Les travaux de recherche qui sont présentés dans cette thèse touchent tous des aspects de l'étude de la régulation de l'expression des gènes, un des principaux axes de recherche de notre laboratoire. Ceux-ci sont aisément séparables en quatre chapitres, décrits ci-dessous. Le deuxième et le quatrième ont fait l'objet d'une publication, alors que le troisième se veut une description d'une méthodologie expérimentale et d'analyse que nous avons mise au point. Dans le premier chapitre, une introduction générale est donnée sur des notions préalables à la compréhension de cette thèse. Cette section se veut une synthèse de la littérature pertinente. Dans le deuxième chapitre, en utilisant des données d'immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage à haut débit, nous avons identifié des facteurs génétiques et épigénétiques pouvant distinguer les régions génomiques où se trouve le variant d'histone H2A.Z de celles où il ne se trouve pas. Essentiellement, parmi les 37 modifications post-traductionnelles des histones étudiées, l'acétylation de la lysine 18 de l'histone canonique H3 (H3K18ac) est celle qui permet de mieux discriminer ces régions. Une recherche traditionnelle de motifs effectuée sur les séquences les plus associées avec H2A.Z dans le génome humain a identifié plusieurs motifs candidats, mais aucun n'a pu expliquer le positionnement de H2A.Z observé à l'échelle génomique. Cependant, une analyse basée sur un modèle de flexibilité des séquences d'ADN a permis de classifier correctement une majorité de séquences où se trouvent des nucléosomes possédant le variant d'histone H2A.Z, et a pu récapituler le positionnement des nucléosomes H2A.Z observé aux promoteurs in vivo. En bref, nous avons montré que des critères à la fois épigénétiques et génétiques permettent de prédire si une région génomique est plus à même de posséder des nucléosomes avec ou sans le variant d'histone H2A.Z. Dans le troisième chapitre, je décris des techniques de biologie moléculaire et de bioinformatique que nous avons mises au point pour l'analyse de la structure de la chromatine au promoteur du gène 11 p... WAFI/C1P1 La procédure expérimentale, les détails de la construction de la librairie de reséquençage sélectif, la méthodologie d'analyse des résultats ainsi qu'une validation de la méthodologie sur des données simulées sont décrits. Dans le quatrième chapitre, je décris un outil bioinformatique que nous avons publié, nommé PCRTiler, qui nous a été utile dans le laboratoire pour la conception automatisée et à grande échelle d'amorces PCR spécifiques et ayant des conditions d'utilisation similaires. Essentiellement, nous avons automatisé la tâche que les biologistes faisaient à la main pour concevoir des amorces PCR. En premier lieu, PCRTiler utilise l'application Primer3 pour identifier une multitude de paires d'amorces candidates qui possèdent les caractéristiques physiques spécifiées par l'utilisateur. Par la suite, le programme BLASTN est utilisé pour identifier tous les sites d'hybridation potentiels dans le génome d'intérêt. Finalement, on s'assure qu'une paire d'amorces n'entraînera pas l'amplification de plus d'un fragment d'ADN étant donné la liste des sites d'hybridation potentiels. Cet outil a été mis à la disposition du public sur un serveur web. L'outil a été validé expérimentalement par la conception et la validation expérimentale de 123 paires d'amorces dans la région intergénique des gènes CYP1A 1 et CYP1A2 . Parmi celles-ci, 96 (78%) ont fonctionné dès les premiers essais, et 105 (85%) ont fonctionné après une légère optimisation des conditions expérimentales. Une tentative initiale de concevoir manuellement des paires d'amorces dans les régions qui n'ont pas fonctionné n'a pas mené à une amplification satisfaisante et spécifique, indiquant que les régions pour lesquelles PCRTiler n'a pas pu concevoir d'amorces sont intrinsèquement plus problématiques.

L'organisation des génomes eucaryotes sous forme de chromatine constitue un élément de régulation essentiel de tous les processus cellulaires dépendants de l'ADN. Les facteurs intervenant sur cette organisation jouent donc un rôle crucial dans le bon fonctionnement et le maintien de l'identité des cellules et l'intégrité du matériel génomique. Le complexe NuA4/TIP60 est capable d'agir sur l'organisation de la chromatine de deux façons distinctes : premièrement en acétylant les histones H2A et H4 via sa sous-unité KAT5/Tip60, conduisant à une structure chromatinienne plus relâchée et accessible; deuxièmement en incorporant le variant d'histone H2A.Z dans la chromatine, conférant des propriétés particulières aux régions du génome concernées. NuA4/TIP60 joue ainsi un rôle central dans la régulation de nombreux processus cellulaires, en particulier l'expression des gènes et la réparation des dommages à l'ADN. Le complexe est composé d'au moins 17 sous-unités chez l'humain; les propriétés et fonctions de certaines de ces sous-unités restent à préciser dans le but de mieux comprendre comment NuA4/TIP60 régule l'organisation de la chromatine. Dans la première partie de mes travaux de doctorat présentés ici, nous avons cherché à clarifier la fonction du chromodomaine de KAT5/Tip60, la sous-unité catalytique du complexe. En effet des observations contradictoires avaient été rapportées dans la littérature, en particulier en ce qui concerne la capacité du chromodomaine à reconnaître des marques d'histones spécifiques. Nos résultats suggèrent que ce domaine régule plutôt l'activité acétyltransférase du complexe indépendamment des marques d'histones. Nous avons également caractérisé des mutations de KAT5/Tip60, dont l'une dans le chromodomaine, liées à un syndrome neurodéveloppemental chez plusieurs patients. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à l'incorporation du variant d'histone H2A.Z au sein de la chromatine par NuA4/TIP60 et par un autre complexe, SRCAP. Nos résultats suggèrent que NuA4/TIP60 favorise l'un des paralogues de H2A.Z, H2A.Z.2, par rapport à H2A.Z.1, contrairement à SRCAP. Nous avons également identifié des partenaires spécifiques pour chaque paralogue de H2A.Z qui permettent d'expliquer une partie des rôles différents joués par ces paralogues dans la régulation de la transcription. Dans leur ensemble ces travaux contribuent à améliorer notre compréhension de la façon dont le complexe NuA4/TIP60 affecte l'organisation chromatinienne, et comment des perturbations de cette fonction peuvent entraîner des conséquences pathologiques sérieuses. / Eucaryotic genomes take the shape of chromatin, the organization of which affects all DNA-based cellular processes. Hence, factors involved in this organization are critical for maintaining proper cell function, identity, and genome integrity. The NuA4/TIP60 complex affects chromatin organization through two different mechanisms: first by acetylating histones H2A and H4 in chromatin, increasing its relaxation and accessibility; second by incorporating the histone variant H2A.Z into chromatin, assigning distinct properties to given genomic regions. NuA4/TIP60 therefore acts as a central regulator of many cellular processes, in particular gene expression and DNA damage repair. NuA4/TIP60 comprises at least 17 subunits, the functions and properties of many of which still need elucidating in order to better understand how the complex regulates chromatin structure. In the first part of my PhD project presented hereby, we aimed to clarify the function of KAT5/Tip60, the catalytical subunit of NuA4/Tip60. Contradictory results had been previously reported regarding the chromodomain ability to bind specific histone marks. Our results suggest that this domain instead regulates the acetyltransferase activity of NuA4/Tip60 independently of histone marks. We have also characterized mutations in KAT5/Tip60, one of them inside the chromodomain, linked to a rare neurodevelopmental syndrome. In the second part, we were interested in the incorporation of the histone variant H2A.Z in chromatin by NuA4/TIP60 as well as another complex, SRCAP. Our results suggest that NuA4/TIP60 favors one of the two H2A.Z paralogs, H2A.Z.2, over H2A.Z.1, as opposed to SRCAP which binds both equally. We also identified specific interactors for each paralog, which could explain in part how H2A.Z.1 and H2A.Z.2 regulate gene expression differently. Overall this work contributes to a better understanding of how NuA4/TIP60 regulates chromatin organization, and how disruption of these functions can lead to serious pathological outcomes.

Lorsqu'une cellule se divise, elle donne une copie de son génome à chacune de ses cellules filles. Cependant, quand un problème de ségrégation survient, les cellules filles peuvent recevoir un nombre anormal de chromatides sœurs, résultant en une aneuploïdie. Plusieurs pathologies sont liées à l'aneuploïdie, notamment la trisomie 21 et des formes de cancer. Une des kinases recrutées pour corriger la ségrégation des chromatides sœurs est Haspin. Son activité est nécessaire pour l'enrichissement du « Chromosomal Passenger Complex » (CPC) aux centromères. Selon le modèle actuel, Haspin phosphoryle l'histone H3 sur la thréonine 3 (H3 T3) pour recruter le CPC. Or, une comparaison des séquences des acides aminés des histones H2B et H3 montre une forte similarité entre H3 T3 et les sites T19 et T119 de H2B. Nous avons émis l'hypothèse selon laquelle Haspin phosphorylerait les sites T19 et T119 de H2B. Mon projet a pour but d'utiliser des approches in vitro utilisant des histones et des nucléosomes recombinants pour découvrir de nouveaux substrats de Haspin. Afin de déceler et de quantifier la phosphorylation de H2B par Haspin, nous avons réalisé des essais kinases avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation de H2B sur ces deux sites. De plus, nous avons utilisé des approches in cellulo afin de déterminer si H2B est phosphorylé par Haspin au niveau cellulaire. Nos résultats démontrent que Haspin phosphoryle l'histone H2B sur T19 et T119 in vitro. Haspin phosphoryle l'histone libre ainsi que sa forme repliée en nucléosome. D'autre part, les analyses d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique à H2BpT119 ont démontré que H2B est phosphorylée par Haspin dans la cellule. En conclusion, nous avons montré que H2B est phosphorylé par Haspin autant in vitro que in cellulo. La caractérisation de ce nouveau substrat pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de division cellulaire. / During cell division, the cell gives a copy of its genome to each of its daughter cells. However, when a segregation problem arises, daughter cells can receive an abnormal number of sister chromatids, resulting in aneuploidy. Several pathologies are linked to aneuploidy, including Down Syndrome and forms of cancer. One of the first kinases recruited to correct sister chromatid missegregation is the Haspin kinase. Its activity is necessary for the enrichment of the Chromosomal Passenger Complex (CPC) at the centromeres. According to the current model, Haspin phosphorylates histone H3 on threonine 3 (H3 T3) to recruit the CPC. However, a comparison of the amino acid sequences of histones H2B and H3 shows a strong similarity between H3 T3 and the T 9 and T119 sites of histone H2B. We hypothesised that Haspin is able to phosphorylate the sites T19 and T119 of H2B. My project aims to use in vitro approaches using recombinant histones and nucleosomes to discover new substrates of Haspin. In order to detect and quantify Haspin phosphorylation of the histones, we performed kinase assays that we analysed using an antibody specific to H2B phosphorylation of its two sites. In addition, we performed in cellulo analyses to determine if H2B is phosphorylated by Haspin at the cellular level. Our results demonstrate that Haspin phosphorylates histone H2B on T19 and T119 in vitro. Haspin phosphorylates the free histone and its folded form in nucleosomes. Additionally, immunofluorescence analyzes with an antibody specific to H2BpT119 showed that H2B is phosphorylated by Haspin in the cell. In conclusion, we have shown that H2B is phosphorylated by Haspin both in vitro and in cellulo. The characterization of this new substrate could allow a better understanding of the mechanisms supporting cell division.

Lorsqu'une cellule se divise, elle donne une copie de son génome à chacune de ses cellules filles. Cependant, quand un problème de ségrégation survient, les cellules filles peuvent recevoir un nombre anormal de chromatides sœurs, résultant en une aneuploïdie. Plusieurs pathologies sont liées à l'aneuploïdie, notamment la trisomie 21 et des formes de cancer. Une des kinases recrutées pour corriger la ségrégation des chromatides sœurs est Haspin. Son activité est nécessaire pour l'enrichissement du « Chromosomal Passenger Complex » (CPC) aux centromères. Selon le modèle actuel, Haspin phosphoryle l'histone H3 sur la thréonine 3 (H3 T3) pour recruter le CPC. Or, une comparaison des séquences des acides aminés des histones H2B et H3 montre une forte similarité entre H3 T3 et les sites T19 et T119 de H2B. Nous avons émis l'hypothèse selon laquelle Haspin phosphorylerait les sites T19 et T119 de H2B. Mon projet a pour but d'utiliser des approches in vitro utilisant des histones et des nucléosomes recombinants pour découvrir de nouveaux substrats de Haspin. Afin de déceler et de quantifier la phosphorylation de H2B par Haspin, nous avons réalisé des essais kinases avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation de H2B sur ces deux sites. De plus, nous avons utilisé des approches in cellulo afin de déterminer si H2B est phosphorylé par Haspin au niveau cellulaire. Nos résultats démontrent que Haspin phosphoryle l'histone H2B sur T19 et T119 in vitro. Haspin phosphoryle l'histone libre ainsi que sa forme repliée en nucléosome. D'autre part, les analyses d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique à H2BpT119 ont démontré que H2B est phosphorylée par Haspin dans la cellule. En conclusion, nous avons montré que H2B est phosphorylé par Haspin autant in vitro que in cellulo. La caractérisation de ce nouveau substrat pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de division cellulaire. / During cell division, the cell gives a copy of its genome to each of its daughter cells. However, when a segregation problem arises, daughter cells can receive an abnormal number of sister chromatids, resulting in aneuploidy. Several pathologies are linked to aneuploidy, including Down Syndrome and forms of cancer. One of the first kinases recruited to correct sister chromatid missegregation is the Haspin kinase. Its activity is necessary for the enrichment of the Chromosomal Passenger Complex (CPC) at the centromeres. According to the current model, Haspin phosphorylates histone H3 on threonine 3 (H3 T3) to recruit the CPC. However, a comparison of the amino acid sequences of histones H2B and H3 shows a strong similarity between H3 T3 and the T 9 and T119 sites of histone H2B. We hypothesised that Haspin is able to phosphorylate the sites T19 and T119 of H2B. My project aims to use in vitro approaches using recombinant histones and nucleosomes to discover new substrates of Haspin. In order to detect and quantify Haspin phosphorylation of the histones, we performed kinase assays that we analysed using an antibody specific to H2B phosphorylation of its two sites. In addition, we performed in cellulo analyses to determine if H2B is phosphorylated by Haspin at the cellular level. Our results demonstrate that Haspin phosphorylates histone H2B on T19 and T119 in vitro. Haspin phosphorylates the free histone and its folded form in nucleosomes. Additionally, immunofluorescence analyzes with an antibody specific to H2BpT119 showed that H2B is phosphorylated by Haspin in the cell. In conclusion, we have shown that H2B is phosphorylated by Haspin both in vitro and in cellulo. The characterization of this new substrate could allow a better understanding of the mechanisms supporting cell division.

Les nucléosomes, composés d’histones et d’ADN, constituent l’unité de base de la chromatine. Toutes les actions portant sur l’ADN ou nécessitant cette molécule doivent d’abord éliminer la répression physique réalisée par la structure du nucléosome. Il existe pour cela trois mécanismes principaux permettant de rendre plus fluide et plus dynamique cette structure. Les différents éléments mis en jeu dans ces mécanismes sont les chaperons d’histones, les facteurs de remodelage de la chromatine et enfin les facteurs modifiant les extrémités des histones. NuA4, un complexe de 12 sous-unités de la levure Saccharomyces cerevisiae faisant partie de la dernière famille de facteurs pouvant influencer la structure de la chromatine, est capable d’acétyler les histones H4 et H2A sur leur extrémité N-terminale. Sa sous-unité catalytique, Esa1, est la seule histone acétyltransférase essentielle pour la levure. Plusieurs sous-unités du complexe possèdent des domaines particuliers présents dans des protéines ayant un rôle dans la structure de la chromatine. C’est le cas notamment de Esa1 et de Eaf3 qui possèdent un chromodomaine, domaine selon la protéine a été caractérisé comme un module de reconnaissance soit d’ARN soit de lysine méthylées des histones. Le but de mon projet doctoral était de caractériser la régulation de NuA4 et plus particulièrement de comprendre le rôle de ses deux protéines à chromodomaine Esa1 et Eaf3. Dans un premier temps, nous avons cherché à identifier certaines modifications sur les histones capables de moduler l’activité de NuA4. Ce travail nous a permis d’identifier et de caractériser deux nouvelles enzymes, Rmt1 et Dot1, responsables respectivement de la méthylation de l’arginine 3 de H4 et de la lysine 79 sur l’histone H3. Seule la première de ces deux modifications s’est révélée avoir une influence sur l’activité de NuA4 et ce en combinaison avec la phosphorylation de la sérine 1 de l’histone H4. Dans un deuxième temps nous avons essayé de comprendre la fonction de Eaf3, en particulier son rôle potentiel dans la reconnaissance des lysines méthylées. Grâce à des études génétiques et biochimiques nous avons pu établir un lien entre Eaf3 et la lysine 36 méthylée de H3. / Nucleosomes, composed of DNA and histones, are the basal unit of chromatin. All cellular mechanisms involving DNA have to deal with the repressive structure formed by nucleosomes. Histone chaperons, chromatin remodelling enzymes and complexes able to modify the N terminus of histones are major molecular compounds able to affect chromatin structure. NuA4 is a 12-subunit-histone-acetyltransferase-complex from Saccharomyces cerevisiae able to influence chromatin by acetylating N terminus of H4 and H2A. Esa1, its catalytic subunit, is the only essential histone acetyltransferase in yeast. Other subunits of the complex possess domains find in proteins playing a role in chromatin dynamic structure. This is the case for Esa1 and Eaf3, each one has a chromodomaine which is found to be, depending on the protein, a non-coding RNA binding module or a histone methyl lysine binding module. The main aim of this project was to find how NuA4 was regulated and more precisely to understand functions of its 2 chromodomain-containing proteins, Esa1 and Eaf3. First, we looked for histone modifications able to influence NuA4 activity which leads us to characterize two new enzymes, Rmt1 and Dot1, responsible respectively for the methylation of H4 arginine 3 and H3 lysine 79. Of these 2 modifications only the first one was able to influence NuA4 activity in combination with H4 serine 1 phosphorylation. Second, we tried to understand Eaf3’s function and particularly its potential role in histone methyl lysine binding. With genetic and biochemical studies we demonstrated a link between Eaf3 and méthylation of lysine 36 on histone H3.

Dans ce manuscrit nous abordons les propriétés mécaniques de fibres de chromatine à l'échelle de la molécule unique. La chromatine est la structure nucléoprotéique qui contient le génome des cellules eucaryotes. À ce titre, cette fibre est soumise à de nombreuses contraintes mécaniques, telle la torsion, lors des processus de transcription, de réplication ou bien encore de réparation. Une revue des connaissances concernant la chromatine est présentée dans un premier chapitre. En particulier, nous introduisons l'influence d'une histone, appelée histone de liaison. Cette protéine permet à la fibre d'accéder à un niveau de compaction supérieur. Ensuite nous donnons les outils théoriques et expérimentaux d'étude du substrat chromatinien. Nous détaillons les propriétés topologiques de la chromatine. Le dispositif d'étude que nous avons utilisé, les pinces magnétiques, est décrit. Il permet d'exercer sur une fibre unique des contraintes mécaniques de tension et de torsion controlées. Enfin nous présentons les résultats obtenus sur des fibres de chromatine reconstituées en présence ou non de l'histone de liaison. À l'aide des pinces magnétiques, nous avons pu mettre en évidence le fait que l'histone de liaison ne modifie pas l'élasticité torsionnelle remarquable de la chromatine, même si la fibre est dans un état plus condensé. Sous forte déformation torsionnelle positive, le nucléosome subit une transition chirale qui permet de relâcher la contrainte topologique appliquée à la fibre. Nous avons pu montrer que ce changement conformationnel peut tout à fait se dérouler au sein des fibres contenant l'histone de liaison. Les implications biologiques de ces phénomènes sont examinées. La capacité propre à la chromatine à supporter la contrainte de torsion pourrait avoir un rôle dans le maintien de l'organisation chromatinienne lors du cycle cellulaire.

Le positionnement des nucléosomes le long des génomes eucaryotes est crucial étant donné qu’il affecte l’accessibilité de l’ADN à des protéines impliquées dans la transcription, la réplication, ou encore la réparation de l’ADN. Si il est aujourd’hui admis que les remodeleurs de chromatine ainsi que les préférences des nucléosomes pour certains motifs d’ADN constituent les deux principaux déterminants du positionnement des nucléosomes in vivo, leur importance relative fait encore l’objet de controverses. Dans le cadre de cette problématique nous avons développé une stratégie d’assemblage de répétitions de la séquence 601 positionnante de nucléosome directement dans le génome de Saccharomyces cerevisiae. Cette technique assistée par la technologie CRISPR/Cas9 et des oligonucléotides chevauchants s’est révélée très efficace et a permis d’assembler des répétitions sur une étendue d’environ 15 kilobases. Nous avons ainsi pu isoler trois souches se caractérisant par trois longueurs d’ADN de liaison de respectivement 20, 50 et 90 paires de bases séparant deux 601 consécutifs tout le long des répétitions. Ces longueurs d’ADN de liaison ont été choisies du fait de leur compatibilité avec les modèles de la fibre de 30 nm étudiés in vitro et parce qu’elles sont fréquemment observées chez les eucaryotes. Nous avons ensuite regardé si ces répétitions de la séquence 601 suffisent à dicter la succession des nucléosomes de S. cerevisiae selon le pas de chromatine attendu. Pour cela, nous avons eu recours à une approche de MNase-seq afin d’analyser les positions des dyades des nucléosomes dans les répétitions. Les résultats de ces analyses révèlent de façon intéressante l’incapacité de la séquence 601 à positionner le nucléosome dans ce contexte cellulaire et cela malgré l’étendue de la région de 601 répétés constituée. Nous avons également analysé le positionnement des nucléosomes chez ces trois mêmes souches suite à l’inactivation de Chd1, l’un des deux principaux architectes du paysage nucléosomal chez la levure, afin de s’affranchir de son potentiel effet sur le positionnement des nucléosomes dans la région 601. Nos résultats montrent que l’absence de Chd1 ne permet pas de rétablir un positionnement des nucléosomes sur les monomères de 601, suggérant que le 601 n’est pas positionnant in vivo ou que la région répétée est sous l’influence d’autres facteurs de remodelage. D’un point de vue méthodologique, notre technique de construction de répétitions in vivo permet d’envisager des approches simplifiées de biologie synthétique pour la construction de librairies de répétitions dans le génome de S. cerevisiae. / Nucleosome positioning along eukaryotic genomes is crucial as it influences DNA accessibility for DNA binding proteins involved in DNA replication, transcription and repair. It is now accepted that both nucleosome preferences for some DNA sequences and remodeling factors play an important role in nucleosome positioning in vivo. However their relative importance remains a matter of debate. To investigate the role played by DNA sequence in nucleosome positioning in a cellular context we developped a strategy to assemble tandem DNA repeats of a nucleosome positioning sequence directly into Saccharomyces cerevisiae’s genome. This method is assisted by CRISPR/Cas9 and overlapping oligonucleotides and it turned out to be very efficient as it allowed to synthetize about 15 kilobases of tandem DNA repeats inside a yeast chromosome. Using this apporoach we obtained three yeast strains differing by the DNA linker length separating two consecutive monomeres of the 601 nucleosome positioning sequence. We chose three lengths of linker (20, 50 and 90 pb) for two reasons. First, they are compatible with the formation of a 30 nm chromatin fiber in vitro, and second, nucleosome repeat length of 167, 197 and 237 pb are found in eukaryotic genomes. We then verified if nucleosomes are effectively positioned according to the theoretic DNA linker lengths we designed in the “601” repeated region. To that goal we performed MNase-seq analysis to deduce nucleosomes dyads positions in the repeats. Interestingly our results show that the 601 sequence is not able to dictate strong nucleosomes positioning differing from the natural nucleosome repeat length of about 165 pb along the repeats in an in vivo context. We further investigated positions of dyads in the same three strains after inactivating the gene coding for the chromatin remodeler Chd1, which could potentially be responsible of the nucleosomes organization in the repeated area. Our results show no effect of Chd1, indicating that the “601” sequence has no positionning effect in vivo or that other trans-acting factors are implicated in nucleosome positioning in the engineered repeats. Finally, this work provides a new fast and simple approach for synthetic DNA repeats construction inside the yeast genome and could easily be applied for other synthetic chromatin engineering approaches.

Le monde biologique est rempli de mystères. La compréhension de nombreux processus biologiques extrêmement complexes est grandement améliorée par la combinaison d’approches empruntées à différentes disciplines telles que la chimie et plus récemment la physique. La physique utilise des outils expérimentaux tels que les pinces optiques et les microscopies optique et électronique pour explorer les mécanismes à l’échelle microscopique se déroulant dans la cellule. La connaissance de la nature des interactions entre biomolécules et la possibilité de traduire ces interactions en équations ont permis à la physique de construire des modèles simples mais contenant les ingrédients suffisants à la description d’un mécanisme spécifique. La simulation numérique de tels modèles permet d’améliorer notre compréhension de la relation entre les mécanismes pertinents à l’échelle moléculaire et les observations expérimentales de phénomènes biologiques. / The biological world is full of mysteries. The understanding of many extremely complex biological processes is greatly improved by the combination of approaches borrowed from different disciplines such as chemistry and more recently physics. Physics uses experimental tools such as optical tweezers and optical and electron microscopes to explore the microscopic mechanisms taking place in the cell. Knowledge of the nature of the interactions between biomolecules and the possibility of translating these interactions into equations allowed physics to construct models that are simple, but contain the ingredients sufficient to describe a specific mechanism. The numerical simulation of such models improves our understanding of the relationship between relevant molecular-scale mechanisms and experimental observations of biological phenomena. The structural organization of biomolecular complexes is a process that involves various scales of length and time.

Il est connu que les lymphocytes B (LB) ont un rôle pathogène dans de nombreuses maladies auto-immunes. Afin de comprendre comment la perte de tolérance B survient dans le lupus érythémateux systémique, maladie auto-immune prototypique, nous avons tout d’abord développé, dans un modèle murin, une méthode de marquage des LB pathogènes en cytométrie en flux. D’autre part, nous avons trouvé qu’un défaut de réponse au TLR9 est une caractéristique unique des LB de patients lupiques et est associée à une diminution d’expression du complexe CD19/CD21 à la surface des LB. Ces anomalies pourraient favoriser la survie des LB autoréactifs, et permettre la survenue de troubles auto-immuns. Dans un second temps nous avons exploré les fonctions d’une population lymphocytaire B méconnue: les LB thymiques humains. Nos résultats appuient le rôle tolérogène de ces LB, avec notamment l’expression, par 5% d’entre eux, de la protéine AIRE (AutoImmune REgulator), qui joue un rôle majeur dans la sélection négative des lymphocytes T. L’ensemble de ces données montrent la dichotomie fonctionnelle des LB et nous rappelle la complexité des processus régissant la tolérance et son maintien. / It is well known that B cells play pathogenic roles in a variety of autoimmune diseases. In order to understand how B tolerance breakdown occurs during systemic lupus erythematosus (SLE), a prototypical autoimmune disease, we first developed a method to identify autoreactive B cells by flow cytometry in a mouse model. In addition we found that a defective in vitro response to TLR9 agonists is a specific feature of SLE B cells and is associated with a CD19/CD21 complex downregulation. These abnormal functions in SLE B cells may contribute to B cell tolerance breakdown in these patients. But B-cell involvement in autoimmune diseases should not lead us to forget the functional diversity of B cells. This prompted us, in a second project, to analyze the tolerogenic role of a B cell population considered as simple bystanders of thymopoiesis: the human thymic B cells. Our results support the tolerogenic role of thymic B cells, as 5% of them express AIRE (AutoImmune REgulator), which plays a major role in cells in T cells negative selection. All these data underline the functional dichotomy of B cells and remind us the complexity of the processes governing tolerance and its maintenance.

L’état local de la chromatine joue un rôle crucial dans tous les processus génétiques comme le contrôle de la transcription, de la réplication et de la réparation de l’ADN, de la signalisation, etc... La structure précise de l’organisation 3D du deuxième ordre de compaction de la chromatine, aussi appelé fibre de 30 nm, a été le sujet d’intenses débats durant les 40 dernières années. En se basant sur les données in vitro, deux modèles concurrents se distinguent: le solénoïde et le zigzag. Dans le modèle solénoïde, des nucléosomes consécutifs interagissent pour former une trajectoire hélicoïdale avec courbure de l’ADN de liaison. Dans le modèle zigzag, deux hélices d’empilement de nucléosomes se forment, reliées par l’ADN de liaison qui peut être droit ou tordu. Durant ma thèse, j’ai développé une nouvelle approche expérimentale biochimique, appelée ICNN (Identification of the Closest Neighbor Nucleosome), permettant de déchiffrer les interactions entre nucléosomes voisins au sein de la fibre et ainsi de définir sous quelle forme la chromatine se compacte. Nous avons démontré que dans une fibre compactée H1-dépendante, les nucléosomes N+2 sont les plus proches voisins d’un nucléosome N arbitrairement choisit. Ces résultats montrent, sans ambiguïté, l’organisation zigzag de la fibre de 30 nm. De plus, cette organisation reste indépendante de la longueur de l’ADN de liaison, démontrant ainsi que la longueur des nucléosomes (177-227 bp) n’affecte pas la structure de la chromatine et ne peut donc pas être responsable de l’hétérogénéité structurale décrite dans la littérature. La dynamique et la structure de la chromatine peuvent être affectées par l’incorporation de variants d’histones. Nos expériences utilisant des assemblages H2A.Z ne montrent aucune différence de repliement entre les fibres contenant H2A.Z et H2A. Ces données suggèrent que le mécanisme de régulation de la transcription spécifique de H2A.Z est indépendant du repliement de la chromatine. CENP-A est un élément de la chromatine centromérique indispensable à la division cellulaire. Les images cristallographiques montrent que les nucléosomes contenant CENP-A sont plus ouverts que le nucléosomes conventionnels à cause d’une hélice α-NCENP-A plus courte. Parallèlement, des résultats récents de notre laboratoire ont montré que H1 ne se lie pas d’une façon stable aux nucléosomes contenant CENP-A, ne conduisant à aucune organisation de l’ADN de liaison (données non publiées). Notre étude au niveau de la chromatine a confirmé l'absence de repliement de la fibre contenant CENP-A en présence de H1. De manière intéressante, le remplacement de CENP-A par un mutant α-NH3-CENP-A restaure la bonne liaison de H1 et le repliement de la fibre avec une conformation habituelle en zigzag comme dans une fibre contenant H3. / The local chromatin state plays a crucial role in all fundamental DNA-templated processes, such as transcription control, DNA replication or repair, signaling, etc. The precise 3D organization of the second level folding, the so-called 30 nm fiber, has been a matter of intense speculations and debates over the past 40 years. Two competing models have been proposed on the basis of in vitro data, the solenoid and zigzag arrangements. In the solenoid model, consecutive nucleosomes interact with each other and follow a helical trajectory with bent DNA linker. In the zigzag model, alternate nucleosomes interact with each other with straight, twisted or coiled linker DNA. During my thesis, I developed a new biochemical approach, called ICNN (Identification of the Closest Neighbor Nucleosomes), allowing a direct “visualization” of the neighboring nucleosomes within H1-dependent compacted chromatin. We showed that within H1-compacted regular nucleosomal array, N±2 nucleosomes are the nearest neighboring interaction partners of any arbitrary nucleosome N. This finding provides an unambiguous evidence for the zigzag two-start helix conformation of the 30 nm fiber. Furthermore, this organization remains independent on the DNA linker length, demonstrating that the nucleosome repeat length (177-227 bp) does not affect the chromatin structure and therefore cannot be a reason for chromatin structural heterogeneity as suggested in the literature. Chromatin structure and dynamics might be affected by the incorporation of histone variants. Our ICNN experiments with H2A.Z arrays showed no difference of folding between H2A.Z- and H2A-containing fibers. This finding suggests that the H2A.Z-specific transcriptional regulation involves mechanisms other than chromatin folding. CENP-A is a hallmark for centromeric chromatin that is indispensable for cell division. X-ray scattering in crystals showed that CENP-A-containing nucleosomes are more “open” than conventional ones due to the shorter α-NCENP-A helix. Besides, recent results in our lab showed that H1 does not stably bind to the CENP-A nucleosomes and that no stem organization of the linker is formed (not published). Our ICNN study at the chromatin level confirmed the absence of H1-induced folding of a regular CENP-A array. Interestingly, replacement of CENP-A with the α-NH3-CENP-A mutant restored proper H1 binding and folding of the fiber into the usual zigzag conformation, as does the conventional H3-containing fiber.