Le noyau des cellules est une structure très organisée, dont l'organisation joue un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes. La compréhension des mécanismes à l'origine de cette organisation est donc essentielle à la compréhension du fonctionnement des génomes. De nombreuses expériences conduites chez la souris ont montré que les régions centromériques (RC) des chromosomes jouent un rôle dans l'organisation du noyau. L'organisation spatiale des RCs humaines est beaucoup moins étudiée, principalement à cause de la complexité des séquences qui les composent, qui rend plus difficile leur détection. Nous avons développé des outils de traitement et d'analyse quantitative d'image, qui, combinés à des nouveaux marqueurs des RCs humaines, nous ont permis de mieux décrire deux aspects de leur organisation spatiale. D'une part nous avons montré qu'elles se positionnent préférentiellement en périphérie du noyau ou aux bords des nucléoles, avec des fréquences qui dépendent des chromosomes. D'autre part nous avons montré qu'elles s'agrègent dans le noyau pour former un compartiment d'hétérochromatine, qui présente des caractéristiques similaires à celui observé dans d'autres espèces telles que la souris. Ces deux aspects sont tous deux inter-dépendants et varient au cours du cycle cellulaire. Cette description nouvelle met sur la piste de mécanismes responsables de l'organisation particulière des RCs, qui pourront être étudiés grâce à la méthode d'analyse et aux observables que nous avons développées. L'étude de ces mécanismes permettra de mieux comprendre la fonction des RCs humaines dans l'organisation du noyau.

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Comme le nucléole joue un rôle fondamental dans l’expression des protéines, via la synthèse des ARN ribosomiques, il n’est donc pas surprenant que des études aient révélé un lien étroit, entre des dysfonctionnements nucléolaires et l’origine de certaines maladies humaines. La découverte, il y a plusieurs années, d’un taux anormalement élevé de protéines nucléolaires dites argyrophiles ou AgNORs, dans les cellules tumorales, a permis d’envisager leur utilisation comme outil diagnostique ou pronostique du cancer. Détectées, de manière in vitro grâce à leur affinité pour l’argent, l’identification de quelques protéines AgNORs n’a pourtant pas permis d’établir une caractéristique commune à toutes les protéines argyrophiles détectées dans les extraits nucléolaires. Ainsi, bien que le test colorimétrique AgNOR soit utilisé dans de nombreux laboratoires académiques, l’absence d’identification de protéines AgNORs spécifiques du processus de cancérisation, a limité son utilisation en laboratoire clinique. Comme certaines limites technologiques et expérimentales ont limité leur caractérisation chez l’humain, nous avons donc décidé de reprendre les recherches sur ce sujet et de le réactualiser grâce aux avancées technologiques et scientifiques. Les protéines AgNORs étant étroitement liées à la biogenèse des ribosomes, nous avons donc décidé d’amorcer nos recherches chez la levure Saccharomyces cerevisiae, dans laquelle, la voie de biosynthèse des ribosomes a été particulièrement bien décrite. Devant l’intérêt biologique et médical de ces protéines, l’objectif de ce projet a donc été triple :<p>1-identifier des protéines AgNORs chez la levure<p>2-caractériser les propriétés physico-fonctionnelles et physico-chimiques de ces protéines AgNORs.<p>3-utiliser ces caractéristiques physico-chimiques pour rechercher de nouvelles AgNORs humaines, spécifiques de processus de cancérisation et potentiellement utilisables comme marqueurs tumoraux./The nucleolus is a subnuclear compartment that organized around ribosomal gene (rDNA) repeats NORs, which encode for ribosomal RNA. A peculiar group of acidic proteins which are highly argyrophilic are also localized at the same sites as NORs, thus allowing NORs to be very clearly and rapidly visualized by silver nitrate staining procedures. However, if three human argyrophilic proteins, UBF, C23 (nucleolin) and B23 (nucleophosmin), have been associated for staining of NOR, the exact number of AgNOR proteins and their intrinsic biochemical feature are unclear. Here, we have performed an heterologous screen in a genetically tractable eukaryotic organism (budding yeast) for the identification of novel AgNOR proteins and in vitro characterized an intrinsic feature that underlies silver binding and offers a strong predictive value for the identification of novel human AgNOR proteins. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ki-67 maintient l'hétérochromatine constitutive lors de la prolifération cellulaire. La protéine Ki-67 est fortement exprimée dans le noyau des cellules de mammifères en prolifération. Sa présence est devenue un marqueur de référence en histopathologie diagnostic dans le cancer avec 330 millions de références sur des sites Internet et plus de 18 000 articles indexés avec le mot clé Ki-67 dans PubMed. Malgré son utilisation comme référence incontestable de la prolifération cellulaire, les rôles fonctionnels, les régulations et les mécanismes moléculaires où Ki-67 est impliquée demeurent obscurs. Depuis l'identification de Ki-67 en 1983, les différentes études avec l'utilisation d'outils moléculaires (anticorps, oligonucléotide antisens, shRNA, siRNA) qui inhibent l'expression de Ki-67 dans des cellules cancéreuses de tous types ont mis en évidence une forte régression à leur prolifération. La localisation prédominate de Ki-67 est dans le nucléole, son inactivation photodynamique abroge la transcription de l'ARN ribosomal qui est requis pour la prolifération cellulaire. Le consensus est que Ki-67 favorise la prolifération cellulaire, mais à ce jour aucune étude n'a mis en évidence ni un mécanisme d'action, ni un rôle essentiel de Ki-67 dans la prolifération cellulaire in vivo. Dans notre travail, nous abordons la question du rôle de Ki-67 dans les cellules humaines cancéreuses non transformées en culture ainsi qu'in vivo chez la souris. Nous avons montré que Ki-67 n'est pas nécessaire pour la prolifération cellulaire. En revanche, Ki-67 est indispensable pour maintenir la structure de l'hétérochromatine constitutive. Nous avons mis en évidence des nouveaux mécanismes de régulation de l'expression de Ki-67 au cours du cycle cellulaire, sa transcription étant contrôlé par CDK4/6 via la phosphorylation de la protéine rétinoblastome, et sa dégradation en G1 tardive via APC/C-Cdh1. Après extinction de l'expression de Ki-67 par ARNi ou par ablation du gène de Ki-67 par la nouvelle approche TALEN, nous n'avons observé aucun effet sur la synthèse de l'ARN ribosomique, sur le déroulement normal du cycle cellulaire, sur le développement embryonnaire ou la fertilité de la souris. Par contre, son extinction inhibe la progression des tumeurs dans des modèles de Xénogreffes, et induit un remodelage du paysage de l'expression de certain gènes. Notre étude par protéomique des protéines interragissant avec Ki-67 a identifié des protéines nucléolaires à l'interface entre l'hétérochromatine périnucléolaires et les composants granulaires nucléolaires. Ces complexes protéiques empêchent la dispersion de l'hétérochromatine constitutive au cours du cycle cellulaire. Au vu de nos résultats, nous concluons que dans les cellules non-proliférantes l'anémie de Ki-67 est associée à la diffusion de l'hétérochromatine constitutive. Ki-67 est indispensable à la maintenance de cette hétérochromatine qui serait essentielle pour le développement des tumeurs. / Ki-67 links constitutive heterochromatin maintenance to cell proliferation.Ubiquitous nuclear expression of Ki-67 in proliferating mammalian cells has led to its use as a benchmark diagnostic marker for cell proliferation, especially in cancer histopathology. Its importance is reflected by over 330 million hits when searching using the keyword “Ki-67” on Google, and over 18,000 papers on PubMed. In spite of its use as a surrogate marker for cell proliferation, the mechanisms of regulation of Ki-67 expression and its physiological functions in cell proliferation remain obscure. Early functional studies found that inhibition of Ki-67 expression by injection of antisense oligonucleotides or inactivating antibodies into cultured cancer cells inhibited cell proliferation. This is in agreement with later results obtained by peptide-nucleic acid, antisense oligonucleotide, siRNA or shRNA experiments in various cancer cell lines. Photodynamic inactivation of Ki-67 abrogates ribosomal RNA transcription, consistent with its predominantly nucleolar localisation and apparent requirement for cell proliferation. However, a recent study in HeLa cells found only minor effects on the cell cycle distribution upon Ki-67 knockdown. Nevertheless, Ki-67 is required for localising several nucleolar proteins to the mitotic chromosome periphery, potentially providing a mechanism for nucleolar assembly, as previously suggested by segregating nucleolar components upon cell division and chromosome segregation. Therefore, although the consensus is that Ki-67 promotes cell proliferation, this has not been clearly demonstrated, and no studies have ascertained requirements for Ki-67 in vivo.In this work, we address these questions in non-transformed human cells and cancer cells in culture and in vivo in mice. We have shown that Ki-67 is dispensable for cell proliferation but is required to maintain constitutive heterochromatin. We found that Ki-67 expression is cell cycle-dependent due to dynamic control by CDK4/6 and Cdh1. However, silencing of Ki-67 by RNAi or a TALEN-mediated Ki-67 gene ablation had no effect on ribosomal RNA synthesis, cell cycling, mouse development or fertility, but prevented tumour progression and led to remodelling of the gene expression landscape in cycling cells. Interaction proteomics and functional assays revealed that Ki-67 defines the boundary between perinucleolar heterochromatin and the nucleolar granular components, and prevents dispersal of constitutive heterochromatin during cell cycling. Conversely, Ki-67 downregulation in non-proliferating cells is associated with constitutive heterochromatin dispersal. The results suggest that Ki-67 mediates organisation of heterochromatin, and allows efficient tumour progression.

Le nucléole est le site de biogenèse des ribosomes, qui commence par la transcription des gènes d’ARN ribosomique (ARNr). Cependant, le nucléole est également impliqué dans d'autres processus cellulaires, comme l’organisation 3D du génome. Ainsi, des régions génomiques appelées NADs pour Nucleolus-Associated chromatin Domains, ont été identifiées dans des cellules animales et végétales. Ces régions sont surtout hétérochromatiques et les gènes associés ont tendance a être peu ou pas transcrits. Un des objectifs de ma thèse a été d’étudier l’implication du nucléole dans l’organisation de la chromatine au sein du noyau et la régulation transcriptionnelle de gènes transcrits par l’ARN Polymérase II chez Arabidopsis thaliana. Par ailleurs, parmi les centaines de copies de gènes d’ARNr, uniquement une fraction participe au processus de biogenèse des ribosomes. Dans un second temps, j’ai donc étudié le rôle de ces copies inactives. On a pu démontrer que l’absence des gènes d’ARNr inactifs n’engendre pas de changements majeurs dans la fonction nucléolaire. Par contre, ces copies participent à la stabilité du génome. En effet, en leur absence, des duplications génomiques allant jusqu’à plusieurs centaines de kilobases s’accumulent, entraînant des duplications de gènes et des différences du niveau d’expression de ces derniers. Finalement, les effets de ces changements structuraux sur la biologie de la plante sont discutés. / The nucleolus is the site of ribosome biogenesis, which begins with the transcription of ribosomal RNA (rRNA) genes. However, the nucleolus is also involved in other cellular processes, such as the 3D genome organization. Thus, genomic regions called NADs for Nucleolus-Associated chromatin Domains, have been identified in animal and plant cells. These regions are mostly heterochromatic and the associated genes tend to be poorly transcribed. One of the objectives of my thesis was to study the involvement of the nucleolus in the 3D genome organization and the transcriptional regulation of genes transcribed by RNA Polymerase II in Arabidopsis thaliana. In addition, only a fraction of rRNA gene copies participates in the process of ribosome biogenesis. In a second time, I studied the role of the inactive rRNA gene copies. We show that in their absence, there is no major changes in the nucleolus function. However, these copies contribute to genome stability. Indeed, in their absence, up to several hundred of kilobases long duplication events accumulate, resulting in the duplication and the differential expression of hundreds of genes. Finally, the impact of these structural changes on the plant biology are discussed.

Le premier membre de la famille des rétrovirus humains HTLV (Virus T-lymphotropique Humain), HTLV-1, a été découvert en 1980 et l’on estime aujourd’hui à plus de 10 millions le nombre d’individus infectés à travers le monde. Après une période de latence d’environ 40 ans, 5% des individus infectés développent des leucémies, des lymphomes adultes de lymphocytes T (ATLL) ou encore une myélopathie associée à HTLV-1/ paraparésie spastique tropicale (HAM/TSP). L’apparition de la maladie serait en grande partie orchestrée par deux protéines virales, soit Tax et HTLV-1 bZIP factor (HBZ). L’expression du génome viral se fait à partir d’un transcrit sens de pleine longueur suite à un épissage alternatif, à l’exception du gène HBZ. HBZ est produite à partir d’un transcrit antisens initié dans la séquence terminale longue répétée (LTR)’3. Elle a été décrite comme étant capable de réguler négativement la transcription virale dépendante de Tax en se dimérisant avec des facteurs de transcription cellulaires tels que CREB-2 et certains membres de la famille Jun. HBZ a aussi un pouvoir prolifératif et bien que nous ne sachions toujours pas le mécanisme moléculaire menant à l’oncogenèse par HBZ, nous savons qu’elle module une multitude de voies de transduction de signaux, dont AP-1. Nous avons récemment mis en évidence un transcrit antisens nommé Antisense Protein of HTLV-2 (APH-2) chez HTLV-2 qui n’est associé qu’à une myélopathie apparentée au HAM/TSP. Ce n’est qu’en 2005 que HTLV-3 et HTLV-4 se sont rajoutés au groupe HTLV. Cependant, aucune corrélation avec le développement d’une quelconque maladie n’a été montrée jusqu’à ce jour. Le premier volet de ce projet de doctorat avait pour objectif de détecter et caractériser les transcrits antisens produits par HTLV-3 et HTLV-4 et d’étudier les protéines traduites à partir de ces transcrits pour ainsi évaluer leurs similitudes et/ou différences avec HBZ et APH-2. Nos études de localisation cellulaire réalisées par microscopie confocale ont montré que APH-3 et APH-4 sont des protéines nucléaires, se retrouvant sous la forme de granules et, dans le cas d’APH-3, partiellement cytoplasmique. Ces granules co-localisent en partie avec HBZ. Les analyses à l’aide d’un gène rapporteur luciférase contenant le LTR 5’ de HTLV-1 ont montré que APH-3 et APH-4 peuvent aussi inhiber la transactivation du LTR 5’ par Tax. Aussi, des études faisant appel au gène rapporteur précédé d’un promoteur de collagénase (site AP-1), ont montré que ces deux protéines, contrairement à HBZ, activent la transcription dépendante de tous les membres des facteurs de transcription de la famille Jun. De plus, les mutants ont montré que le motif fermeture éclair (LZ) atypique de ces protéines est impliqué dans cette régulation. En effet, APH-3 et APH-4 modulent la voie Jun-dépendante en se dimérisant via leur LZ atypique avec la famille Jun et semblent activer la voie par un mécanisme ne faisant pas par d’un domaine activateur autonome. Dans un deuxième volet, nous avions comme objectif d’approfondir nos connaissances sur la localisation nucléolaire de HBZ. Lors de nos analyses, nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction, B23 et la nucléoline, qui semblent être associés à sa localisation nucléolaire. En effet, ces interactions sont plus fortes suivant une délétion des domaines AD et bZIP de HBZ qui dans ce cas est localisée strictement au nucléole. De plus, bien que APH-3 et APH-4 puissent se localiser aux nucléoles, HBZ est la seule protéine traduite à partir d’un transcrit antisens pouvant interagir avec B23. Finalement, ces travaux ont clairement mis en évidence que HTLV-3 et HTLV-4 permettent la production de transcrits antisens comme chez d’autres rétrovirus. Les protéines traduites à partir de ces transcrits antisens jouent d’importants rôles dans la réplication rétrovirale mais semblent avoir des fonctions différentes de celles de HBZ au niveau de la régulation de la transcription de la voie Jun. HBZ semble aussi jouer un rôle unique dans le nucléole en ciblant les protéines nucléolaires de la cellule. Ces études démontrent que les protéines produites à partir de transcrits antisens chez les rétrovirus HTLV partagent plusieurs ressemblances, mais démontrent aussi des différences. Ainsi, les APH pourraient, en tant qu’outil comparatif, aider à mieux cibler les mécanismes moléculaires importants utilisés par HBZ pour induire la pathogénèse associée à une infection par HTLV. / The first human T-cell lymphotropic virus (HTLV) family member was discovered in 1980 and it is estimated that approximately 10 million people are infected with HTLV-1 worldwide. After about 40 years, 5% of infected individuals will develop an adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) while another 4% will develop HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). It is believed that two viral proteins, Tax and HBZ, together orchestrate the oncogenic process. The viral proteins are expressed from an alternatively spliced sense transcript except for the HBZ gene. HBZ is translated from an antisense transcript initiated in the long terminal repeat (LTR)’3. This viral protein is capable of inhibiting Tax transactivation of the LTR5’ by dimerizing with cellular transcription factors such as CREB-2 and c-Jun. HBZ also has proliferating capacities and while the molecular mechanisms leading to the disease still need to be elucidated, it is well known that HBZ can modulate a multitude of signal transduction pathways like AP-1. We have recently discovered an antisense transcript termed Antisense Protein of HTLV-2 (APH-2) produced in HTLV-2. HTLV-2 is only associated to myelopathies resembling HAM/TSP. HTLV-3 and HTLV-4 were discovered in 2005 and have not been associated with any type of disease thus far. The first goal of this PhD project was hence to detect and characterize the antisense transcripts produced in HTLV-3 and HTLV-4, to study the functions of these translated proteins and to evaluate their similarities and/or differences shared with HBZ and APH-2. Our localization studies using confocal microscopy demonstrated that APH-3 and APH-4 are found in the nucleus as speckles, and for APH-3, also partially cytoplasmic. These two proteins can also partially colocalize with HBZ. Using a luciferase reporter plasmid bearing the HTLV-1 LTR5’, we demonstrated that APH-3 and APH-4 could inhibit Tax transactivation of the LTR5’. We also used a luciferase reporter plasmid bearing the collagenase promoter, which bears an AP-1 site, and demonstrated that both viral proteins could activate transcription in the presence of any of the Jun family of transcription factors. We generated several mutants and the atypical leucine zipper (LZ) found in APH-3 and APH-4 is crucial for this regulation. In fact, APH-3 and APH-4 using their atypical LZ dimerize with Jun family members and activate this pathway using a mechanism other than an autonomous activation domain. Our next goal was to investigate the significance of the HBZ nucleolar localization. During this project, we identified two new interacting partners, B23 and nucleolin, which seem to be associated with its nucleolar localization. In fact, these interactions are stronger when HBZ is deleted of its AD and bZIP domains and hence when HBZ demonstrates a stronger nucleolar distribution. Moreover, while APH-3 and APH-4 are also found in the nucleolus, HBZ is the only antisense protein able to interact with B23. Finally, this work clearly demonstrates that HTLV-3 and HTLV-4 can produce an antisense transcript alike other retroviruses. The encoded proteins play an important role in retroviral replication and seem to regulate Jun-dependant transcription differently than HBZ. HBZ also seems to have a unique role in the nucleoli by targeting specific cellular nucleolar proteins. Similarities but also differences are shared between the antisense proteins. Thus, the APH proteins represent a good comparative tool in order to better understand the molecular mechanisms involved in HTLV induced diseases.

L’intégrité de l’ADN est continuellement remise en question par divers agents endogènes et exogènes (p. ex., la lumière ultraviolette, la fumée de cigarette, la pollution de l’environnement, les dommages oxydatifs, etc.) qui causent des lésions de l’ADN qui interfèrent avec les fonctions cellulaires correctes. Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER) supprime les adduits d’ADN déformantes l’hélice tels que les lésions induites par les UV et il existe dans deux sous voies distinctes selon l’endroit où les lésions de l’ADN sont situées dans le génome. L’une de ces sous voies est directement liée à la transcription de l’ADN (TCR) par l’ARN Polymérase 2 (ARNP2). Dans la première partie de ce travail, nous avons démontré qu’un mécanisme NER entièrement compétent est également nécessaire pour la réparation de l’ADN ribosomique (ADNr), transcrite par ARN Polymérase 1 (ARNP1) et représentant 60 % de la transcription cellulaire totale. De plus, nous avons identifié et clarifié le mécanisme de deux protéines responsables du repositionnement nucléolaire dépendant des UV de l’ARNP1 et de l’ADNr observé pendant la réparation. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié la fonctionne moléculaire de la protéine XAB2 lors de la réparation NER et nous avons démontré son implication dans le processus TCR. De plus, nous avons également montré la présence de XAB2 dans un complexe d’épissage du pré-ARNm. Enfin, nous avons décrit l’impact de XAB2 sur la mobilité de l’ARNP2 lors des premières étapes de la réparation TCR, suggérant ainsi un rôle de XAB2 dans le processus de reconnaissance des lésions / The integrity of DNA is continuously challenged by a variety of endogenous and exogenous agents (e.g. ultraviolet light, cigarette smoke, environmental pollution, oxidative damage, etc.) that cause DNA lesions which interfere with proper cellular functions. Nucleotide Excision Repair (NER) mechanism removes helix-distorting DNA adducts such as UV-induced lesions and it exists in two distinct sub-pathways depending where DNA lesions are located within the genome. One of these sub pathways is directly linked to the DNA transcription by RNA Polymerase 2 (TCR). In the first part of this work, we demonstrated that a fully proficient NER mechanism is also necessary for repair of ribosomal DNA, transcribed by RNA polymerase 1 and accounting for the 60 % of the total cellular transcription. Furthermore, we identified and clarified the mechanism of two proteins responsible for the UV-dependent nucleolar repositioning of RNAP1 and rDNA observed during repair. In the second part of this work, we studied the molecular function of the XAB2 protein during NER repair and we demonstrated its involvement in the TCR process. In addition, we also shown the presence of XAB2 in a pre-mRNA splicing complex. Finally, we described the impact of XAB2 on RNAP2 mobility during the first steps of TCR repair, thus suggesting a role of XAB2 in the lesion recognition process

Condensine est un complexe protéique organisateur du génome qui conduit l’assemblage des chromosomes et promeut leur transmission fidèle en anaphase. De nombreuses études ont rapporté des changements dans les niveaux des ARNs cellulaires quand Condensine est défaillante, suggérant un rôle pour Condensine dans la régulation de l’expression génique. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont demeurés énigmatiques, et l’on ignore dans quelle mesure le rôle joué par Condensine dans l’expression génique est lié ou non à sa fonction dans l’organisation des chromosomes. Lors de ma thèse, j’ai étudié l’activité de Condensine dans la régulation de l’expression génique en utilisant la levure S. pombe comme organisme modèle. Contrairement à l’idée communément admise, mes résultats montrent que Condensine ne joue aucun rôle direct dans le maintien du transcriptome, ni en interphase, ni en mitose chez cette levure. En accord avec les études précédentes, j’observe des changements de niveau et de qualité des ARNs dans les cellules mutantes pour Condensine au sortir de la mitose ; des ARNs non codants et des ARNs aberrants, étendus en 3’, s’accumulent. En revanche, je démontre que ces changements sont la conséquence de défauts de transmission des chromosomes en anaphase. L’inactivation de Condensine cause la non-disjonction de l’ADN ribosomique et du nucléole, entrainant une déplétion de l’ARN-exosome des cellules filles, lesquelles accumulent alors des ARNs normalement dégradés par l’ARN-exosome. De façon cruciale, je montre qu’empêcher les anomalies de migration des chromosomes restaure une expression normale des gènes malgré l’inactivation de Condensine, démontrant que c’est l’instabilité chromosomique qui est source des changements d’expression génique observés quand Condensine est défaillante, et non le complexe Condensine en tant que tel. Ce travail remet en question le concept de régulation de l’expression génique par les complexes Condensine et appelle à la prudence lorsque l’on cherche à étudier les fonctions de ces complexes en dehors de la condensation de la chromatine en mitose. / Condensin is a genome organiser that shape chromosomes and promote their accurate transmission in anaphase. Several studies have related changes in RNA level when Condensin is defective, suggesting that the complex has also a role in gene expression. However, the mechanisms have remained enigmatic and we still don’t know to what extent it is related to its role in chromosome organization. During my thesis, I studied the role played by Condensin in the regulation of gene expression using S. pombe as a model system. In contrast to previous studies, my results provide compelling evidence that Condensin plays no direct role in the maintenance of the transcriptome, neither during interphase nor during mitosis in this yeast. Accordingly to previous studies, I observed changes in RNA level in cells mutated for Condensin; non coding and 3’ extended RNA accumulate. However, I showed that the changes in gene expression in post-mitotic fission yeast cells that result from Condensin inactivation are largely a consequence of chromosome missegregation during anaphase, which notably depletes the RNA-exosome from daughter cells. Crucially, preventing karyotype abnormalities in daughter cells restores a normal transcriptome despite Condensin inactivation. Thus, chromosome instability, rather than a direct role of Condensin in the transcription process, changes gene expression. This work challenges the concept of gene regulation by canonical Condensin complexes and ask for caution when studying Condensin role outside chromosome condensation in mitosis.

Au cours de ce travail de thèse expérimental, nous nous sommes intéressés à l’étude de la localisation nucléaire et nucléolaire de la protéine de la nucléocapside (NC) du VIH-1. Des études antérieures menées au laboratoire avaient mis en évidence une très forte accumulation de la NC dans les nucléoles. Ce compartiment nucléaire est connu pour être ciblé par de nombreux virus afin de promouvoir leur réplication. Des expériences de microscopie électronique avaient révélé la structure complexe du nucléole et montré qu’il est composé de trois sous-compartiments : les centres fibrillaires, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire dans lesquels se déroule la synthèse des ribosomes. Afin de caractériser la localisation de la NC dans ces trois sous-compartiments, nous avons développé une approche de microscopie optique à haute résolution permettant d’obtenir des images à deux couleurs avec une résolution spatiale améliorée. Pour cela, nous avons mis au point un protocole qui permet d’utiliser simultanément une protéine fluorescente photocommutable et un fluorophore organique introduit par immunomarquage. Après avoir minimisé les aberrations optiques et corrigé les dérives mécaniques inhérentes au montage, nous avons visualisé simultanément la localisation de la NC surexprimée dans des cellules HeLa avec des marqueurs spécifiques des trois sous-compartiments nucléolaires (immunomarquage). La microscopie de fluorescence à haute résolution a permis de résoudre pour la première fois les différents compartiments et de montrer que la NC se localise préférentiellement dans le compartiment granulaire. Finalement, des expériences préliminaires avec des cellules vivantes ont permis de mettre en évidence que la NC est transportée de manière active dans le noyau et qu’elle pourrait interagir directement avec des protéines nucléolaires / During this experimental thesis work, we investigated the nuclear and nucleolar localization of the nucleocapsid protein (NC) of HIV-1. Previous studies performed in our laboratory evidenced a strong accumulation of NC in a subnuclear structure called nucleolus. Playing role in multiple cellular processes, nucleolus is often targeted by viruses to promote their replication. Electron microscopy revealed three nucleolar components (fibrillar centers, dense fibrillar component and granular component) associated to specific steps of the ribosome biogenesis. To characterize the distribution of the NC in these three sub-compartments and therefore shed light on the nucleolar localization of NC during the replication cycle, we developed a high-resolution optical microscopy approach. After having minimized the optical aberrations and corrected the mechanical drifts inherent to the imaging setup, the NC-mEos2 fusion protein overexpressed in HeLa cells was visualized simultaneously with immunolabeled nucleolar markers. The use of high-resolution fluorescence microscopy enabled us to resolve for the first time the three nucleolar compartments and to demonstrate the preferential localization of NC in the granular compartment of nucleolus. Finally, preliminary experiments performed with living cells showed that NC is actively transported in the nucleus and therefore may interact directly with nucleolar proteins.

La synthèse du ribosome est un processus compliqué, très hiérarchisé et essentiel à toutes les cellules vivantes. La complexité de ce processus tient notamment au fait que les différentes étapes de la biogenèse du ribosome eucaryote sont temporellement et spatialement organisées dans des compartiments cellulaires différents (le nucléole, le nucléoplasme et le cytoplasme). Il est toutefois connu que le pré-ARNr 35S (le précurseur de trois des quatre ARNr, les ARNr 18S, 5.8S et 25S) est pris en charge dès sa synthèse par des facteurs impliqués dans sa maturation. Ainsi, la formation d’un ribosome requiert l’association, sur le transcrit naissant, des facteurs de synthèse, au nombre de 400. Ces facteurs essentiels interagissent transitoirement avec l’ARNr et ne font pas partie des particules ribosomiques matures impliquées dans la traduction. Leur rôle est d’assister le remodelage constant du pré-ribosome et le processus d’assemblage des sous-unités.<p>Parmi ces facteurs de synthèse, nous avons caractérisé en détail, chez la levure et chez l’homme, la protéine Las1 impliquée dans la maturation des deux extrémités de l’ITS2, séquence qui sépare les ARNr 5.8S et 25S/28S. Chez la levure, en absence de la protéine Las1, les analyses de profils de polysomes révèlent un déficit de sous-unité 60S et l’apparition d’« halfmères ». Les techniques de purification d’affinité et de gradient de sédimentation nous indiquent que Las1 est associée aux pré-ribosomes 60S et qu’elle interagit avec de nombreux facteurs de synthèse de la petite, de la grande sous-unité ou des deux. De plus, Las1 copurifie avec des pré-ribosomes qui contiennent aussi les exoribonucléases 5’-3’ Rat1/Rai1 et Xrn1. Rai1 coordonne la maturation aux deux extrémités de l’ARNr 5.8S. Nous suggérons que Las1 appartient à un macrocomplexe connectant spatialement des sites de clivages éloignés sur la séquence primaire du pré-ARNr qui seraient rapprochés suite au reploiement de l’ITS2.<p>Un autre aspect de ce travail de thèse consiste en l’étude de l’assemblage des particules ribonucléoprotéiques et plus spécifiquement du pré-ribosome et des sous-unités ribosomiques eucaryotes. Nous avons utilisé la technique d’immunoprécipitation de chromatine (Ch-IP) pour caractériser l’assemblage d’une structure appelée le « SSU processome ». Celui-ci correspond à un pré-ribosome en formation ainsi que l’assemblage des protéines ribosomiques sur l’ARNr naissant.<p>Enfin, nous avons étudié le rôle d’une plateforme d’activation de méthyltransférases d’ARN et de protéines, la protéine Trm112 dans la ribogenèse. Nous avons montré que chez la levure, Trm112 est impliquée dans la synthèse du ribosome et dans la progression de la mitose. En absence de cette protéine, les pré-ARNr sont dégradés par un mécanisme de surveillance. Trm112 copurifie avec plusieurs facteurs de synthèse du ribosome dont la méthyltransférase Bud23, impliquée dans la modification post-transcriptionnelle de l’ARNr18S. Trm112 est requise pour cette méthylation et nous postulons que la protéine Bud23 est incapable de se lier aux pré-ribosomes en l’absence de Trm112.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished