La TriméthylGuanosine Synthase 1 de levure (Tgs1) à été identifiée à la suite d’un criblage double hybride en utilisant l’extrémité basique carboxy-terminale de la protéine SmB, cœur des snRNP, comme appât. Il a été également montré que Tgs1 interagit spécifiquement avec le domaine carboxyl-terminal basique KKD/E des protéines Nop58p et Cbf5p, deux composants protéiques du coeur des snoRNP. Le gène TGS1 n’est pas essentiel mais sa délétion confère un phénotype de cryo-sensibilité associé à un léger défaut d’épissage à basse température, associé à la rétention de U1 dans le nucléole. La recherche de substrats pour cette protéine a montré que Tgs1p est capable de méthyler la coiffe monométhylée des snARN et des snoARN transcrits par l’ARN polymérase II. La grande majorité des snoARN joue un rôle dans la sélection des sites de modifications de plusieurs classes d’ARN. Certains, par contre, sont impliqués dans la voie de synthèse des ribosomes, un processus comprenant de multiples étapes de clivages endo- et exoribonucléotidiques et ayant lieu dans le nucléole où les facteurs impliqués dans ces réactions se concentrent en plusieurs domaines distincts. Le point de départ de ce travail de thèse a été de tester un possible rôle de Tgs1p et/ou de la triméthylation dans la biosynthèse du ribosome. Dans un premier temps, l’analyse du processing des ARN ribosomiques dans la souche délétée pour TGS1 nous a permis de mettre en évidence l’implication de Tgs1 dans la formation de l’ARNr de la petite sous-unité, l’ARNr 18S. Des mutants catalytiques de Tgs1, incapables de reconnaître et de modifier les coiffes m7G, ont été crées. L’analyse de la voie de biogenèse des ribosomes dans ces souches ne présente pas les défauts constatés dans la souche délétée, révélant que c’est la protéine et non sa fonction catalytique qui est requise. De plus, ces mutants sont autant défectueux dans l’épissage des ARN messagers, excluant toute implication du défaut d’épissage dans le ralentissement de la voie de biogenèse des ribosomes observé dans la souche délétée. L’ultrastructure des souches délétées pour TGS1 observée en microscopie électronique nous a permis de mettre en évidence un effet de l’absence de Tgs1 sur la morphologie nucléolaire. En effet, le nucléole dans ces souches ne présente plus de nucléole structuré, bi-compartimenté. Les analyses en microscopie à fluorescence ont confirmé la disparition de la ségrégation des deux compartiments nucléolaires, suggérant que le défaut dans la biogenèse des ribosomes puisse être une conséquence de la perte de cohérence du nucléole. La caractérisation de l’environnement physique et fonctionnel de Tgs1 a été entreprise afin de mettre à jour des fonctions additionnelles de la protéine. Diverses approches ont été envisagées: la recherche de partenaires physiques par l’emploi d’un allèle de TGS1 étiquetté TAP permettant la purification puis l’analyse de partenaires physiques ainsi que la recherche de partenaires fonctionnels par la méthode du crible synthétique létal. La recherche de partenaires physiques a permis de révéler l’existence d’un grand nombre d’ARN non codants coprécipités avec Tgs1. Certains sont des substrats connus de la protéine mais un grand nombre d’ARN ne possédant pas de coiffes monométhylées. La recherche de partenaires fonctionnels a permis la découverte de candidats synthétiques létaux appartenant à deux groupes, un groupe lié à l’épissage des ARN messagers et un autre groupe constitué de membres du complexe SWR1, complexe impliqué dans la régulation transcriptionnelle par modification de la chromatine. Lors de ce crible de candidats synthétiques létaux, il est apparu que la délétion de TGS1 restaure partiellement le défaut de croissance à chaud induit par la délétion du gène RRP47, dont le produit est impliqué dans la maturation de l’extrémité 3’ de plusieurs types d’ARN non codants. Les travaux préliminaires effectués ne permettent pas encore d’expliquer un tel phénotype. Au cours de ce travail de thèse, nous avons pu répondre à un certain nombre de questions sur la fonction et le rôle de Tgs1 dans la cellule. La fonction catalytique de Tgs1 dans la méthylation des coiffes m7G est clairement nécessaire à l’efficacité de l’épissage des ARN messagers mais le rôle de la triméthylation de la coiffe des snoARN n’est pas élucidé à ce jour. Le fait que la fonction catalytique de Tgs1 n’est pas impliquée dans le défaut dans la biogenèse des ribosomes et la découverte du rôle de la protéine dans la morphologie nucléolaire, laisse entrevoir l’existence de fonctions additionnelles de Tgs1 dans la cellule. La caractérisation de son environnement physique et fonctionnel abonde justement dans ce sens, mettant à jour plusieurs interactions probablement liées à sa fonction catalytique, notamment dans l’épissage des ARN messagers mais également un grand nombre d’interactions impliquant la participation de Tgs1 dans d’autres voies métaboliques.

Les « terminal balls » qui constituent des complexes de maturation sont détectées à l’extrémité 5’-terminale des transcrits ribosomiques naissants dans tous les organismes eucaryotes inspectés à ce jour ; générant les images de référence en « arbres de Noël ». La compaction séquentielle des « terminal balls », à présent également dénommées « SSU-processome », reflète les étapes d’assemblage co-transcriptionnel des ribosomes. Au cours de ma thèse, j’ai développé une stratégie expérimentale basée sur l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) qui m’a permis de valider, et ce pour la première fois, in vivo la structure des branches des arbres de Noël (en particulier un rapprochement du « SSU-processome » à l’extrémité 5’- du gène encodant l’ARNr 25S). Notre stratégie nous permet également d’aborder la composition moléculaire des « arbres de Noël ». La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique dont la finalité est la synthèse et l’assemblage de 4 molécules d’ARN et de ~80 protéines ribosomiques dans un processus qui requiert l’intervention transitoire et concertée de non moins de 400 facteurs de maturation. D’une telle complexité a récemment émergé le concept de l’existence de modules pré-assemblés autonomes de facteurs de maturation. Dans le cas du « SSU-processome », les trois sous-complexes UTP-A, UTP-B, UTP-C ont d’ores et déjà été décrits. L’existence de tels sous-complexes renforce la notion d’un mécanisme d’assemblage hautement hiérarchisé. En effet, il s’est avéré que l’extrémité 5’- du transcrit naissant est initialement liée par le sous-complexe UTP-A dans une étape qui est un pré-requis indispensable au recrutement et à l’assemblage des autres composants du « SSU-processome ». Avec autant d’étapes distinctes dans le processus d’assemblage, la possibilité d’erreur est conséquente, d’où l’importance de l’existence de mécanismes de contrôles de qualité. Toutes les protéines constituant le « SSU-processome » sont requises au clivage des précurseurs d’ARN ribosomique. Préalablement à mon travail, les 7 sous-unités protéiques du complexe UTP-A avaient, en outre, spécifiquement été impliquées dans la synthèse de l’ARN, c’est-à-dire dans la fonction de l’ARN polymérase I. Ceci leur a conféré leur seconde appellation de tUTP, pour transcription UTP, et offert les prémices de l’existence d’une interface physique et fonctionnelle entre les machineries de synthèse et de maturation des ARNr. Au cours de ma thèse, j’ai démontré qu’il n’en est rien. Une inspection minutieuse m’a en effet révélé que les tUTP/UTP-A ne sont nullement requises à la synthèse des ARN ribosomiques mais bien à leur stabilité. Cette observation m’a mené à proposer que la cellule a développé au cours de l’évolution un mécanisme de contrôle de qualité par lequel elle s’assure de l’intégrité des étapes initiales d’assemblage (liaison du complexe UTP-A ). Mon postulat est qu’en l’absence de la liaison de ces facteurs de maturation précoces, les ARN sont rapidement dégradés par un mécanisme que nous avons dénommé « Death by Default (DBD) » par l’activité de surveillance nucléolaire exercée par le complexe de polyadényaltion TRAMP et d’exoribonucléases 3’-5’ l’ Exosome.

Les terminal balls qui constituent des complexes de maturation sont détectées<p>à l’extrémité 5’-terminale des transcrits ribosomiques naissants dans tous les organismes<p>eucaryotes inspectés à ce jour ;générant les images de référence en « arbres de Noël ».<p>La compaction séquentielle des « terminal balls », à présent également dénommées<p>« SSU-processome », reflète les étapes d’assemblage co-transcriptionnel des ribosomes.<p>Au cours de ma thèse, j’ai développé une stratégie expérimentale basée sur<p>l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) qui m’a permis de valider, et ce pour la<p>première fois, in vivo la structure des branches des arbres de Noël (en particulier un<p>rapprochement du « SSU-processome » à l’extrémité 5’- du gène encodant l’ARNr 25S).<p>Notre stratégie nous permet également d’aborder la composition moléculaire des « arbres<p>de Noël ».<p>La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique dont la<p>finalité est la synthèse et l’assemblage de 4 molécules d’ARN et de ~80 protéines<p>ribosomiques dans un processus qui requiert l’intervention transitoire et concertée de non<p>moins de 400 facteurs de maturation. D’une telle complexité a récemment émergé le<p>concept de l’existence de modules pré-assemblés autonomes de facteurs de maturation.<p>Dans le cas du « SSU-processome », les trois sous-complexes UTP-A, UTP-B, UTP-C<p>ont d’ores et déjà été décrits. L’existence de tels sous-complexes renforce la notion d’un<p>mécanisme d’assemblage hautement hiérarchisé. En effet, il s’est avéré que l’extrémité<p>5’- du transcrit naissant est initialement liée par le sous-complexe UTP-A dans une étape<p>qui est un pré-requis indispensable au recrutement et à l’assemblage des autres<p>composants du « SSU-processome ». Avec autant d’étapes distinctes dans le processus<p>d’assemblage, la possibilité d’erreur est conséquente, d’où l’importance de l’existence de<p>mécanismes de contrôles de qualité.<p>Toutes les protéines constituant le « SSU-processome » sont requises au clivage<p>des précurseurs d’ARN ribosomique. Préalablement à mon travail, les 7 sous-unités<p>protéiques du complexe UTP-A avaient, en outre, spécifiquement été impliquées dans la<p>synthèse de l’ARN, c’est-à-dire dans la fonction de l’ARN polymérase I. Ceci leur a<p>conféré leur seconde appellation de tUTP, pour transcription UTP, et offert les prémices<p>de l’existence d’une interface physique et fonctionnelle entre les machineries de synthèse<p>et de maturation des ARNr. Au cours de ma thèse, j’ai démontré qu’il n’en est rien. Une<p>inspection minutieuse m’a en effet révélé que les tUTP/UTP-A ne sont nullement<p>requises à la synthèse des ARN ribosomiques mais bien à leur stabilité. Cette observation<p>m’a mené à proposer que la cellule a développé au cours de l’évolution un mécanisme de<p>contrôle de qualité par lequel elle s’assure de l’intégrité des étapes initiales d’assemblage<p>(liaison du complexe UTP-A ). Mon postulat est qu’en l’absence de la liaison de ces<p>facteurs de maturation précoces, les ARN sont rapidement dégradés par un mécanisme<p>que nous avons dénommé « Death by Default (DBD) » par l’activité de surveillance<p>nucléolaire exercée par le complexe de polyadényaltion TRAMP et d’exoribonucléases<p>3’-5’ l’ Exosome. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La TriméthylGuanosine Synthase 1 de levure (Tgs1) à été identifiée à la suite d’un criblage double hybride en utilisant l’extrémité basique carboxy-terminale de la protéine SmB, cœur des snRNP, comme appât. Il a été également montré que Tgs1 interagit spécifiquement avec le domaine carboxyl-terminal basique KKD/E des protéines Nop58p et Cbf5p, deux composants protéiques du coeur des snoRNP. Le gène TGS1 n’est pas essentiel mais sa délétion confère un phénotype de cryo-sensibilité associé à un léger défaut d’épissage à basse température, associé à la rétention de U1 dans le nucléole. La recherche de substrats pour cette protéine a montré que Tgs1p est capable de méthyler la coiffe monométhylée des snARN et des snoARN transcrits par l’ARN polymérase II. La grande majorité des snoARN joue un rôle dans la sélection des sites de modifications de plusieurs classes d’ARN. Certains, par contre, sont impliqués dans la voie de synthèse des ribosomes, un processus comprenant de multiples étapes de clivages endo- et exoribonucléotidiques et ayant lieu dans le nucléole où les facteurs impliqués dans ces réactions se concentrent en plusieurs domaines distincts. Le point de départ de ce travail de thèse a été de tester un possible rôle de Tgs1p et/ou de la triméthylation dans la biosynthèse du ribosome.<p><p>Dans un premier temps, l’analyse du processing des ARN ribosomiques dans la souche délétée pour TGS1 nous a permis de mettre en évidence l’implication de Tgs1 dans la formation de l’ARNr de la petite sous-unité, l’ARNr 18S. Des mutants catalytiques de Tgs1, incapables de reconnaître et de modifier les coiffes m7G, ont été crées. L’analyse de la voie de biogenèse des ribosomes dans ces souches ne présente pas les défauts constatés dans la souche délétée, révélant que c’est la protéine et non sa fonction catalytique qui est requise. De plus, ces mutants sont autant défectueux dans l’épissage des ARN messagers, excluant toute implication du défaut d’épissage dans le ralentissement de la voie de biogenèse des ribosomes observé dans la souche délétée. L’ultrastructure des souches délétées pour TGS1 observée en microscopie électronique nous a permis de mettre en évidence un effet de l’absence de Tgs1 sur la morphologie nucléolaire. En effet, le nucléole dans ces souches ne présente plus de nucléole structuré, bi-compartimenté. Les analyses en microscopie à fluorescence ont confirmé la disparition de la ségrégation des deux compartiments nucléolaires, suggérant que le défaut dans la biogenèse des ribosomes puisse être une conséquence de la perte de cohérence du nucléole.<p>La caractérisation de l’environnement physique et fonctionnel de Tgs1 a été entreprise afin de mettre à jour des fonctions additionnelles de la protéine. Diverses approches ont été envisagées: la recherche de partenaires physiques par l’emploi d’un allèle de TGS1 étiquetté TAP permettant la purification puis l’analyse de partenaires physiques ainsi que la recherche de partenaires fonctionnels par la méthode du crible synthétique létal. La recherche de partenaires physiques a permis de révéler l’existence d’un grand nombre d’ARN non codants coprécipités avec Tgs1. Certains sont des substrats connus de la protéine mais un grand nombre d’ARN ne possédant pas de coiffes monométhylées. La recherche de partenaires fonctionnels a permis la découverte de candidats synthétiques létaux appartenant à deux groupes, un groupe lié à l’épissage des ARN messagers et un autre groupe constitué de membres du complexe SWR1, complexe impliqué dans la régulation transcriptionnelle par modification de la chromatine. Lors de ce crible de candidats synthétiques létaux, il est apparu que la délétion de TGS1 restaure partiellement le défaut de croissance à chaud induit par la délétion du gène RRP47, dont le produit est impliqué dans la maturation de l’extrémité 3’ de plusieurs types d’ARN non codants. Les travaux préliminaires effectués ne permettent pas encore d’expliquer un tel phénotype.<p><p>Au cours de ce travail de thèse, nous avons pu répondre à un certain nombre de questions sur la fonction et le rôle de Tgs1 dans la cellule. La fonction catalytique de Tgs1 dans la méthylation des coiffes m7G est clairement nécessaire à l’efficacité de l’épissage des ARN messagers mais le rôle de la triméthylation de la coiffe des snoARN n’est pas élucidé à ce jour. Le fait que la fonction catalytique de Tgs1 n’est pas impliquée dans le défaut dans la biogenèse des ribosomes et la découverte du rôle de la protéine dans la morphologie nucléolaire, laisse entrevoir l’existence de fonctions additionnelles de Tgs1 dans la cellule. La caractérisation de son environnement physique et fonctionnel abonde justement dans ce sens, mettant à jour plusieurs interactions probablement liées à sa fonction catalytique, notamment dans l’épissage des ARN messagers mais également un grand nombre d’interactions impliquant la participation de Tgs1 dans d’autres voies métaboliques. <p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le noyau des cellules est une structure très organisée, dont l'organisation joue un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes. La compréhension des mécanismes à l'origine de cette organisation est donc essentielle à la compréhension du fonctionnement des génomes. De nombreuses expériences conduites chez la souris ont montré que les régions centromériques (RC) des chromosomes jouent un rôle dans l'organisation du noyau. L'organisation spatiale des RCs humaines est beaucoup moins étudiée, principalement à cause de la complexité des séquences qui les composent, qui rend plus difficile leur détection. Nous avons développé des outils de traitement et d'analyse quantitative d'image, qui, combinés à des nouveaux marqueurs des RCs humaines, nous ont permis de mieux décrire deux aspects de leur organisation spatiale. D'une part nous avons montré qu'elles se positionnent préférentiellement en périphérie du noyau ou aux bords des nucléoles, avec des fréquences qui dépendent des chromosomes. D'autre part nous avons montré qu'elles s'agrègent dans le noyau pour former un compartiment d'hétérochromatine, qui présente des caractéristiques similaires à celui observé dans d'autres espèces telles que la souris. Ces deux aspects sont tous deux inter-dépendants et varient au cours du cycle cellulaire. Cette description nouvelle met sur la piste de mécanismes responsables de l'organisation particulière des RCs, qui pourront être étudiés grâce à la méthode d'analyse et aux observables que nous avons développées. L'étude de ces mécanismes permettra de mieux comprendre la fonction des RCs humaines dans l'organisation du noyau. / The cell nucleus is a highly organized structure, playing an important role in gene regulation. Understanding the underlying mechanisms is therefore essential for understanding genome function. Numerous studies conducted in mouse cells have shown that centromeric regions (RC) of chromosomes play a role in nuclear organization. The spatial organization of human RCs is less studied, mainly because of the complexity of the underlying DNA sequences that make them hard to detect. We have developed image processing and analysis tools, that, combined with new markers for human RCs, have allowed us to draw a better description of two features of their spatial organization. On the one hand, we have shown that they are preferentially located close to the nuclear periphery or nucleoli borders, with chromosome-dependent frequencies. On the other hand, we have shown that they cluster to form a heterochromatic compartment that displays similar properties as the one observed in other species such as mouse. Both features are inter-dependent, and vary throughout the cell-cycle. This new description puts on the track of mechanisms responsible for the peculiar organization of RCs. Those mechanisms could be studied using the methodology and the observables we have developed. The study of those mechanisms will provide a better understanding of human RC function in nuclear organization.

Dans cette thèse, j’ai cherché à étudier l’impact du contenu et de la structure du nucléole sur les fonctions nucléolaires chez A. thaliana. Pour cela je me suis appuyée sur deux cas concrets : 1- J’ai réalisé le protéome du nucléole et caractérisé une de ces activités non-ribosomales / 2- J’ai étudié l’impact du fer nucléolaire dans la biogenèse des ribosomes.D’une part, le protéome nucléolaire d’A. thaliana m’a permis d’identifier des protéines nucléolaires dont les fonctions connues sont extra-ribosomales. Ainsi j’ai démontré que l’activité du protéasome 26S peut être régulée par le nucléole. Plus précisément l’activité du protéasome diminue lors d’une déstructuration du nucléole. De plus, j’ai constaté que le protéasome 26S, conjointement avec la protéine Nucléoline, pourrait avoir un rôle dans la transcription et/ou la maturation des ARNr.D’autre part, j’ai démontré que l’absence de fer nucléolaire (chez des plantes mutantes nas1,2,4) provoque une augmentation des structures nucléolaires propices à la transcription (les centres fibrillaires). Cette observation est corrélée à la transcription de l’ADNr du NOR2, normalement réprimé. Et, de manière inattendue, est liée avec l’hyperméthylation des promoteurs des ADNr en contexte CHH. Il se peut alors que le fer régule des facteurs impliqués dans les mécanismes épigénétiques responsables de la répression ou de l’activation des ADNr. / The aim of this thesis work is to highlight the impact of both nucleolus content and structure on nucleolar functions in A. thaliana. For this I followed two approaches: 1- I performed nucleolus proteome and characterized one of its non-ribosomal activity / 2- I studied nucleolar iron impact on ribosomes biogenesis.Firstly, the A. thaliana nucleolar proteome allowed me to identify nucleolar proteins with non-ribosomal functions. Among these, I showed that 26S proteasome activity can be regulated by nucleolus. More precisely, proteasome activity decreases with nucleolus disorganization. Moreover, I also showed that 26S proteasome, together with Nucleolin, might play a role in ribosomal RNA transcription and/or maturation.Secondly, I proved that loss of nucleolar iron (in nas1,2,4 mutant plants) induces an increase of nucleolar transcriptional structures (fibrillar centers). This observation is correlated with the transcription of normally silenced rDNA from NOR2 and, interestingly, with hypermethylation of rDNA promoters in CHH context. And so, iron might regulate factors implicated in epigenetic pathways responsible of either rDNA transcription or repression.

Le nucléole est le lieu où débute la synthèse des ribosomes. Sa structure est fortement corrélée à la transcription des gènes ribosomiques. La régulation de l'expression des gènes ribosomiques est une étape importante de la biogenèse des ribosomes. L'objectif de ce travail a été de définir et d'ouvrir des voies méthodologiques pour mettre en évidence le rôle de macroH2A et de la nucléoline dans la régulation de l'expression des gènes ribosomiques. MacroH2A est pour l'instant le seul variant d'histone présent dans le nucléole. La nucléoline est une des protéines majoritaires du nucléole. La première partie de notre étude a porté sur un système cellulaire original celui de la carpe dont l'adaptation aux conditions climatiques (hiver et été) requiert des changements importants dans l'expression génique. Ainsi la répression de l'expression des ARN ribosomiques, associée à une baisse d'activité cellulaire, est concomitante avec (i) une déstructuration du nucléole, (ii) une augmentation de la concentration de macroH2A et de la nucléoline et (iii) une augmentation de la méthylation d'îlots CpG. Il existe donc une corrélation entre l'expression des gènes ribosomiques et le niveau d'expression de macroH2A. Pour analyser la distribution de macroH2A sur une fibre de chromatine, nous avons utilisé la technique d'étirement de la chromatine. Nous avons montré que macroH2A co-localise avec la tri-méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 qui est un marqueur de l'hétérochromatine. De plus, la distribution de macroH2A est périodique suggérant un rôle de cette histone dans une organisation particulière de la chromatine. Enfin, nous avons développé au laboratoire un système cellulaire reposant sur l'inhibition de la nucléoline par RNAi dans des cellules HeLa. Les conséquences de l'inhibition de la nucléoline sont multiples : une diminution de la synthèse de l'ARN pré-ribosomique accompagnée d'une perturbation de la structure du nucléole et d'un arrêt du cycle cellulaire en mitose pouvant conduire à l'apoptose. La nucléoline est donc largement impliquée dans la régulation de l'expression des gènes ribosomiques.

NEDD8, molécule de la famille de l’ubiquitine est essentielle au développement, à la croissance et à la viabilité d’un organisme, de plus c’est une cible prometteuse en thérapeutique. Nous avons découvert que l’inhibiteur spécifique de la NEDDylation, MLN4924 altère la morphologie sans fragmentation et augmente la surface du nucléole de cellules humaines et de noyaux de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans. Une approche de protéomique quantitative (SILAC) combiné à l’analyse de la production des ARNr et des ribosomes montrent que MLN4924 change la composition protéique du nucléole sans affecter l’activité transcriptionnelle de l’ARN pol I. Notre analyse montre que MLN4924 active p53 par la voie RPL11/RPL5-Mdm2 caractéristique d’un stress du nucléole. Cette étude identifie le nucléole comme une cible intéressante dans l’utilisation d’inhibiteurs de la NEDDylation et apporte un nouveau mécanisme d’activation de p53 par inhibition de la voie NEDD8.Dans une seconde étude nous avons adapté la méthode de FLIM-FRET (« Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy – Förster Resonance Energy Transfer ») à l’étude de la compaction de la chromatine à l’échelle du nanomètre dans un organisme vivant. Le nématode Caenorhabditis elegans s’est révélé être un modèle de choix. Au sein des chromosomes méiotiques, nous avons identifié différentes régions de compaction, de niveau variable par mesure du FRET entre histones fusionnées à des protéines fluorescentes. Par une approche originale d’ARN interférence et injection d’un « extra-chromosome » nous avons défini l’architecture à une nano-échelle de différents états de l’hétérochromatine et montré que cette organisation est contrôlée par les protéines HP1 « Heterochromatin Protein 1 » et SETDB1, une protéine « H3-Lysine 9 methyl transferase ». Nous avons également montré que la compaction de l’hétérochromatine est dépendante des condensines I et II et plus particulièrement la condensine I contrôle l’état faiblement compacté de la chromatine.Nos travaux ont confirmé que C. elegans est un modèle d’intérêt majeur pour l’étude des compartiments nucléaires et parfaitement adapté pour des études pré-clinique. / The ubiquitin-like molecule NEDD8 is conserved and essential for viability, growth and development; its activation pathway is a promising target for therapeutic intervention. We found that the small molecule inhibitor of NEDDylation, MLN4924, alters the morphology and increases the surface size of the nucleolus in human cells and Caenorhabditis elegans germ cells in the absence of nucleolar fragmentation. Through SILAC proteomic analysis and rRNA production, processing and ribosome profiling, we show that MLN4924 changes the composition of the nucleolar proteome but does not inhibit RNA Pol I transcription. Further analysis demonstrates that MLN4924 activates the p53 tumour suppressor through the RPL11/RPL5-Mdm2 pathway, with characteristics of nucleolar stress. The study identifies the nucleolus as a target of the NEDDylation pathway and provides a mechanism for p53 activation upon NEDD8 inhibition.Then we adapted a quantitative FRET (Förster resonance energy transfer)-based fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) approach to assay the nano-scale chromatin compaction in a living organism, the nematode Caenorhabditis elegans. By measuring FRET between histone-tagged fluorescent proteins, we visualized distinct chromosomal regions and quantified the different levels of nanoscale compaction in meiotic cells. Using RNAi and repetitive extrachromosomal array approaches, we defined the heterochromatin state and showed that its architecture presents a nanoscale-compacted organization controlled by Heterochromatin Protein-1 (HP1) and SETDB1 H3-lysine-9 methyl-transferase homologs in vivo. Next, we functionally explored condensin complexes. We found that condensin I and condensin II are essential for heterochromatin compaction and that condensin I additionally controls lowly compacted regions. Our data show that, in living animals, nanoscale chromatin compaction is controlled not only by histone modifiers and readers but also by condensin complexes.We confirm that C. elegans is an interesting model to study nuclear signalling and perfectly adapt to be a platform for pre-clinical studies.

Les insuffisances médullaires héréditaires (IMH) réunissent quatre syndromes principaux : le syndrome de Shwachman-Diamond, la Dyskératose Congénitale, l’anémie de Diamond Blackfan et l'anémie de Fanconi (FA) qui est le syndrome le plus fréquent. Alors que l'étiologie des autres IMH est reliée à des défauts de biogenèse des ribosomes ou d'homéostasie du nucléole, l'étiologie de la FA est considérée comme reposant principalement sur des défauts de réparation de l'ADN.La FA est un syndrome autosomique récessif rare qui inclut des défauts de développement, une prédisposition au cancer et des défauts hématologiques progressifs. Les patients présentent une pancytopénie précoce associée à une myélodysplasie qui les prédispose à la leucémie myéloïde aiguë. La sensibilité cellulaire aux agents pontants de l'ADN est la principale caractéristique qui distingue ce syndrome des autres IMH. La maladie est causée par des mutations homozygotes de la voie FANC-BRCA, qui réunit plus de vingt protéines nécessaires pour la réparation des pontages interbrins de l'ADN ainsi que pour la gestion du stress réplicatif et des conflits entre transcription et réplication. Parmi ces protéines, FANCA est retrouvée mutée chez 60% des patients atteints de FA.Dans ce travail, nous avons cherché à investiguer si la voie FANC ou la protéine FANCA étaient impliquées dans le fonctionnement du nucléole ou dans la biogenèse des ribosomes.Nous avons observé que les cellules déficientes en protéine FANCA ont une homéostasie nucléolaire altérée ainsi qu'une synthèse et une maturation des ARNr ralenties. Ces caractéristiques sont indépendantes de la signalisation des dommages de l'ADN mais sont à mettre en lien avec la présence de conflits entre la transcription et la réplication dans le nucléole. Nous avons montré que la déstructuration du nucléole mène à la stabilisation de la protéine p21 par la protéine nucléolaire NPM1. Egalement, nous avons montré que les ribosomes des cellules déficientes en protéine FANCA présentent un déséquilibre de Facteurs Eucaryotes d'Initiation de la traduction (EIFs) et de certaines isoformes de protéines ribosomales, telle que l'augmentation de la protéine RPL22L1, entrainant une baisse de la traduction.En conclusion, ce travail montre que le stress nucléolaire est impliqué dans l'étiologie de la FA, ce qui relie la FA aux autres IMH. Cette observation incite à étudier les relations entre la réponse aux dommages de l'ADN et le stress nucléolaire dans l'apparition de l'insuffisance médullaire. / Inherited bone marrow failure syndromes (iBMFs) group four main syndromes: Shwachman-Diamond syndrome, Dyskeratosis Congenita, Diamond Blackfan anemia and Fanconi anemia (FA), which is the most frequent one. Whereas the pathogenesis of the other iBMFs is linked to ribosomal biogenesis and nucleolar abnormalities, the pathogenesis of FA is considered to be mainly due to misrepaired DNA damage.The FA syndrome is a rare autosomic recessive disorder, which includes developmental defects, cancer predisposition and evolutive haematological alterations. The patients present an early pancytopenia associated with a progressive myelodysplasia that eventually predisposes them to acute myeloid leukemia. Cellular hypersensitivity to crosslinking agents is the main difference between this syndrome and other iBMFs. The pathology is due to homozygous mutations in the FANC-BRCA pathway, that groups more than twenty proteins necessary for interstrand crosslinks (ICls) repair, replication stress response and managing of conflicts between replication and transcription. Among them, the FANCA protein is mutated in 60% of the FA patients.In this work, we asked whether the FANC pathway or the FANCA protein might be involved in the nucleolar homeostasy or in ribosomal biogenesis.We observed that FANCA defective cells have an altered nucleolar homeostasy and a slowed ribosomal rRNA synthesis and processing, independently from DNA damage signalling but related to conflicts between replication and transcription in the nucleolus. We show that the destructuration of the nucleolus can lead to p21 stabilisation by the nucleolar protein NPM1. Also, we show that ribosomes in FANCA deficient cells present a misbalance of Eukaryotic translation Initiation Factors (EIFs), and of some ribosomal proteins isoforms, such as the increase of RPL22L1, leading to a translation slowdown.In conclusion, this study shows that nucleolar stress is involved in FA pathogenesis, which links FA to other iBMFs. This paves the way for the investigation of interplays between DNA damage and nucleolar stress in bone marrow failure onset.

Le repliement des protéines est un processus cellulaire crucial impliquant plusieurs protéines dont la calnexine, une chaperone du réticulum endoplasmique. Notre laboratoire et un autre groupe avons démontré que la calnexine est essentielle à la viabilité de la levure Schizosaccharomyces pombe. Dans le cadre d’études structure-fonction portant sur cette protéine, nous avons découvert un phénomène permettant la viabilité des cellules en absence de la calnexine. Cet état, nommé Cin pour calnexine independence, est induit par un mutant de la calnexine dépourvu du domaine central hautement conservé (Δhcd_Cnx1p). La caractérisation de l’état Cin a révélé plusieurs caractéristiques particulières telle la dominance, sa transmission de façon non-Mendélienne à la progéniture méïotique et sa transmission par des extraits protéiques dépourvus d’acides nucléiques. Toutes ces propriétés suggèrent donc que l’état Cin est médié via un élément de type prion. Le gène cif1+, pour calnexin independence factor, a été isolé lors de criblages visant à identifier des gènes impliqués dans l’état Cin. Il encode pour une protéine orpheline dont la surexpression induit de façon stable un état de viabilité en l’absence de la calnexine. Cet état diffère génétiquement et phénotypiquement de l’état Cin induit par le mutant Δhcd_Cnx1p préalablement caractérisé, ce qui suggère deux voies parallèles de signalisation du phénomène Cin. Une caractérisation exhaustive de Cif1p a permis de démontrer qu’il ne s’agissait pas du prion responsable de l’état Cin, malgré que cette protéine possède certaines propriétés typiques des prions in vitro. Finalement, Cif1p est une protéine nucléolaire dont la bonne localisation est essentielle à sa capacité à induire l’état Cin. Ceci suggère une interaction entre la fonction essentielle de la calnexine et une fonction exécutée dans le nucléole. Lors d’études visant à élucider la fonction cellulaire de Cif1p, il a été établi qu’elle interagissait avec certaines protéines de la grosse sous-unité du ribosome telle la protéine L3. Cependant, Cif1p ne co-sédimente pas avec des sous-unités ribosomales assemblées, des ribosomes ou des polysomes. De plus, des cellules contenant une délétion génomique de cif1 voient leur contenu en ribosomes perturbé lors de la phase stationnaire. Il semble donc que Cif1p joue un rôle dans la biosynthèse des ribosomes lors de la phase stationnaire. Ce rôle spécifique à cette phase de croissance coincide avec un clivage de la portion N-terminale de Cif1p, clivage qui a lieu lors de l’entrée des cellules en phase stationnaire. De plus, des études effectuées récemment dans notre laboratoire proposent que la calnexine joue un rôle important dans la signalisation de l’apoptose, et ce particulièrement en phase stationnaire. Ainsi, une voie impliquant Cif1p, sa fonction nucléolaire dans la biosynthèse des ribosomes en phase stationnaire, la calnexine et la médiation de l’apoptose semble se dessiner. D’autres travaux, notamment sur la fonction exacte de Cif1p, le rôle de son clivage et les autres composantes impliquées dans le phénomène Cin nous permettront de dessiner un portrait plus complet de cette voie cellulaire inédite. / Protein folding is a vital process that involves many proteins of the cell. One of them is calnexin, a chaperone of the endoplasmic reticulum. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, calnexin is essential for survival of the cells. During structure-function studies on calnexin, our laboratory discovered a phenomenon allowing the viability of cells without this chaperone. This state, designated Cin for Calnexin INdependence, is induced by a calnexin mutant devoid of the highly conserved central domain (Δhcd_Cnx1p). Characterization of the Cin cells showed several exceptional properties such as dominance, non-Mendelian transmission and transmission via cell extracts devoid of nucleic acids of the Cin state. All these observations suggested that the Cin phenomenon is mediated via a prionic element. To identify genes implicated in the Cin state, genetic screens were performed. They led to the identification of the cif1+ gene, for calnexin independence factor. This gene encodes an orphan protein, the overexpression of which stably induces a state of viability in the absence of calnexin. Notably, this state is genetically and phenotypically distinct from the previously isolated Cin state arising from Δhcd_Cnx1p expression. This suggests the presence of two parallel pathways both able to signal the induction of the Cin phenomenon. The exhaustive characterization of Cif1p showed that it is not the prion solely responsible for the Cin state, although it displays prion-like properties in vitro. Finally, nucleolar localization of Cif1p is required to induce the Cincif1 state, thus suggesting an unexpected interaction between the vital cellular role of calnexin and a function of the nucleolus. While investigating Cif1p function in the cell, we observed that it interacts with ribosomal proteins of the large subunit, notably L3, but it does not sediment with assembled ribosomal subunits or whole ribosomes. However, cells containing a genomic deletion of cif1 also have a disrupted ribosome content during stationary phase. Altogether, these results suggest that Cif1p has a role in ribosomal biogenesis during stationary phase. This growth-phase specific role correlates with the occurence during stationary phase of a cleavage in the N-terminal part of Cif1p. Recent studies from our laboratory proposed that calnexin plays an important role in apoptosis signaling, especially in stationary phase. Thus, a pathway implicating Cif1p, its nucleolar function in ribosome biosynthesis in stationary phase, calnexin and apoptosis signaling is starting to emerge. However more studies, notably on the exact function of Cif1p, the role of its cleavage and the other proteins implicated in the Cin state will be necessary to draw the complete scheme of this unprecedented cellular pathway.