Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Bien que très proches dans leur organisation génomique, le rétrovirus HTLV-1 est impliqué dans le développement de la leucémie à cellule T de l’adulte (ATL) alors que l’infection par HTLV-2 n’a jamais été associée à des désordres hématologiques malins. La transformation des cellules infectées par HTLV-1 a longtemps été attribuée uniquement à la protéine virale transactivatrice Tax (Tax-1). Cependant, son expression est très faible dans les cellules ATL. La protéine HBZ a été découverte en 2002. Elle est traduite à partir d'un ARNm transcrit à partir du LTR 3' d'HTLV-1 et est exprimée par les cellules infectées issues de tous les patients HTLV-1 quel que soit leur statut clinique. HBZ participe au maintien du phénotype tumoral en stimulant la prolifération des cellules leucémiques et intervient dans l'échappement du virus au système immunitaire. Des analyses in silico nous avaient permis de détecter un cadre ouvert de lecture sur le brin complémentaire de l’ARN génomique d’HTLV-2. Mon travail de thèse a consisté à amplifier et caractériser d’une part le transcrit APH-2 et d’autre part la protéine qui en est issue. Nous avons démontré dans un premier temps que la transcription d’APH-2 était initié dans le LTR 3’ et que le transcrit APH-2 était épissé et poly-adénylé. Nous avons ensuite mis en évidence l’expression d’APH-2 dans les lignées infectées par HTLV-2, ainsi que dans des cultures de lymphocytes issus de deux porteurs sains africains. La mise au point d’une technique quantitative de RT-PCR nous a permis de détecter APH-2 ex vivo chez 94% des individus d’une série de 51 porteurs sains américains. Nous avons aussi montré que l'expression de cet ARNm était proportionnelle à la charge provirale. APH-2 code une protéine de 183 acides aminés dont nous avons mis en évidence l’expression dans la lignée MO. Mes travaux ont aussi permis de démontrer le rôle inhibiteur d’APH-2 sur la transcription virale malgré l’absence d’un domaine bZip classique, ainsi que son interaction avec le facteur de transcription CREB. Par immunofluorescence, nous avons établi la localisation nucléaire d’APH-2. La protéine semble associée aux corps PML grâce à une région de six arginines comprise entre les résidus 78 et 92. Cependant, contrairement à HBZ, nous n’avons pas observé d’interactions entre APH-2 et les facteurs cJun, JunD ou le cofacteur de transcription CBP/p300. De plus nous avons observé qu’APH-2 était incapable d’induire la prolifération des lymphocytes in vitro alors qu’une lymphocytose est souvent observée chez les porteurs d’HTLV-2. Grâce à une approche comparative, mes travaux ont ainsi permis d’apporter des éléments nouveaux dans la compréhension de la différence de pathogénicité qu’il existe entre HTLV-1 et HTLV-2. / Although they are very similar in their genomic organization, the HTLV-1 retrovirus is involved in the development of adult T cell leukaemia (ATL) while HTLV-2 has not been associated to any malignant haematological disorders. The tumoral transformation of infected cells was widely associated to the viral transactivactor protein Tax (Tax-1), which modulates many cellular functions. However, its expression is slightly in ATL cells. In 2002, the HBZ protein was discovered, encoded from the 3’ LTR by the complementary strand of HTLV-1 and expressed by all HTLV-1 infected people. HBZ participates in the maintenance of the tumoral phenotype by stimulating leukemic cells proliferation and is involved in the immune system escape. We recently detected a coding region by an in silico analysis in the complementary strand of HTLV-2. My work consisted in the characterization of the APH-2 transcript, and in a second part, of the associated protein. At first, we characterized the APH-2 transcription initiation in the 3’LTR and that transcript was spliced and poly-adenylated and demonstrated that the APH-2 expression in all HTLV-2 cell lines and in short cultured lymphocytes from African healthy carriers. We used a quantitative RT-PCR on uncultured cells from 51 American HTLV-2 healthy carriers and we we detected APH-2 expression in 94% of them. We then showed that APH-2 RNA expression is correlated to the HTLV-2 proviral load. The APH-2 transcript encoded a 183 amino acid protein that was shown to be expressed in the HTLV-2 infected Mo cell line. Our work demonstrated the inhibitory functions of APH-2 in the viral transcription and its interaction with the transcriptional cofactor CREB despite the lack of a bZip domain. By an immunofluorescence approach we established the nuclear localisation of APH-2, which is in particular in the PML nuclear bodies. We demonstrated that six arginines in the 78-92 amino acids region is involved in this PML colocalization. Contrary to HBZ, we didn’t observe any interaction with between APH-2 and cJun or JunD factors nor with the transcriptional cofactor CBP/p300. Furthermore we showed that APH-2 is not involved in lymphocyte proliferation in vitro although a lymphocytosis is often observed in HTLV-2 carriers. According to this comparative approach, my work allowed us to better understand the difference of pathogenicity existing between HTLV-1 and HTLV-2.

Master of Agribusiness / Department of Agricultural Economics / Allen M. Featherstone / Multiple Peril Crop Insurance (MPCI) is a federally subsidized crop insurance program designed to mitigate risk for farmers across the United States. Many changes in technology and weather have increased yields in recent years. This has caused some to argue for the crop insurance program to consider yield trends when setting yields for the producer. This thesis evaluates alternative Actual Production History (APH) methods for corn to determine differences in the methods and the resulting APH. The key issue to be evaluated is that a producer’s APH may not be reflective of their “yield goal.” The thesis examined how the APH can differ under alternative methods of calculating an APH. Some methods examined are currently used by the Risk Management Agency (RMA). Other methods are hypothetical alternatives. This study examines alternative methods on a national, county, and a farm level. This thesis demonstrates that adjusting APHs for yield trends provides a higher APH than an un-trended APH. The 7 Year Olympic Trended APH provides the highest APH in most cases for all the methods examined. The RMA Un-trended APH proved to provide the least yield on average for all methods examined. This demonstrates the importance of adjusting for yield trends to factor in agricultural technology advancements over time.

Le premier membre de la famille des rétrovirus humains HTLV (Virus T-lymphotropique Humain), HTLV-1, a été découvert en 1980 et l’on estime aujourd’hui à plus de 10 millions le nombre d’individus infectés à travers le monde. Après une période de latence d’environ 40 ans, 5% des individus infectés développent des leucémies, des lymphomes adultes de lymphocytes T (ATLL) ou encore une myélopathie associée à HTLV-1/ paraparésie spastique tropicale (HAM/TSP). L’apparition de la maladie serait en grande partie orchestrée par deux protéines virales, soit Tax et HTLV-1 bZIP factor (HBZ). L’expression du génome viral se fait à partir d’un transcrit sens de pleine longueur suite à un épissage alternatif, à l’exception du gène HBZ. HBZ est produite à partir d’un transcrit antisens initié dans la séquence terminale longue répétée (LTR)’3. Elle a été décrite comme étant capable de réguler négativement la transcription virale dépendante de Tax en se dimérisant avec des facteurs de transcription cellulaires tels que CREB-2 et certains membres de la famille Jun. HBZ a aussi un pouvoir prolifératif et bien que nous ne sachions toujours pas le mécanisme moléculaire menant à l’oncogenèse par HBZ, nous savons qu’elle module une multitude de voies de transduction de signaux, dont AP-1. Nous avons récemment mis en évidence un transcrit antisens nommé Antisense Protein of HTLV-2 (APH-2) chez HTLV-2 qui n’est associé qu’à une myélopathie apparentée au HAM/TSP. Ce n’est qu’en 2005 que HTLV-3 et HTLV-4 se sont rajoutés au groupe HTLV. Cependant, aucune corrélation avec le développement d’une quelconque maladie n’a été montrée jusqu’à ce jour. Le premier volet de ce projet de doctorat avait pour objectif de détecter et caractériser les transcrits antisens produits par HTLV-3 et HTLV-4 et d’étudier les protéines traduites à partir de ces transcrits pour ainsi évaluer leurs similitudes et/ou différences avec HBZ et APH-2. Nos études de localisation cellulaire réalisées par microscopie confocale ont montré que APH-3 et APH-4 sont des protéines nucléaires, se retrouvant sous la forme de granules et, dans le cas d’APH-3, partiellement cytoplasmique. Ces granules co-localisent en partie avec HBZ. Les analyses à l’aide d’un gène rapporteur luciférase contenant le LTR 5’ de HTLV-1 ont montré que APH-3 et APH-4 peuvent aussi inhiber la transactivation du LTR 5’ par Tax. Aussi, des études faisant appel au gène rapporteur précédé d’un promoteur de collagénase (site AP-1), ont montré que ces deux protéines, contrairement à HBZ, activent la transcription dépendante de tous les membres des facteurs de transcription de la famille Jun. De plus, les mutants ont montré que le motif fermeture éclair (LZ) atypique de ces protéines est impliqué dans cette régulation. En effet, APH-3 et APH-4 modulent la voie Jun-dépendante en se dimérisant via leur LZ atypique avec la famille Jun et semblent activer la voie par un mécanisme ne faisant pas par d’un domaine activateur autonome. Dans un deuxième volet, nous avions comme objectif d’approfondir nos connaissances sur la localisation nucléolaire de HBZ. Lors de nos analyses, nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction, B23 et la nucléoline, qui semblent être associés à sa localisation nucléolaire. En effet, ces interactions sont plus fortes suivant une délétion des domaines AD et bZIP de HBZ qui dans ce cas est localisée strictement au nucléole. De plus, bien que APH-3 et APH-4 puissent se localiser aux nucléoles, HBZ est la seule protéine traduite à partir d’un transcrit antisens pouvant interagir avec B23. Finalement, ces travaux ont clairement mis en évidence que HTLV-3 et HTLV-4 permettent la production de transcrits antisens comme chez d’autres rétrovirus. Les protéines traduites à partir de ces transcrits antisens jouent d’importants rôles dans la réplication rétrovirale mais semblent avoir des fonctions différentes de celles de HBZ au niveau de la régulation de la transcription de la voie Jun. HBZ semble aussi jouer un rôle unique dans le nucléole en ciblant les protéines nucléolaires de la cellule. Ces études démontrent que les protéines produites à partir de transcrits antisens chez les rétrovirus HTLV partagent plusieurs ressemblances, mais démontrent aussi des différences. Ainsi, les APH pourraient, en tant qu’outil comparatif, aider à mieux cibler les mécanismes moléculaires importants utilisés par HBZ pour induire la pathogénèse associée à une infection par HTLV. / The first human T-cell lymphotropic virus (HTLV) family member was discovered in 1980 and it is estimated that approximately 10 million people are infected with HTLV-1 worldwide. After about 40 years, 5% of infected individuals will develop an adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) while another 4% will develop HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). It is believed that two viral proteins, Tax and HBZ, together orchestrate the oncogenic process. The viral proteins are expressed from an alternatively spliced sense transcript except for the HBZ gene. HBZ is translated from an antisense transcript initiated in the long terminal repeat (LTR)’3. This viral protein is capable of inhibiting Tax transactivation of the LTR5’ by dimerizing with cellular transcription factors such as CREB-2 and c-Jun. HBZ also has proliferating capacities and while the molecular mechanisms leading to the disease still need to be elucidated, it is well known that HBZ can modulate a multitude of signal transduction pathways like AP-1. We have recently discovered an antisense transcript termed Antisense Protein of HTLV-2 (APH-2) produced in HTLV-2. HTLV-2 is only associated to myelopathies resembling HAM/TSP. HTLV-3 and HTLV-4 were discovered in 2005 and have not been associated with any type of disease thus far. The first goal of this PhD project was hence to detect and characterize the antisense transcripts produced in HTLV-3 and HTLV-4, to study the functions of these translated proteins and to evaluate their similarities and/or differences shared with HBZ and APH-2. Our localization studies using confocal microscopy demonstrated that APH-3 and APH-4 are found in the nucleus as speckles, and for APH-3, also partially cytoplasmic. These two proteins can also partially colocalize with HBZ. Using a luciferase reporter plasmid bearing the HTLV-1 LTR5’, we demonstrated that APH-3 and APH-4 could inhibit Tax transactivation of the LTR5’. We also used a luciferase reporter plasmid bearing the collagenase promoter, which bears an AP-1 site, and demonstrated that both viral proteins could activate transcription in the presence of any of the Jun family of transcription factors. We generated several mutants and the atypical leucine zipper (LZ) found in APH-3 and APH-4 is crucial for this regulation. In fact, APH-3 and APH-4 using their atypical LZ dimerize with Jun family members and activate this pathway using a mechanism other than an autonomous activation domain. Our next goal was to investigate the significance of the HBZ nucleolar localization. During this project, we identified two new interacting partners, B23 and nucleolin, which seem to be associated with its nucleolar localization. In fact, these interactions are stronger when HBZ is deleted of its AD and bZIP domains and hence when HBZ demonstrates a stronger nucleolar distribution. Moreover, while APH-3 and APH-4 are also found in the nucleolus, HBZ is the only antisense protein able to interact with B23. Finally, this work clearly demonstrates that HTLV-3 and HTLV-4 can produce an antisense transcript alike other retroviruses. The encoded proteins play an important role in retroviral replication and seem to regulate Jun-dependant transcription differently than HBZ. HBZ also seems to have a unique role in the nucleoli by targeting specific cellular nucleolar proteins. Similarities but also differences are shared between the antisense proteins. Thus, the APH proteins represent a good comparative tool in order to better understand the molecular mechanisms involved in HTLV induced diseases.

Aquesta tesi demostra que el peroxinitrit produït com a conseqüència del pèptid beta-amiloide (A) contribueix l'augment de la relació A42/A40 que ocorre a la malaltia d'Alzheimer. L'A42 contribueix a l'aparició de la malaltia degut a la seva major toxicitat (quan es compara amb l'A40) que resulta d'una gran estabilitat i capacitat agregativa. A més el peroxinitrit incrementa la toxicitat d'aquest degut a què potencia la seva agregació en forma d'oligomers altament tòxics. De fet els oligomers formats de nitro-A42 presenten una major toxicitat que aquells formats de A42 . En conjunt aquest resultats senyalen l'important paper que l'A42 té en la malaltia d'Alzheimer. Per altra banda, des de la identificació dels agregats d'A i la subseqüent formació dels cabdells neurofibrilars (NFT) com a els dos trets distintius de la malaltia, un gran esforç s'ha dedicat a establir els mecanismes moleculars que uneixen ambdós processos. Aquesta tesi demostra que el peroxinitrit format a partir de l'agregació de d'Ai la conseqüent nitrotirosinació de proteïnes, potencia l'agregació de la proteïna tau en forma de fibres. D'aquesta forma, la nitrotirosinació de la proteïna triosafosfat isomerasa (TPI) podria ser el vincle entre la toxicitat derivada del agregats d'Ai la patologia derivada de la proteïna tau. Per tant, la nitrotirosinació de la TPI podria explicar la progressió temporal que ocorre als cervells de pacients amb la malaltia d'Alzheimer des de la toxicitat induïda per l'Ai l'aparició dels NFT. Els resultats presentats en aquesta tesi podrien obrir nous aspectes en la recerca de la malaltia d'Alzheimer així com en altres malalties que cursin amb estrès oxidatiu i plegament erroni de proteïnes. / This thesis demonstrates that amyloid ß-peptide (Aß)-induced peroxynitrite contributes to the switch of the Aβ42/Aβ40 ratio that occurs in Alzheimer's disease (AD). Since Aβ42 is more toxic due to its higher aggregation and stability, it contributes to the trigger of the disease. In addition the aggregation of Aβ42 in form of the highly toxic oligomers is incremented by the presence of peroxynitrite. Moreover, these nitro-Aß42 oligomers are more toxic than those non-nitrated. All these results support the important role of peroxynitrite in AD etiology. Furthermore, since the identification of Aß accumulation and the subsequent formation of neurofibrillary tangles (NFT) as the two defining pathological hallmarks of AD, a fair amount of research on AD has been driven by the need to find the molecular mechanism linking Aß and NFT. This thesis shows the Aß-induced peroxynitrite, and the consequent nitrotyrosination of proteins, promotes tau fibrillization. Thus triosephosphate isomerase (TPI) nitrotyrosination could be the link between Aß-induced toxicity and tau pathology. Therefore, TPI nitrotyrosination may explain the temporal progression from Aß toxicity to NFT formation in AD brain. The work presented in this thesis could open a novel angle in the research of the pathophysiology of AD and could also have an impact to the research in other neurodegenerative diseases involving oxidative stress and protein misfolding.