La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif rare traité par des inhibiteurs de tyrosine kinase, tel que l’imatinib. Malgré son efficacité, la résistance au traitement est un problème récurrent. Des variants génétiques responsables d’une altération de la mort cellulaire programmée (apoptose) pourraient notamment expliquer l’hétérogénéité de la réponse au traitement entre les patients. Dans un premier temps, l’objectif était de rechercher des variants candidats. Pour cela un panel de 45 gènes impliqués dans l’apoptose a été étudié par séquençage nouvelle génération chez 24 patients atteints de LMC, 12 répondeurs et 12 résistants au traitement par imatinib. A l’aide d’outils informatiques, 473 polymorphismes ont été détectés. Le nombre de patients étudiés étant limité, de nouvelles méthodes statistiques ont dû être développées pour analyser les résultats obtenus. Tout d’abord, les fréquences de survenue des variants chez les patients résistants et répondeurs ont été comparées aux fréquences observées dans la population générale et visualisées par une approche de statistiques descriptives. Cette stratégie a permis de réduire la liste à 95 polymorphismes pouvant être impliqués dans la résistance au traitement. Par la suite, les gènes ont été classés selon leur enrichissement en allèles variants. Au final, trois gènes candidats ont été choisis et séquencés chez 103 patients. Cette méthodologie, automatisée grâce à un algorithme informatique, a permis de mettre en évidence, un variant non synonyme dans le gène BCL RAMBO, retrouvé plus fréquemment chez les patients résistants de manière significative. Dans un second temps, l’objectif était de caractériser le rôle de ce variant dans la réponse à l’imatinib à l’aide de lignées cellulaires modifiées par la technologie CRISPR-Cas9. Des cellules n’exprimant plus la protéine ont été obtenues et ont permis de mettre en évidence le rôle majeur de la protéine BCL RAMBO dans l’inhibition de l’apoptose. Des lignées cellulaires portant le variant candidat ont également été créées à l’aide d’une nouvelle technique utilisant CRISPR-Cas9 : l’exon entier contenant le nucléotide d’intérêt a été remplacé par un exon modifié. La modification d’un acide aminé induite par le variant a été associé à une perte de la sensibilité au traitement par imatinib dans ces lignées, comme suggéré après séquençage des patients. Ces données indiquent que BCL-RAMBO, facteur anti-apoptotique dans une lignée modèle de LMC, pourrait devenir une nouvelle cible thérapeutique afin de surmonter la résistance à l’imatinib / Chronic myeloid leukemia (CML) is a rare myeloproliferative syndrome treated by tyrosine kinase inhibitors, such as imatinib. Despite its efficacy, resistance to treatment is a persistent clinical issue. Notably, genetic variants causing alterations in apoptosis may explain heterogeneity of imatinib sensitivity between patients. First, the goal was to look for candidate variants. For that purpose, a panel of 45 apoptotic genes was assessed by next-generation sequencing on 24 CML patients, 12 sensitive and 12 resistant to imatinib treatment. Using informatics tools, 473 polymorphisms were detected. As the number of sequenced samples was limited, novel statistical methods had to be developed to interpret the results. The variant frequency in resistant and sensitive patients was compared to variant frequency in the general population and visualized using descriptive statistics. This strategy allowed to obtain a restricted list of 95 polymorphisms that might be involved in resistance to the treatment. Then, genes were ranked according to variant allele enrichment. At the end, three candidate genes were chosen and sequenced for 103 CML patients. This methodology, automated using a computer algorithm, permitted to highlight a nonsynonymous variant in the BCL RAMBO gene, significantly found more often in resistant patients. Second, the objective was to characterize the role of this variant in response to imatinib using model cell lines modified by CRISPR-Cas9 technology. BCL-RAMBO knock-out cells were obtained and allowed to demonstrate the major role of BCL-RAMBO protein in apoptosis inhibition. Additionally, cell lines carrying the variant were created using a new CRISPR-Cas9 mediated technique: the whole exon carrying the nucleotide of interest was replaced with a variant exon. The amino acid change induced by the identified polymorphism was associated with a loss of sensitivity to imatinib treatment in these cell lines as suggested after patient sequencing. These data indicate that BCL-RAMBO, anti apoptotic factor in a CML cell line, could become a novel therapeutic target to overcome drug inefficacy for a subset of resistant patients.

La caractérisation exaustive des variations de l'ADN peut aider à progresser dans de nombreux champs liés à la génomique du cancer. Le séquençage nouvelle génération (NGS en anglais pour Next Generation Sequencing) est actuellement la technique la plus efficace pour déterminer une séquence ADN, du aux faibles coûts et durées des expériences comparé à la méthode de séquençage traditionnelle de Sanger. Cependant, la détection de mutations à partir de données NGS reste encore un problème difficile, en particulier pour les mutations somatiques présentes en très faible abondance comme lorsque l'on essaye d'identifier des mutations sous-clonales d'une tumeur, des mutations dérivées de la tumeur dans l'ADN circulant libre, ou des mutations somatiques dans des tissus normaux. La difficulté principale est de précisement distinguer les vraies mutations des artefacts de séquençage du au fait qu'ils atteignent des niveaux similaires. Dans cette thèse nous avons étudié la nature systématique des erreurs dans les données NGS afin de proposer des méthodologies efficaces capables d'identifier des mutations potentiellement en faible abondance. Dans un premier chapitre, nous decrivons needlestack, un nouvel outil d'appel de variants basé sur la modélisation des erreurs systématiques sur plusieurs échantillons pour extraire des mutations candidates. Dans un deuxième chapitre, nous proposons deux méthodes de filtrage des variants basées sur des résumés statistiques et sur de l'apprentissage automatique, dans le but de d'améliorer la précision de la détection des mutations par l'identification des erreurs non-systématiques. Finalement, dans un dernier chapitre nous appliquons ces approches pour développer des biomarqueurs de détection précoce du cancer en utilisant l'ADN circulant tumoral / Comprehensive characterization of DNA variations can help to progress in multiple cancer genomics fields. Next Generation Sequencing (NGS) is currently the most efficient technique to determine a DNA sequence, due to low experiment cost and time compared to the traditional Sanger sequencing. Nevertheless, detection of mutations from NGS data is still a difficult problem, in particular for somatic mutations present in very low abundance like when trying to identify tumor subclonal mutations, tumor-derived mutations in cell free DNA, or somatic mutations from histological normal tissue. The main difficulty is to precisely distinguish between true mutations from sequencing artifacts as they reach similar levels. In this thesis we have studied the systematic nature of errors in NGS data to propose efficient methodologies in order to accurately identify mutations potentially in low proportion. In a first chapter, we describe needlestack, a new variant caller based on the modelling of systematic errors across multiple samples to extract candidate mutations. In a second chapter, we propose two post-calling variant filtering methods based on new summary statistics and on machine learning, with the aim of boosting the precision of mutation detection through the identification of non-systematic errors. Finally, in a last chapter we apply these approaches to develop cancer early detection biomarkers using circulating tumor DNA

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) du sujet âgé sont les plus fréquentes des leucémies aiguës. Bien que de physiopathologie hétérogène, elles partagent un pronostic défavorable. L’azacitidine est devenue un des traitements de référence pour les patients jugés inéligibles pour une chimiothérapie intensive mais les critères de sélection des patients entre ces deux approches sont controversés. L’identification de biomarqueur prédictif de réponse à l’azacitidine doit permettre de rationnaliser ce choix thérapeutique. Les facteurs pronostiques classiques d’une cohorte de 334 patients atteints de LAM manquent de précision pour guider la meilleure stratégie pour un patient donné. A partir du séquençage de 224 patients traités par azacitidine, nous montrons un impact défavorable des mutations de TP53 sur la survie globale, quel que soit leur caractérisation fonctionnelle. Le séquençage des exomes de 49 patients selon leur réponse à l’azacitidine (26 répondeurs et 23 non répondeurs), suivi du re-séquençage ciblé de 4 polymorphismes chez 175 patients a montré un impact positif du polymorphisme rs7622799 de MECOM sur la survie globale sous azacitidine. / Elderly patients with acute myeloid leukemias (AML) represent the most frequent acute leukemias. Although they differ in their pathophysiology, they all share an adverse prognosis. Azacitidine has become one of the reference low-intensity frontline therapy for patients deemed unfit for intensive chemotherapy. Patients selection between these 2 options remains controversial. Predictive biomarkers of response to azacitidine should allowed to rationalize this decision making. Classical prognosis factors of a cohort of 334 newly diagnosed AML lack of precision to determine the optimum strategy for any individual patient. By sequencing of a 224-patients series of azacitidine-treated AML patients, we demonstrate an adverse impact of TP53 mutation on overall survival, irrespective of the functional characterization of p53 mutants. Exome sequencing of 49 patients with extreme phenotype as defined by their response under azacitidine (26 responders versus 23 non-responders), followed by targeted sequencing of 4 common polymorphisms in a validation set of 175 patients, showed a positif impact of MECOM rs7622799 on overall survival.

En ville, les systèmes de récupération et d'infiltration des eaux pluviales dans le sous-sol ont pour conséquence d'augmenter la connectivité hydrologique entre la surface et la nappe phréatique. Ces pratiques d'infiltration produisent de nombreuses perturbations physico-chimiques au niveau de la nappe (ex. augmentation des variations thermiques, baisse des concentrations en oxygène dissous, enrichissement de la nappe en matière organique dissoute) mais les conséquences sur le compartiment microbien restent peu connues. L'objectif principal de la thèse est de déterminer les effets de l'infiltration des eaux pluviales sur les communautés microbiennes des nappes phréatiques, aussi bien en termes d'abondance, d'activités que de diversité génétique bactérienne. En se basant sur les changements environnementaux associés à l'infiltration des eaux pluviales et l'analyse des communautés bactériennes, un objectif fondamental est d'évaluer l'importance des phénomènes de dispersion (ex. transferts) et de sélection par des facteurs abiotiques (ex. disponibilité des ressources nutritives) sur les assemblages bactériens au sein des nappes phréatiques. Ces travaux ont été axés sur des expérimentations de terrain utilisant deux approches d'échantillonnage : une méthode active (prélèvements d'eau) et une méthode passive (incubation de substrats artificiels). La description des communautés a été effectuée par une méthode de séquençage de nouvelle génération (i.e. Illumina MiSeq) en se basant sur le gène rrs. Les résultats de ce travail mettent en avant une influence significative des pratiques d'infiltration sur les bactériomes d'un aquifère. En effet, le développement, les activités et la diversité des micro-organismes retrouvés dans la nappe ont été stimulés significativement par l'enrichissement en carbone organique dissous biodégradable engendré par ces pratiques. Néanmoins, cet impact est fortement réduit dans les systèmes étudiés où la zone non saturée est épaisse (> 10 m) et agit comme un filtre physique, chimique et biologique efficace entre le bassin d'infiltration et l'aquifère. Les faibles similarités entre les structures génétiques des bactériomes des eaux d'infiltration et dans la nappe indiquent que la zone non saturée joue un rôle efficace sur la rétention des bactéries dans les systèmes étudiés. En conclusion, cette thèse constitue la première étude d'envergure visant à quantifier la réponse du compartiment microbien des aquifères à des perturbations engendrées par l'infiltration des eaux pluviales en milieu urbain. Elle ouvre aussi de nouvelles perspectives sur les méthodes et outils d'évaluation de la qualité des nappes phréatiques / In urban area, managed aquifer recharge (MAR) systems raises hydrological connectivity between surface and groundwater. These infiltration practices are the cause of many disturbances in groundwaters (e.g. increase of thermal variations, decrease of dissolved oxygen or enrichment in organic matter) but associated consequences on microbial compartment remains unclear. The main aim of the thesis is to determine the effects of stormwater runoff infiltration on microbial communities of groundwater, in terms of abundance, activities and bacterial diversity. Based on environmental changes associated to MAR practices and bacterial community analyses, a fundamental question is to assess the importance of dispersal (e.g. transfers) and selection by abiotic factors (e.g. nutrients availability) on groundwater communities assemblage. This study is based on field experiments with two complementary strategies of sampling: an active one (i.e. groundwater sampling) and a passive one (incubation of artificial substrate). Communities’ description was made by next-generation sequencing (i.e. Illumina MiSeq) of rrs gene. The results showed a significant influence of MAR practices on microbial communities. Growth, activities and diversity of groundwater micro-organisms were mainly stimulated by biodegradable dissolved organic carbon enrichment associated to MAR practices. Nonetheless, this impact was reduced in systems where the vadose zone is thick (> 10 m) and acts as a physical, chemical and biological filter between the infiltration basin and the aquifer. Low similarities between bacterial communities of infiltration waters and bacterial communities of groundwaters reveal that vadose zone is effective on the retention of bacteria in studied systems. To conclude, this thesis constitutes the first major study that aimed to quantify microbial compartment response to disturbances caused by MAR practices in urban area. It also opens new perspectives on assessment tool for groundwater quality

L'identification de gènes ayant permis à des populations de s'adapter à leur environnement local constitue une des problématiques majeures du domaine de la génétique des populations. Les méthodes statistiques actuelles répondant à cette problématique ne sont plus adaptées aux données de séquençage nouvelle génération (NGS). Nous proposons dans cette thèse de nouvelles statistiques adaptées à ces nouveaux volumes de données, destinées à la détection de gènes sous sélection. Nos méthodes reposent exclusivement sur l'Analyse en Composantes Principales, dont nous justifierons l'utilisation en génétique des populations. Nous expliquerons également les raisons pour lesquelles nos approches généralisent les méthodes statistiques existantes et démontrons l'intérêt d'utiliser une approche basée sur l'Analyse en Composantes Principales en comparant nos méthodes à celles de l'état de l'art. Notre travail a notamment abouti au développement de pcadapt, une librairie R permettant l'utilisation de nos statistiques de détection sur des données génétiques variées. / Identifying genes involved in local adaptation is of major interest in population genetics. Current statistical methods for genome scans are no longer suited to the analysis of Next Generation Sequencing (NGS) data. We propose new statistical methods to perform genome scans on massive datasets. Our methods rely exclusively on Principal Component Analysis which use in population genetics will be discussed extensively. We also explain the reasons why our approaches can be seen as extensions of existing methods and demonstrate how our PCA-based statistics compare with state-of-the-art methods. Our work has led to the development of pcadapt, an R package designed for outlier detection for various genetic data.

L’épidémie actuelle d’obésité est devenue un enjeu majeur de Santé Publique dans les pays industrialisés, mais aussi dans les pays en voie de développement. Elle expose les personnes concernées à de nombreuses maladies cardio-vasculaires, métaboliques, articulaires, cancéreuses, et à une augmentation de la mortalité. Si à l’échelle sociétale, l’obésité est liée aux récents changements de notre mode de vie (accès facile à une alimentation hypercalorique, combiné à une diminution de l’activité physique), à l’échelle individuelle c’est la génétique qui détermine en grande partie notre corpulence. Dans l’obésité commune, polygénique, l’héritabilité du poids est de 70% et 5% des obésités sont monogéniques, dues à une mutation d’un seul gène dans la voie leptine-mélanocortine, régulatrice de la satiété. La diffusion des nouvelles technologies de séquençage haut débit (NGS pour Next Generation Sequencing) a permis des avancées considérables sur la connaissance de la maladie et offre une meilleure efficacité que les méthodes classiques par séquençage Sanger ou par puces à ADN, avec une plus grande rapidité de diagnostic génétique et souvent à moindre coût. Lors de mon travail de thèse, nous avons instauré une collaboration entre les services de Pédiatrie et le Centre de Génétique Chromosomique l’Hôpital Saint-Vincent de Paul à Lille d’une part, et le laboratoire UMR 8199 d’autre part afin d’appliquer ces nouvelles techniques de séquençage au diagnostic génétique d’enfants obèses suivis dans le service. Nous avons d’abord étudié 283 enfants obèses ou en surpoids adressés au Centre de Génétique Chromosomique pour bilan étiologique d’un retard de développement psychomoteur. Les premières analyses génétiques (caryotype, CGH array et recherche d’un syndrome de Prader-Willi par analyse du profil de méthylation) étaient normales et le tableau clinique n’était pas expliqué. Nous avons identifié deux nouvelles mutations délétères de SIM1 (c.886A>G/p.R296G et c.925A>G/p.S309G) chez deux patients caucasiens aux phénotypes différents. Ce travail a fait l’objet d’une publication dans le journal « Obesity ».Dans un deuxième temps, nous avons développé un protocole basé sur le NGS pour la détection simultanée des mutations ponctuelles et des anomalies structurales du génome, délétion ou duplications (CNV pour Copy Number Variation). Nous avons vérifié la capacité de notre capture personnalisée à détecter les CNV connus chez 40 patients du Centre de Génétique Chromosomique porteurs de troubles intellectuels. Puis le protocole a été appliqué chez 29 enfants obèses suivis à l’Hôpital Saint-Vincent de Paul permettant chez un certain nombre d’entre eux l’identification d’anomalies génétiques causales en une seule étape et par conséquence une amélioration de leur prise en charge médicale.Lors de mon travail de thèse, nous avons ainsi montré l’intérêt de l’utilisation des nouvelles techniques de séquençage issues du NGS pour améliorer le diagnostic génétique des enfants suspects d’obésité syndromique ou monogénique, première étape indispensable à l’émergence d’une médecine personnalisée dans la prise en charge de ces enfants. / Obesity has become a major public health issue in industrialized countries as well as in developing countries, exposing obeses patients to many cardiovascular disease, metabolic disease, osteoarthritis and cancer, and to an increasing mortality. The current worldwide obesity epidemic has largely been driven by recent changes in our lifestyle (easy access to a hypercaloric food, combined with a reduction of physical activity), however genetic differences have an appreciable role in the observed individual corpulence variation. In polygenic obesity, weight heritability is 70% and 5% of obesities are monogenic, due to a mutation of a single gene in the leptin-melanocortin pathway, regulating satiety. The use of next generation sequencing (NGS) has led to significant advances in disease awareness and provides better efficacy than conventional Sanger sequencing or DNA-chips with more accurate, faster and cheaper genetic diagnosis.During my PhD, we established a collaboration between the Pediatric departments and the Chromosomal Genetics Center at the Hôpital Saint-Vincent de Paul in Lille on the one hand and the laboratory UMR 8199 on the other hand, in order to apply the NGS to the genetic diagnosis of obese children followed in the service. We first studied 283 obese or overweight children referred to the Chromosomal Genetics Center for aetiological assessment of a developmental delay. The first genetic analyzes (karyotype, CGH array and analysis of the methylation profile for a Prader-Willi syndrome) were normal and the clinical phenotype was not explained. We identified two new deleterious mutations of SIM1 (c.886A> G / p.R296G and c.925A> G / p.S309G) in two Caucasian patients with different phenotypes. This work was published in "Obesity".We also developed an NGS-based protocol for the simultaneous detection of punctual mutations and structural anomalies of the genome, deletion or duplication (CNV for Copy Number Variation). We verified the ability of our personalized capture to detect the CNVs known in 40 patients of the Center of Chromosomal Genetics carrying intellectual disorders. The protocol was then applied to 29 obese children from Saint-Vincent de Paul Hospital, enabling a certain number of them to identify causal genetic abnormalities in a single step and, consequently, improving their medical management.In conclusion, during my PhD, we showed the advantage of using the new sequencing technologies derived from the NGS during the genetic diagnosis for children suspected of syndromic or monogenic obesity, this being the first essential step for the emergence of a personalized medicine in the management of childhood obesity

Les cellules cancéreuses sont caractérisées par des altérations de l'ADN causées par des facteurs exogènes, comme l'exposition à des agents environnementaux tels que le tabac ou les UV, ou par des mécanismes endogènes tels que les erreurs de polymérase lors de la réplication de l'ADN. L'analyse des causes et des conséquences de ces altérations permet de mieux comprendre les facteurs et mécanismes à l'origine du développement d'un cancer. Les technologies de séquençages à haut débit offrent l'opportunité d'étudier la nature précise de ces altérations à l'échelle du génome et permettent de révéler des signatures mutationnelles distinctes et spécifiques de cancérigènes, fournissant ainsi des hypothèses sur l'étiologie des cancers.L'objectif de ma thèse a consisté à développer des méthodes et des outils bioinformatiques accessibles et conviviaux permettant de faciliter l'analyse et l'interprétation des signatures mutationnelles à partir de données de séquençage à haut débit. L'application de ces outils et méthodes à des séries originales de tumeurs humaines et de systèmes expérimentaux de mutagénèse et carcinogénèse a permis de mieux caractériser la signature mutationnelle de l'acide aristolochique (AA) ainsi que d'autres cancérigènes d'intérêt / Cellular genomes accumulate alterations following exposures to exogenous factors, like environmental agents such as tobacco smoking or UV, or to endogenous mechanisms such as DNA replication errors. Analysing the causes and consequences of these changes allows a better understanding of the mechanisms underlying cancer development and progression. Next-generation sequencing (NGS) technologies provide the opportunity tostudy the nature of the resulting alterations on a genome-wide scale and started to reveal distinct mutational signatures specific to past carcinogenic exposures providing clues on cancer aetiology.The aim of my thesis was to develop user-friendly bioinformatic tools and methods for facilitating the analysis and interpretation of carcinogen-specific mutational signatures from NGS data. Applying these tools and methods to human tumours and experimental models of mutagenesis led to a better characterisation the mutational signature of aristolochic acid (AA), as well as other carcinogens of interest

Le syndrome de Marfan (MFS) est une maladie génétique rare. Les signes cliniques sont principalement squelettiques, oculaires et cardiovasculaires. Le premier gène identifié est FBN1. Une LSDB UMD créée en 1995 a permis de colliger les mutations identifiées chez les patients. D’autres gènes ont été identifiés comme causant des syndromes apparentés : FBN2, TGFBR1, TGFBR2, ACTA2, SMAD3, MYH11 et MYLK. Ma thèse avait pour but de mettre à jour ces différentes bases et de créer celles des nouveaux gènes. Les techniques de séquençage nouvelle génération dans la pratique clinique amènent des médecins non spécialistes à rapporter des variations secondaires dans ces gènes « actionable ». Il s’agit de la ressource la plus complète pour les cliniciens et les généticiens pour interpréter les variants associés au MFS et ses pathologies associées pour les variants primaires et secondaires.La bicuspidie de la valve aortique (2 feuillets au lieu de 3) est la malformation cardiovasculaire la plus fréquente touchant 0,6 à 2 % de la population. Ma thèse avait pour but d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la BAV. Grâce à une cohorte de 200 patients, le gène HOXA1, un facteur de transcription, a pu être examiné de manière plus approfondie. Alors qu’il contient une répétition de 10 histidines, les individus hétérozygotes mutés en présentent 11. Mes études ont permis de démontrer l’imputabilité de cette mutation. Dans un second temps, un séquençage d’exomes entiers a permis de mettre en évidence de nouveaux variants prédits pathogènes. Ces données permettront de mieux comprendre le rôle physiologique d’HOXA1 et des nouveaux gènes candidats dans la pathogénèse de la BAV chez l’humain. / Marfan Syndrome is a rare genetic disorder. Clinical signs are mainly skeletal, ocular and cardiovascular. The first gene identified is FBN1. A LSDB UMD was created in 1995 to colligate all the mutations identified in. Thereafter, several others genes were identified involved in related disorders : FBN2, TGFBR1 and TGFBR2, ACTA2, SMAD3, MYH11 and MYLK. The objectives of my PhD were to update these databases and to create new ones for genes. Next generation sequencing in clinical practice leads non-specialized doctors to report pathogenic secondary variants in “actionable” genes. Our databases are the only resources providing access to the full spectrum of known pathogenic mutations with checked and interpreted data from many reference diagnostic laboratories and research centers worldwide, and the most comprehensive resources for clinicians and geneticists to interpret variations linked to Marfan syndrome and related disorders not only primary but also secondary variants.Bicuspid Aortic Valve is the most common cardiovascular malformation affecting 0.6-2% of the population (2 leaflets instead of 3). Thanks to a cohort of 200 BAV patients, HOXA1 gene, a transcription factor, has been screened. While HOXA1 contains a string of 10 histidine repeats, these individuals are heterozygous for an 11 histidine repeat variant. My studies showed the imputability of this mutation. In a second phase, whole exome sequencing allow us to highlight new variants predicted pathogenic. Studies are still ongoing to confirm their imputability. These data contribute to our better understanding of the physiological of HOXA1 and new candidate genes in the pathogenesis of BAV disease in humans.

Les ataxies héréditaires représentent un groupe hétérogène de maladies neurodégénératives caractérisées par des anomalies de la coordination des mouvements associées à des troubles de l’équilibre et de la marche. L’immense diversité fonctionnelle des protéines touchées dans les ataxies autosomiques récessives (AR) souligne que celles-ci ne peuvent pas être classées selon les voies physiopathologiques en cause. De ce constat résulte une classification émergente des AR en fonction de la raison expliquant la nature « modérée » de l’atteinte neurologique, à savoir : (i) les mutations avec perte de fonction partielle, (ii) la présence redondante de protéines de la même famille fonctionnelle, (iii) la présence redondante d’autres voies détoxifiantes. L’objectif de ce travail était d’identifier de nouveaux gènes responsables d’AR syndromiques grâce à une stratégie couplant la cartographie par homozygotie et l’analyse d’exomes de larges familles consanguines. L’analyse par génotypage de l’une de ces familles nous a permis d’identifier 2 régions homozygotes partagées par les 3 enfants atteints par le syndrome de Lichtenstein-Knorr (ataxie-surdité). Parmi les variants présents dans ces régions, j’ai identifié une mutation faux-sens dans le gène SLC9A1 codant pour l'échangeur Na+/H+1, NHE1. Cette mutation transforme la Glycine 305, un petit acide aminé très conservé et localisé dans le 8ème domaine transmembranaire, en Arginine, acide aminé chargé positivement. Bien que NHE1 soit une protéine exprimée de façon ubiquitaire, 2 modèles souris « knock-out » de ce gène ont montré sa fonction essentielle au niveau des noyaux profonds cérébelleux, vestibulaires et cochléaires où a été observé une dégénérescence spécifique suite à l’inactivation du gène Slc9a1. Nous avons ensuite apporté la preuve de l’effet délétère de la mutation p.Gly305Arg en montrant une réduction importante mais pas totale de l’activité de l’échangeur muté ainsi qu’une abolition de son expression à la surface cellulaire, démontrant ainsi que SLC9A1 est le gène impliqué dans le syndrome de Lichtenstein-Knorr (Guissart et al. Hum Mol Genet 2015). L’analyse de l’exome d’une famille consanguine multi-générationnelle présentant une ataxie spino-cérébelleuse, une cécité et une surdité et dont le locus avait été identifié par notre équipe en 2000 sur le chromosome 6p23-p21 (SCAR3 ; MIM #271250) m’a permis d’identifier la mutation faux-sens homozygote p.Gly306Arg dans le gène SLC52A2, pourtant située sur le chromosome 8qter et déjà décrite chez des patients atteints du syndrome de Brown-Vialetto-Van Laere type 2, indiquant que la liaison génétique initialement publiée pour cette famille était due au hazard. Le séquençage d’exome d'une autre famille avec 2 enfants atteints d’une AR progressive et d’une rétinite pigmentaire et présentant une région homozygote partagée en 6p23-p21 m’a permis d’identifier la mutation faux-sens p.Ala912Val dans le gène PEX6. L'analyse rétrospective des marqueurs du peroxysome a montré un taux d’acide phytanique sérique très modérément augmenté, alors que les fibroblastes m’ont permis de confirmer le caractère pathogène de la mutation p.Ala912Val par l'absence de marquage à la catalase, la présence de structures peroxysomales anormales et une nette augmentation des AGTLC, indiquant une perte de fonction partielle de la protéine PEX6. Par conséquent, en dépit d’une liaison génétique initiale erronée, l’entité SCAR3 est confirmée et est causée par certaines mutations du gène PEX6 (Guissart et al. Eur J Hum Genet 2016). En conclusion, la présence des mutations faux-sens hypomorphes dans ces familles et les données de la littérature démontrent le concept selon lequel de nombreuses AR sont causées par des mutations de type « perte de fonction partielle » touchant une grande variété de voies physiopathologiques, ceci en raison de l’extrême sensibilité des neurones cérébelleux, spino-cérébelleux et sensitifs profonds, à des désordres métaboliques même légers. / Inherited ataxias are a heterogeneous group of neurodegerative diseases that are characterized by incoordination of movement and unsteadiness. The huge functional diversity of affected proteins in autosomal recessive ataxia highlights that these disorders cannot be classified according to relevant physiopathological pathways. Rather, current knowledge shows that no specific physiopathological pathway explains directly the appearance of the symptoms. This gives rise to an emerging recessive ataxia classification based on the reason explaining the “moderate” nature of neurological involvement, namely: (i) partial loss of function mutation, (ii) the presence of redundant functional family member proteins, (iii) the presence of redundant detoxifying pathways. The purpose of this work was to identify new causative genes for syndromic recessive ataxia using a strategy combining homozygosity mapping and exome analysis in large consanguineous families. Genotyping analysis of one of those families has enabled us to identify 2 significant regions of homozygosity shared by the 3 siblings affected by Lichtenstein-Knorr syndrome (ataxia-deafness): one of 23.6 Mb on chromosome 1 and the other of 5.5 Mb on chromosome 7. Among the variants located in the shared homozygous regions, I rapidly identified a missense mutation located in the SLC9A1 gene encoding for NHE1, the Na+/H+ exchanger family member 1. This mutation replaces Glycine 305, a small neutral highly conserved amino-acid, located in the 8th transmembrane segment and conserved in all investigated metazoans by Arginine, a positively charged amino acid. Despite NHE1 is ubiquitously expressed, extensive analysis of 2 Slc9a1 knock-out mice models revealed its crucial role in 3 regions of the central nervous system: vestibular nuclei, cochlear nuclei, and most prominently deep cerebellar nuclei. We then demonstrated the deleterious effect of the p.Gly305Arg mutation showing a significant but not complete reduction of the proton pump activity of NHE1 as well as absence of expression at the cell surface, thus demonstrating that SLC9A1 is the causative gene in Lichtenstein-Knorr syndrome (Guissart et al. Hum Mol Genet 2015). Exome analysis of a multigenerational consanguineous family with spinocerebellar ataxia, blindness and deafness for which we identified linkage to chromosome 6p23-p21 in 2000 (SCAR3; MIM #271250) allowed me to identify in all patients the homozygous p.Gly306Arg missense mutation in SLC52A2, yet located on chromosome 8qter and previously found mutated in patients with Brown-Vialetto-Van Laere type 2, indicating that the genetic linkage published for the SCAR3 family was a false positive result. High recombination rate in the telomeric region and use of widely spaced microsatellite markers explain why correct linkage was initially missed. Exome sequencing of another family with 2 children affected with progressive ataxia and retinitis pigmentosa and with linkage to 6p23-p21 revealed the p.Ala912Val mutation in PEX6. Retrospective analysis of peroxisomal markers showed very moderate increase of serum phytanic acid levels, but fibroblasts allowed me to confirm the pathogenicity of the p.Ala912Val mutation by absent peroxisomal catalase immunostaining, presence of peroxisomal ghosts with abnormal structure and markedly increased very long-chain fatty acids, indicating a partial loss of function of the PEX6 protein. Therefore, despite initial false genetic linkage, the SCAR3 locus is confirmed and is caused by some PEX6 mutation (Guissart et al. Eur J Hum Genet 2016). In conclusion, the identification of these hypomorphic missense mutations in ataxia families as well as literature data lend credence to the concept that numerous recessive ataxias are caused by partial loss of function mutations in a large variety of pathophysiological pathways, as a consequence of an exquisite sensitivity of cerebellar, spinocerebellar and deep sensory neurons to even mild metabolic insults.

Les paraplégies spastiques héréditaires (PSH) font partie d’un groupe plus large de pathologies neurodégénératives associant une spasticité. J’ai exploré la variabilité clinique et moléculaire de ces pathologies à l’aide d’une cohorte de familles soudanaises. Nous avons recruté 41 familles soudanaises [337 individus/106 atteints de PSH]. J’ai extrait l’ADN génomique et constitué une banque. Le criblage de gènes candidats a été réalisé dans 4 familles en fonction du phénotype des patients. La technologie de séquençage de nouvelle génération (SNG) appliquée à 74 gènes de PSH a ensuite été appliquée aux 37 cas restants. Enfin, le séquençage de l’exome a permis de rechercher les gènes en cause dans les cas négatifs. Dans certains cas, des études fonctionnelles ont été utilisées afin de valider l’effet biologique des mutations. J’ai pu identifier la cause génétique dans 17 familles. Dans 12 familles, la mutation concernait un gène de PSH connu. Dans 3 familles, un nouveau gène a été identifié. 5 gènes candidats restent à départager dans 2 familles. Il est à noter que parfois, de multiple mutations ou maladies génétiques ségrégaient dans nos familles, dans la même branche ou dans des branches séparées. La complexité de ces familles fortement consanguines a rendu l’analyse des données du SNG difficile. Une autre particularité a été l’hétérogénéité clinique associée à des mutations du même gène entre patients de la même famille ou en comparaison avec la littérature. Ce travail est la première étude à grande échelle de patients soudanais avec PSH et rapporte de nouveaux gènes en cause, prérequis pour mieux comprendre dans le futur les mécanismes sous-jacents. / Hereditary spastic paraplegias (HSP), a heterogeneous group of spastic neurodegenerative disorders which impose diagnostic challenges. I explored the clinical varieties and genetic pathways of spastic neurodegeneration in a familial Sudanese cohort. We recruited 41 Sudanese families [337 individuals/106 HSP patients]. I have established a genomic DNA bank and when necessary, skin biopsies and fibroblasts were also obtained. A phenotype-based candidate gene approach was followed in 4 families. A targeted next generation sequencing (NGS) for 74 HSP-related genes was the main screening strategy in all-remaining 37 families. Whole exome sequencing (WES) was done in search for novel mutations in new genes in families with negative screening results. Occasionally, functional studies were conducted when feasible and relevant. I identified the genetic cause in 17/41 families. In 12 families, the mutated genes were known HSP genes. In 3 families, novel genes were identified mutated. 5 candidate genes segregated with disease in 2 other families with more experiments needed to conclude. Analysis of the NGS screening panel and of WES data imposed certain challenges as multiple genetic disorders were sometimes found running in parallel in the same/different branches of highly inbred families. We could expand the phenotypic heterogeneity of these disorders due to clinical differences observed between Sudanese patients and patients of other origins even when caused by mutations by the same gene/variant. This is the first genetic screening in a large set of HSP families in Sudan. It describes new causative genes, paving the way for further deciphering of the underlying mechanisms.