Uma das maiores dificuldades das terapias de reprodução assistida é a seleção de células germinativas de boa qualidade para posterior fertilização e implantação. Atualmente, a seleção de oócitos se dá basicamente por avaliação morfológica, que não reflete satisfatoriamente a competência oocitária. Assim, a busca por bioindicadores da qualidade oocitária é necessária. O cumulus oophorus forma um conjunto de células somáticas que circundam o oócito no folículo antral,mantendo uma relação íntima com a célula germinativa, com comunicação direta via junções tipo GAP. As células do cumulus oophorus são descartadas após técnicas de fertilização in vitro, o que as torna um material de fácil acesso, livre de conflitos éticos. Uma série de metodologias de análise das células do cumulus foram propostas para identificação de anormalidades no oócito. Porém, nenhuma delas é rotineiramente utilizada na clínica. Os processos celulares das células do cumulus refletem as condições do microambiente folicular, e podem, assim, trazer evidências das condições oocitárias. Nosso grupo analisou as células do cumulus primeiramente por meio de abordagens de bioinformática, que revelaram processos celulares relacionados ao desenvolvimento de embriões até o estágio de blastocisto. Com base nestes resultados, análises de parâmetros bioquímicos e expressão gênica das células do cumulus foram realizadas e permitiram a identificação de possíveis biomarcadores da qualidade do oócito que levam em consideração as características clínicas das pacientes. Estas análises indicaram que expressão do gene PTGS2 e a atividade da enzima Glutationa-S-Transferase como indicadores da formação de blastocistos em pacientes com diferentes variáveis clínicas (backgrounds) analisados. Se confirmados, estes parâmetros poderão ser utilizados como biomarcadores no ambiente clínico, elevando as taxas de sucesso em técnicas de reprodução assistida. / One of the great challenges in assisted reproduction techniques is the selection of appropriate germ cells for fertilization and implantation. Nowadays, oocyte selection occurs basically through morphological evaluation, which does not reflect satisfactorily the oocyte competence. Therefore, the search for bioindicators of oocyte quality is necessary. The cumulus oophorus forms a set of somatic cells that surround the oocyte in the antral follicle, participating in the processes of oocyte maturation and folliculogenesis. These cells maintain an intimate relationship with the germ cell, with direct communication via GAP junctions. Cumulus oophorus cells are discarded in in vitro fertilization techniques, which makes them an easy-access material that can be collected in a free-of-ethicalissues way. A series of cumulus cell analysis methodologies were proposed to identify abnormalities in the oocyte. However, none of them is routinely used in clinical environment. The cellular processes of cumulus cells reflect the conditions of the follicular microenvironment, and may thus bring evidences of oocyte conditions. Our group analyzed cumulus cells in search of predictors of oocyte quality primarily through bioinformatics approaches, which revealed cellular processes related to the development of embryos up to the blastocyst stage. Based on these results, analyzes of biochemical parameters and gene expression of cumulus cells were performed and allowed the identification of possible biomarkers of oocyte quality that takes into consideration patients clinical variables. These analysis indicated PTGS2 expression and Glutathione-S-Transferase activity as indicators of blastocyst formation in all patient profiles (backgrounds) analyzed. If confirmed, these parameters may be used as biomarkers in clinical environment, improving assisted reproduction success rates.

Resumo:O processo de desenvolvimento embrionário e placentário está sob controle epigenético intenso, com os diversos processos epigenéticos regulando a diferenciação de células pluripotentes em células especializadas. Um desenvolvimento placentário anormal é observado com frequência em gestações de clones, e está associado a uma alteração na reprogramação epigenética da célula doadora e do embrião formado. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão dos genes "imprinted" TSSC4 e PHLDA2 em tecido cotiledonário e intercotiledonário, aos 60 dias de gestação, de placentas produzidas por Transferência Embrionária (TE), Fecundação In Vitro (FIV) e Transferência Nuclear (TN) em bovinos, e também investigar o controle epigenético desses genes na placenta bovina, avaliando o perfil epigenético dos mesmos em tecidos cotiledonários dos grupos experimentais (TE, FIV e TN). A expressão do gene TSSC4 foi reduzida em 30% na região cotiledonária do grupo produzido por TN, no entanto a expressão do gene PHLDA2 aumentou em aproximadamente onze vezes nos grupos TN e FIV, quando comparados ao grupo TE. Análises de ChIP para a histona H3 na região promotora proximal dos genes TSSC4 e PHLDA2 mostraram um aumento para a marcação permissiva H3K4me2 e uma redução para a inibitória H3K9me2 em cotilédones de placentas clonadas em relação às placentas produzidas por TE. Interessantemente, ambas as marcações de histonas para o gene TSSC4 também estavam significativamente alteradas também em placentas produzidas por FIV, quando comparadas ao grupo TE. Esses resultados mostram que a expressão dos genes "imprinted" TSSC4 e PHLDA2 está alterada em placentas de gestações produzidas por transferência nuclear. Ainda, alterações na expressão do gene PHLDA2 e das modificações de histona no gene TSSC4, nos cotilédones produzidos por FIV, indicam que o cultivoo...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:The process of embryonic and placental development is under high epigenetic control, with different epigenetic processes regulating the differentiation of pluripotent cells into specialized cells. An abnormal placental development is observed frequently in pregnancies produced by nuclear transfer, and is associated with incomplete epigenetic reprogramming of the donor cell and formed embryo. The objective of this study was to evaluate the expression of the imprinted genes TSSC4 e PHLDA2 in cotiledonary and intercotiledonary tissues, after 60 days of pregnancy, in placentas produced by Embryo Transfer (ET) In Vitro Fertilization (IVF) and Nuclear Transfer (NT) in cattle, and also to investigate the epigenetic control of this gene in the bovine placenta evaluating the epigenetic profile of cotiledonary tissues of the experimental groups (ET, IVF and NT). The TSSC4 gene expression was reduced by 30% in the cotyledons in the NT group, however PHLDA2 expression of the gene was elevated by 11-fold in NT compared to ET. ChIP analysis for histone H3 at the proximal promoter region of TSSC4 and PHLDA2 genes showed an increase to the permissive mark H3K4me2 and a reduction for the inhibitory mark H3K9me2 in the cotyledons of cloned placentae, in relation to placentae produced by ET, for both genes. Interestingly, the inhibitory mark H3K9me2 for TSSC4 gene was also significantly reduced in placentae produced by IVF, compared to ET control group. These results show that expression of the "imprinted" genes TSSC4 and PHLDA2 is affected in placenta of pregnancies produced by nuclear transfer. Further, changes in expression of gene PHLDA2 and histone modifications in TSSC4 gene cotyledons produced by IVF indicate that the in vitro culture can contribute to the observed changes in NT group. / Orientador:Flavia Lombardi Lopes / Banca:Calie Castilho / Banca:Gisele Zoccal Mingoti / Mestre

Orientador: Flávia Lombardi Lopes / Coorientadora: Claudia Maria Bertran Membrive / Banca:Calie Castilho Silvestre / Banca:Guilherme de Paula Nogueira / Resumo: A suplementação com compostos ricos em ácido linoleico, dentre os quais inclui-se a semente de girassol, promove aumento na taxa de concepção em fêmeas bovinas. Hipotetizou-se que a suplementação com semente de girassol em doadoras de oócitos aumenta o número e a qualidade de oócitos, incrementa as taxas de clivagem e determina um aumento no número e qualidade dos blastocistos produzidos in vitro. Assim, objetivou-se investigar o efeito de tal suplementação, no número e qualidade de oócitos cultivados in vitro, na taxa de clivagem e no número e qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Para tanto, cinco vacas e vinte e cinco novilhas (n=30) Nelore foram divididas em dois grupos para receberem um dos seguintes tratamentos: 1,7 kg/dia de suplemento contendo 53% de farelo de soja com 44% de PB e 47% de milho (Grupo Controle - Grupo C; n= 15) ou 1,7 kg/dia de suplemento contendo 40% de farelo de soja com 44% de proteína bruta (PB) e 60% de semente de girassol (Grupo Girassol - Grupo G; n= 15), durante 57 dias. As fêmeas foram submetidas à aspiração folicular nos dias D0, D13, D29, D43, D56 e D77 (D0= início da suplementação; D56= término da suplementação). Os oócitos foram submetidos ao processo de produção de embriões in vitro. Os dados foram analisados pelo programa Mixed procedure (SAS) versão 9.2, pelo teste ANOVA modelo misto. Não se observou diferença entre os Grupos C e G no número de folículos visualizados (16,85 ± 1,32 vs. 16,12 ± 1,48); número... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Supplementation with compounds rich in linoleic acid, among which is included sunflower seed, promotes increase in conception rates in cows. It was hypothesized that sunflower seed supplementation in oocyte donors increases the number and quality of oocytes, increases the cleavage rates and determines an increase in the number and quality of blastocysts produced in vitro. Therefore the objective was to investigate the effect of such supplementation, in the number and quality of oocytes cultured in vitro on cleavage rate and in the number and quality of in vitro produced blastocysts. Therefore, cows five and twenty-five heifers (n = 30) Nellore were divided into two groups to receive one of the following treatments: 1.7 kg / day supplement containing 53% soybean meal 44% and 47% PB corn (Control Group - Group C, n = 15) or 1.7 kg / containing 40% add-on of soybean meal with 44% crude protein (CP) and 60% sunflower seed (Sunflower group - Group C; n = 15) for 57 days. Females underwent follicular aspiration on days D0, D13, D29, D43, D56 and D77 (D0 = start of supplementation; D56 = end of supplementation). The oocytes were subjected to in vitro embryo production process. Data were analyzed by the Mixed procedure (SAS) version 9.2, by ANOVA mixed model. There was no difference between Groups C and G on the number of displayed follicles (16.85 ± 1.32 vs. 16.12 ± 1.48); number of aspired oocytes (13.80 ± 1.27 vs. 13.05 ± 1.25); recovery rate (82 ± 1% vs. 80 ±... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O objetivo deste estudo foi infectar experimentalmente cães com oocistos esporulados de N. caninum, via oral e avaliar a ocorrência ou não da infecção. Os oocistos utilizados como inóculo foram obtidos através de bioensaio em cães, usando cérebro de búfalos soropositivos para anticorpos anti-N. caninum. Os oocistos obtidos foram confirmados ser de N. caninum por métodos moleculares e por bioensaio em gerbilos. Oocistos esporulados, com no máximo 90 dias, foram utilizados na infecção de quatro cães, com oito semanas de vida e negativos para anticorpos anti-N. caninum e Toxoplasma gondii. Os cães 1 e 4 receberam um inóculo com 10.000 oocistos esporulados cada um; o cão 2 um inóculo com 5.000 oocistos esporulados e o cão 3 recebeu 1.000 oocistos esporulados de N. caninum. O total de fezes foi coletado e examinado diariamente durante um período de 30 dias. Nenhum oocisto foi encontrado nas fezes desses animais. Durante seis meses os cães foram acompanhados para observar uma possível soroconversão e quando esta ocorria os animais eram eliminados do experimento. / The objective of this study was to evaluate the acquisition of infection in dogs experimentally infected with sporulated oocysts. The oocysts used as inoculum were obtained by bioassay in dogs using brain of buffaloes positive for anti-N. caninum antibodies. The oocysts were confirmed to be N. caninum by molecular methods and by bioassay in gerbils. Sporulated oocysts with a maximum of 90 days were used in the infection of four dogs. The dogs were eight weeks old and were negative for anti-N. caninum and Toxoplasma gondii antibodies. Dogs 1 and 4 received an inoculum of 10,000 sporulated oocysts each, dog 2 an inoculum with 5,000 sporulated oocysts and dog 3 received 1,000 sporulated oocysts of N. caninum. The total feces eliminated by the dogs were collected and examined daily for a period of 30 days. No oocysts were found in the feces of these animals. For six months the dogs were monitored to observe a possible seroconversion and when this occurred the animals were eliminated from the experiment.

Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Eunice Oba / Resumo: O presente estudo visou avaliar a resposta ovariana a superestimulação utilizando 80UI de FSH e 300UI de eCG após ablação por laparoscopic ovum pic-up (LOPU1) de todos os folículos visíveis presentes em ambos os ovários. Determinar o melhor momento para realização de uma nova LOPU (LOPU2), mediante a avaliação ultrassonográfica dos ovários a cada 12 horas após LOPU1. E comparar a respostas ovariana do tratamento Duplo LOPU (DLOPU) com o tratamento One Shot adaptado de Baldassarre (1996), quanto a quantidades dos Complexos Cumulos-Oócito (COCs), e qualidade das estruturas obtidas e após processo de maturação in vitro (MIV) por 24 horas. Foi determinado o momento para realização da LOPU2 em 36 horas após a superestimulação. A média de folículos presentes na avaliação ultrassonográfica imediatamente antes a LOPU em ambos os tratamentos foi cerca de 9 estruturas, não diferindo da media de folículos aspirados, a taxa de recuperação comum aos dois tratamentos foi de 62,5%. A avaliação imediata das estruturas obtidas bem como a após 24 de MIV demonstrou que não houve diferença qualitativa COCs entre os tratamentos / Abstract: The present study aimed to evaluate the ovarian response to superstimulation using 80UI FSH and eCG 300UI after ablation LOPU (LOPU1) of all follicles present in both ovaries. Determine mlehor time to make a new LOPU (LOPU2) by ultrasound evaluation of the ovaries every 12 hours LOPU1. And comparing the responses ovarian DLOPU treatment with the treatment Ono Shot adapted Baldassarre (1996) with the DLOPU described here, the amounts of COC and quality of the structures obtained after process and IVM for 24 hours. It was determined the time for completion of LOPU2 in 36 hours after the overstimulation. The mean number of follicles present in the ultrasonographic evaluation immediately before the LOPU in both treatments was about 9 structures did not differ from follicles aspirated media, the recovery rate common to the two treatments was 62.5%. Immediate assessment of the structures obtained as well as after 24 IVM demonstrated that COCs do not hear qualitative difference between treatments / Mestre

Este estudo foi realizado com o objetivo de: 1) determinar a influência da tensão de oxigênio na viabilidade das células do cumulus oriundas de oócitos caninos maturados em meio com alta concentração de glicose (11,0 mM); 2) determinar a taxa de maturação in vitro de oócitos caninos mantidos em meio contendo altas concentrações de glicose (11,0 mM), bem como avaliar o efeito da tensão de oxigênio sobre a taxa de maturação in vitro de oócitos caninos; 3) determinar a influência da adição de água de coco em pó (ACP-318®) ao meio de maturação com alta concentração de glicose (11,0 mM) na taxa de maturação in vitro de oócitos caninos. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM 199 suplementado com 26,19 mM de bicarbonato de sódio, 50 μg/ml de gentamicina, 0,20 mM de ácido pirúvico, 20 μg/ml de estradiol, 0,5 μg/ml de FSH e 0,03 UI/ml hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento mostraram diferença estatística nas taxas de apoptose nas células do cumulus entre os três grupos avaliados. Foi concluído que células do cumulus oriundas de COCs caninos cultivados em meio contendo altas concentrações de glicose apresentaram significativamente menos apoptose do que as cultivadas em meio com soro fetal bovino, e que a baixa tensão de oxigênio foi eficiente em reduzir a ocorrência de apoptose nas células do cumulus. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,001) de oócitos degenerados foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 10 % de FCS. Uma influência positiva sobre a retomada de meiose e aquisição de metáfase I (MI) foi observada quando os oócitos caninos foram maturados em meio livre de soro e com altas concentrações de glicose. Foi concluído que a adição de FCS ao meio de maturação de oócitos caninos resulta em altas taxas de degeneração dos oócitos e que a redução da tensão de oxigênio não resultou em melhora da taxa de maturação nuclear dos oócitos caninos. Os resultados obtidos no terceiro experimento mostraram que nos grupos experimentais cujo meio foi suplementado com ACP-318®, houve melhora significativa (p < 0,05) na taxa de maturação nuclear dos oócitos caninos. Oócitos maturados em meio suplementado com 5% de ACP-318® mostraram-se menos susceptíveis a alterações na configuração típica da cromatina que os maturados com 10% de ACP-318® no meio de maturação. Os resultados sugerem que tanto a integridade da morfologia nuclear, como a progressão da meiose dos oócitos caninos são positivamente influenciadas quando estes são expostos ao TCM 199 com alta concentração de glicose e suplementado com 5% de ACP-318®. / This study was designed: 1) determine the influence of oxygen tension on cumulus cell (CC) viability from canine oocytes in vitro matured in high glucose medium (11.0 mM); 2) determine the influence of two oxygen tensions on the nuclear maturation of canine oocytes in vitro matured in high glucose medium (11.0 mM); 3) determine the influence of powdered coconut water (ACP-318®) diluted in high glucose (11.0 mM) TCM199 in the achievement of nuclear in vitro maturation (IVM) of canine oocytes. Basic medium used in the experiments was TCM 199 suplemented with 26.19 mM sodium bicarbonate, 50 μg/ml gentamicin, 0.20 mM piruvic acid, 20 μg/ml oestradiol, 0.5 μg/ml FSH and 0.03 IU/ml hCG. Maturation medium was modified following the beyond described experimental proposals. The results of the first experiment showed that there was statistical difference in the rate of CCs apoptosis among the three groups. It was concluded that CCs of canine COCs cultured in high-glucose medium showed significantly less apoptosis than those cultured in medium with FCS. Low O2 tension was efficient in reducing apoptosis in canine CCs. In the second experiment of this study, the highest rates (p < 0.001) of degenerated oocytes were achieved when TCM 199 was added with 10% FCS. A positive influence on the meiosis resumption and on the MI acquisition rate was observed when canine oocytes were matured in defined high-glucose medium. It was concluded that the addition of FCS in the maturation medium of canine oocytes result in a high level of degenerated oocytes, and that the low level of oxygen tension did not improve the nuclear maturation of canine oocytes. The results achieved on the third experiment showed that in the experimental groups with the medium supplemented with ACP-318® (groups 2 and 3) enhanced the rates of oocytes’ nuclear maturation (p < 0.05). Ooocytes matured in medium added with 5% powdered coconut water (ACP-318®) were less prone to deviation of typical chromatin configuration than those matured in medium added with 10% ACP-318®. The results suggest that oocytes’ nuclear morphology integrity and meiosis achievement were positively influenced when exposed to high glucose TCM199 supplemented with 5% powdered coconut water.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of the present study was to examine the role of oxytocin (OT) on the control of oocyte meiotic resumption in the events that involves progesterone (P4) and prostaglandins (PGs). Oocytes were co-cultured with follicular hemisections for 15 h to determine the effect of different doses of OT or atosiban (ATO; oxytocin receptor antagonist) on the oocyte meiotic resumption. In another experiment, we examine the effect of P4, OT and PGs interaction on the regulatory cascade of the induction of oocyte meiotic resumption. Oxytocin in the concentration of 1 μM was effective in inducing the resumption of meiosis of oocytes co-cultured with follicular cells (84.0%), not differing statistically from the positive control group (74.4%). Similarly, atosiban inhibited the positive effect of OT on meiotic resumption in a dose-dependent manner, in which the metaphase I (MI) rate was only 27.6% in the presence of 10 μM ATO, not differing from the negative control group (25.5%). The possible toxic effect of ATO was tested in a 15 or 24 h-cumulus-oocyte complex culture system. In the third experiment, we demonstrated that P4 was able to induce the oocyte meiotic resumption, which was inhibited by ATO. However, the positive effect of OT was not blocked by mifepristone (P4 antagonist) but was inhibited by indometacine (a non-selective PTGS2 inhibitor). Collectively, these results evidenced that P4 is upstream to OT and PGs are required for the positive effect of OT to induce oocyte meiotic resumption. In conclusion, our results evince that together with Ang II, already proved by our group as involved in oocyte meiotic resumption, P4, OT and PGs are sequential steps in the hormonal cascade that culminates with resumption of meiosis in cattle. / O objetivo do presente estudo foi examinar o papel da ocitocina (OT) no controle da retomada meiótica de oócitos bovinos, além da interação desse peptídeo com a progesterona (P4) e prostaglandinas (PGs) neste evento fisiológico. Nesse estudo, verificamos a interação da P4, OT e PGs na cascata de indução de retomada meiótica do oócito. Oócitos foram co-cultivados com metades foliculares por 15 h para determinar o efeito de diferentes doses de OT ou atosiban (ATO; antagonista do receptor de ocitocina) no reinício da maturação meiótica A OT na concentração de 1 μM foi eficaz em induzir a retomada da meiose de oócitos co-cultivados com células foliculares (84,0%), não diferindo estatisticamente do grupo controle positivo (74,4%). O ATO inibiu o efeito positivo da OT sobre o reinício da meiose de uma forma dose-dependente onde a porcentagem de oócitos que atingiu o estádio de metáfase I (MI), foi apenas 27,6% na presença de 10 μM de ATO, não diferindo do grupo controle negativo (25,5%). Para confirmar que este efeito não era resultante de toxicidade ocasionada pelo ATO, foi realizado um experimento onde o efeito tóxico do ATO foi testado em um cultivo durante 15 e 24 horas, e foi possível observar que ele não apresenta efeitos tóxicos aos oócitos em cultivo, permitindo a retomada da meiose. Foi demonstrado também que a P4 foi capaz de induzir a retomada da meiose do oócito bovino ao qual foi inibida pelo ATO. No entanto, o efeito positivo da OT não foi bloqueado pela mifepristona (antagonista P4), mas foi inibida por indometacina (inibidor não-seletivo de PTGS2). Coletivamente, estes resultados evidenciam que P4 requer OT e esta requer PGs para que oócitos bovinos reiniciem a meiose. Em conclusão, nossos resultados demonstram que, P4, OT e PGs são passos seqüenciais da cascata hormonal que culmina com a retomada da meiose em bovinos.

Este estudo foi realizado com o objetivo de: 1) determinar a influência da tensão de oxigênio na viabilidade das células do cumulus oriundas de oócitos caninos maturados em meio com alta concentração de glicose (11,0 mM); 2) determinar a taxa de maturação in vitro de oócitos caninos mantidos em meio contendo altas concentrações de glicose (11,0 mM), bem como avaliar o efeito da tensão de oxigênio sobre a taxa de maturação in vitro de oócitos caninos; 3) determinar a influência da adição de água de coco em pó (ACP-318®) ao meio de maturação com alta concentração de glicose (11,0 mM) na taxa de maturação in vitro de oócitos caninos. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM 199 suplementado com 26,19 mM de bicarbonato de sódio, 50 μg/ml de gentamicina, 0,20 mM de ácido pirúvico, 20 μg/ml de estradiol, 0,5 μg/ml de FSH e 0,03 UI/ml hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento mostraram diferença estatística nas taxas de apoptose nas células do cumulus entre os três grupos avaliados. Foi concluído que células do cumulus oriundas de COCs caninos cultivados em meio contendo altas concentrações de glicose apresentaram significativamente menos apoptose do que as cultivadas em meio com soro fetal bovino, e que a baixa tensão de oxigênio foi eficiente em reduzir a ocorrência de apoptose nas células do cumulus. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,001) de oócitos degenerados foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 10 % de FCS. Uma influência positiva sobre a retomada de meiose e aquisição de metáfase I (MI) foi observada quando os oócitos caninos foram maturados em meio livre de soro e com altas concentrações de glicose. Foi concluído que a adição de FCS ao meio de maturação de oócitos caninos resulta em altas taxas de degeneração dos oócitos e que a redução da tensão de oxigênio não resultou em melhora da taxa de maturação nuclear dos oócitos caninos. Os resultados obtidos no terceiro experimento mostraram que nos grupos experimentais cujo meio foi suplementado com ACP-318®, houve melhora significativa (p < 0,05) na taxa de maturação nuclear dos oócitos caninos. Oócitos maturados em meio suplementado com 5% de ACP-318® mostraram-se menos susceptíveis a alterações na configuração típica da cromatina que os maturados com 10% de ACP-318® no meio de maturação. Os resultados sugerem que tanto a integridade da morfologia nuclear, como a progressão da meiose dos oócitos caninos são positivamente influenciadas quando estes são expostos ao TCM 199 com alta concentração de glicose e suplementado com 5% de ACP-318®. / This study was designed: 1) determine the influence of oxygen tension on cumulus cell (CC) viability from canine oocytes in vitro matured in high glucose medium (11.0 mM); 2) determine the influence of two oxygen tensions on the nuclear maturation of canine oocytes in vitro matured in high glucose medium (11.0 mM); 3) determine the influence of powdered coconut water (ACP-318®) diluted in high glucose (11.0 mM) TCM199 in the achievement of nuclear in vitro maturation (IVM) of canine oocytes. Basic medium used in the experiments was TCM 199 suplemented with 26.19 mM sodium bicarbonate, 50 μg/ml gentamicin, 0.20 mM piruvic acid, 20 μg/ml oestradiol, 0.5 μg/ml FSH and 0.03 IU/ml hCG. Maturation medium was modified following the beyond described experimental proposals. The results of the first experiment showed that there was statistical difference in the rate of CCs apoptosis among the three groups. It was concluded that CCs of canine COCs cultured in high-glucose medium showed significantly less apoptosis than those cultured in medium with FCS. Low O2 tension was efficient in reducing apoptosis in canine CCs. In the second experiment of this study, the highest rates (p < 0.001) of degenerated oocytes were achieved when TCM 199 was added with 10% FCS. A positive influence on the meiosis resumption and on the MI acquisition rate was observed when canine oocytes were matured in defined high-glucose medium. It was concluded that the addition of FCS in the maturation medium of canine oocytes result in a high level of degenerated oocytes, and that the low level of oxygen tension did not improve the nuclear maturation of canine oocytes. The results achieved on the third experiment showed that in the experimental groups with the medium supplemented with ACP-318® (groups 2 and 3) enhanced the rates of oocytes’ nuclear maturation (p < 0.05). Ooocytes matured in medium added with 5% powdered coconut water (ACP-318®) were less prone to deviation of typical chromatin configuration than those matured in medium added with 10% ACP-318®. The results suggest that oocytes’ nuclear morphology integrity and meiosis achievement were positively influenced when exposed to high glucose TCM199 supplemented with 5% powdered coconut water.

O desenvolvimento de meios de cultivo eficazes para a maturação in vitro de oócitos caninos tem sido um desafio para os pesquisadores em reprodução animal. O estresse oxidativo desempenha papel fundamental na maturação oocitária, uma vez que altas concentrações de espécies reativas ao oxigênio levam ao dano celular e apoptose. O objetivo desta pesquisa foi determinar as taxas de maturação nuclear de oócitos caninos na presença de cisteína e α-tocoferol, substâncias conhecidas por suas propriedades antioxidantes. No experimento 1, avaliou-se a taxa de maturação nuclear de oócitos caninos mantidos em meio TCM-199 modificado (A) (controle) ou acrescido de 0,57mM de cisteína (B). No experimento 2, determinou-se as taxas de maturação nuclear na presença de diferentes concentrações de α-tocoferol em duas etapas independentes: experimento 1 (0, 10, 50μM) e experimento 2 (0, 100 e 500μM). Os dados foram analisados pelo teste do Qui-quadrado (P < 0,05). No experimento 1, não foi observada diferença estatística entre as taxas de Metáfase I/Anáfase I (MI/AI) e Metáfase II (MII) entre os oócitos do grupo controle (A) (7,5%, 16/213; 1,9%, 4/213) e os oócitos do grupo acrescido de cisteína (B) (6,3%, 14/223; 0,9%, 2/223). No experimento 2, não houve diferença significativa nas taxas de MI e MII dos oócitos entre os tratamentos da primeira etapa: controle (26,8%, 29/108), 10μM (22,6%, 26/115) e 50μM (29,1%, 30/103). Na segunda parte do experimento, a percentagem de oócitos que retomaram a meiose (VGBD à MII) foi de 31,9% (31/97), 34,9% (39/112) e 51,5% (54/105) para os grupos controle,100 e 500μM de α-tocoferol respectivamente (P < 0,05). Entretanto, nenhum aumento nas taxas de MII foi observado quando foram utilizadas as concentrações de 100μM (0,9%, 1/112) ou 500μM (1,0%, 1/105) de α- tocoferol no meio. Concluiu-se que, o TCM-199 modificado suplementado com cisteína não foi eficaz em elevar os índices de maturação in vitro de oócitos caninos. Ainda, a suplementação de α-tocoferol não afetou as taxas de MII de oócitos caninos. / The development of effective culture media for in vitro maturation of canine oocytes has been a challenge for researchers in animal reproduction. Oxidative stress plays a critical role in oocyte maturation since high concentrations of reactive oxygen species lead to cell damage and apoptosis. This research aimed to determine the rates of nuclear maturation of canine oocytes in the presence of cysteine and α-tocopherol, substances known for its antioxidant properties. In experiment 1, the rates of oocytes nuclear maturation exposed to modified TCM-199 (A) (control) or added with 0.57mM cysteine (B) were evaluated. In experiment 2, the rates of oocytes nuclear maturation in the presence of different concentrations of α-tocopherol were determined in two independent essays: experiment 1 (0, 10 and 50μM) and experiment 2 (0, 100 and 500μM). Data were analyzed by the Chi-square test (P < 0.05). The data obtained in experiment 1 allowed no difference among the oocytes in Metaphase I/Anaphase (MI/AI) (7.5%, 16/213; 1.9%, 4/213) and Metaphase II (MII) (6.3%, 14/223; 0.9%, 2/223) rates observed in the medium without or supplemented with cysteine respectively. In experiment 2, there was no significant difference in the rates of MI and MII oocytes among treatments designed for the first essay: control (26.8%, 29/108), 10μM (22.6%, 26/115) and 50μM (29.1%, 30/103). In the second part of the experiment, the percentage of oocytes that resumed meiosis (GVBD to MII) was 31.9% (31/97), 34.9% (39/112) and 51.5% (54/105) for control, 100 and 500μM groups respectively (P < 0.05). However, no improvement on rates of MII was observed when either 100 or 500μM α-tocopherol was added in medium. It was concluded that, modified TCM-199 supplemented with cysteine, was not effective in raising the rates of in vitro maturation of bitch oocytes. Moreover, α-tocopherol supplement did not affect the rates of MII in canine oocytes.

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.