formando um complexo citosólico que inibe mTOR (mammalian target of rapamycin). Testes moleculares para TSC1 e TSC2 são úteis para auxiliar no diagnóstico de casos clínicos difíceis, em aconselhamento genético e estudos de associação genótipo-fenotípica, além de permitirem a caracterização molecular de mecanismos patogenéticos da formação dos hamartomas e análises funcionais de seus produtos gênicos. Apesar de o diagnóstico de TSC ser basicamente clínico, a partir da revisão de seus critérios em 2012 por um grupo de especialistas, o achado de uma mutação em TSC1 ou TSC2 passou a ser considerado suficiente para o diagnóstico definitivo da doença. O estudo apresentado aqui é parte de um projeto em andamento para estabelecer condições ao desenvolvimento de análise de mutações causadoras de TSC nos genes TSC1 e TSC2. Nosso objetivo neste trabalho foi avaliar por sequenciamento de Sanger o DNA genômico de 28 pacientes brasileiros com diagnóstico definitivo de TSC, procedentes dos estados de São Paulo ou Paraná, tendo como alvo a sequência codificadora do gene TSC1, parte de seus segmentos intrônicos, o promotor basal, bem como o segmento imediatamente a 5\' deste. Sete pacientes (25%) apresentaram mutações de sentido trocado (nonsense) ou com deslocamento da leitura à tradução (frameshift) no gene TSC1. Entre 31 outras variantes de DNA encontradas, 23 são polimorfismos conhecidos e oito apresentaram frequência inferior a 1%, como verificado in silico entre mais de mil sequências de genomas humanos. Entre essas oito variantes de DNA novas ou raras, quatro foram detectadas em pacientes para os quais uma mutação patogênica havia sido identificada e, por isso, foram reclassificadas como polimorfismos. Duas e uma variantes de DNA do mesmo paciente flanqueavam um sítio de ligação em potencial para um fator de transcrição específico, a 5\' do promotor basal de TSC1. Por fim, uma nova variante de DNA na região não codificadora do éxon 2 do gene TSC1 foi predita com potencial para alterar um elemento candidato a acentuador de splicing. Em resumo, como observado em estudos anteriores, descrevemos aqui 25% dos pacientes com TSC apresentando mutações patogênicas na sequência codificadora do gene TSC1. Nossos dados mostraram quatro novas variantes de DNA em regiões potencialmente reguladoras da expressão do gene TSC1, que podem revelar-se como mutações patogênicas e, portanto, necessitam ser testadas experimentalmente / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a multisystem disorder, with variable expression and autosomal dominant inheritance. Clinically it is due to hamartia and hamartoma development in different tissues, notably in the brain, kidneys, heart, skin and lungs, causing organ dysfunction. Mutations in either tumor suppressor gene, TSC1 or TSC2, are responsible for TSC. TSC1 and TSC2 genes code for hamartin and tuberin, respectively. Both proteins physically interact forming a cytosolic complex that inhibits the mammalian target of rapamycin (mTOR). TSC1 and TSC2 molecular testing has been useful in diagnosing clinically challenging cases, in genetic counseling and genotype/phenotype association studies, besides evaluation of the molecular basis of hamartoma formation and functional analyses of both gene products. Although TSC diagnosis is basically clinical, since the 2012 specialist panel review the finding of a TSC1 or TSC2 mutation has been considered sufficient for the definite diagnosis of the disease. The results presented here are part of an ongoing project to establish conditions for TSC1 and TSC2 mutation studies. Our first aim is to evaluate by Sanger sequencing TSC1 coding sequence, and an average of 132 base pairs of intronic regions next to exon boundaries from TSC patients, in addition to the gene core promoter. We present preliminary results of a sample of 28 patients with definite TSC diagnosis, from São Paulo and Paraná states. Seven patients (25%) displayed TSC1 nonsense or frameshift mutations. Among 31 other DNA variants identified, 23 were known polymorphisms, and eight had frequencies below 1% as verified in silico among more than a thousand human genomes. Out of eight novel or rare DNA variants, four were detected in patients for whom a pathogenic mutation had been found. Two and one additional DNA point variants from the same patient flanked a putative transcription factor binding site. Finally, a novel DNA variant residing in the TSC1 noncoding exon 2 was predicted to change the sequence potential to behave as a splicing enhancer. In summary, similar to previous studies, we describe 25% of TSC patients with mutations in the TSC1 coding sequence. Differently from other reports, our data disclose four novel DNA variants in TSC1 potentially regulatory regions that are likely to unravel novel pathogenic mutations, and thus need to be experimentally tested

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_maria_cecilia_florisbal_dame.pdf: 53923 bytes, checksum: e82c085a8b324064158221bf46a754ba (MD5) Previous issue date: 2013-12-12 / This thesis is a continuation of a research project started with a diagnosis of dermatosis mechano-bullosa in a herd of buffaloes from a farm in southern Rio Grande do Sul. After this diagnostic it was created an experimental herd where several congenital defects and / or hereditary disorders have been diagnosed during more than two decades. These diseases were studied by a research group which the author of this thesis is a member. Thus, three papers are presented: the first one is a literature review about what has been diagnosed in Brazil on congenital defects and hereditary diseases in buffalo. It was concluded that undesirable genes are widespread in the population of buffaloes in the country; the second was a study conducted in partnership with UNESP / Jaboticabal, SP and UFCG / CSTR-Patos, PB to identify the mutation in the gene that determines the oculo-cutaneous albinism in Murrah buffalo. Another paper was accomplished to describe the occurrence of malignant melanoma in two albino buffalo. Although it is not a congenital or hereditary disease it was observed only in the buffalo with oculocutaneous albinism and probably the condition is associated with a predisposition of these animals to develop tumors in the skin. / Esta tese dá continuidade a um projeto de pesquisa iniciado com o diagnóstico de dermatose mecanobolhosa em 1985 em um rebanho de búfalos pertencente a uma propriedade da zona sul do Rio Grande do Sul. A partir desse diagnóstico foi criado um rebanho experimental no qual por mais de duas décadas foram diagnosticados diversos defeitos congênitos e/ou hereditários que foram estudados por um grupo de pesquisa do qual faz parte a autora desta tese. Assim sendo, são apresentados três artigos científicos: o primeiro trata-se de uma revisão bibliográfica sobre o que foi diagnosticado no Brasil em relação a defeitos congênitos/doenças hereditárias em bubalinos concluindo-se que alguns genes indesejáveis estão disseminados na população de búfalos no País; o segundo foi um trabalho realizado em parceria com a UNESP/Jaboticabal, SP e com a UFCG/CSTR-Patos, PB que identificou a alteração no gene que determina o albinismo óculo-cutâneo em búfalos da raça Murrah. O terceiro artigo trata-se da descrição de melanoma maligno observado em dois búfalos albinos. Embora não seja um defeito congênito ou hereditário este neoplasma ocorreu somente nos búfalos com albinismo óculo-cutâneo do rebanho e acredita-se que a condição esteja associada à predisposição desses animais a desenvolverem tumores de pele.