Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-04Bitstream added on 2015-05-14T16:58:53Z : No. of bitstreams: 1 000826973.pdf: 1421350 bytes, checksum: cb9046da915832bdb24f2e31bcc45a06 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi quantificar a abundância de genes associados com a competência de desenvolvimento em oócitos (GDF-9, BMP15 e OOSP1) e nas células do cumulus (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 e ADAM17), a partir de oócitos imaturos (VG), maturados in vivo (MIVO) e cultivados em meio de MIV com diferentes macromoléculas (SFB, BSA ou PVA), diferentes concentrações de EGF ou pré-cultivados com butirolactona I (BLI) antes da MIV. O delineamento experimental consistiu de três experimentos de MIV de oócitos bovinos, a saber: experimento 1, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo 10% de SFB ou 1 mg/mL de PVA ou 4 mg/mL de BSA; experimento 2, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo EGF (nas concentrações de 0, 10 e 100 ng/mL); e experimento 3, complexos cumulus-oócito maturados in vitro na ausência (BL0) ou presença de pré-maturação com 10 μM de BLI ( BL12, 12 horas de pré-maturação e 12 horas de MIV; BL24, 24 horas de prématuração e 24 horas de MIV). A quantidade relativa de transcritos para o gene GREM1, PTGS2, PFKP e AREG foi maior do que (P<0,05) nas células do cumulus de oócitos MIVO, nos experimentos 1 e 2 e para o gene GREM1 no experimento 3. No experimento 1, o grupo SFB exibiu maior (P<0,05) abundância de transcritos de GREM1 e AREG entre os grupos MIV. No experimento 2, a adição de 10 ng/mL ao meio de MIV propiciou uma regulação positiva de EREG. No experimento 3, BL12 apresentou maior (P<0,05) abundância de AREG e o BL24 de EREG e PTX3. Entre os grupos de MIV, o gene GREM1 foi expresso em maior quantidade (P<0,05) no BL12. Não houve diferença estatística nos experimentos 1, 2 e 3 entre os grupos de oócitos MIV, MIVO e VG para os genes GDF9, BMP15 e OOSP1. Conclui-se que, a utilização de diferentes macromoléculas, diferentes concentrações de EGF e a realização de précultivo com BLI altera a transcrição nas células ... / The aim of this study was to quantify the abundance of genes associated with the development of oocyte competence in oocytes (GDF-9, BMP15 and OOSP1) and in cumulus cells (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 and ADAM-17) of immature oocytes (GV), in vivo matured (IVMO) and cultured in IVM medium with different macromolecules (FCS, BSA or PVA), different EGF concentrations or pre-cultured with butyrolactone I (BLI) before IVM. The experimental design consisted of three IVM experiments of bovine oocytes, namely: experiment 1, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing 10% FCS or 1 mg/mL PVA or 4 mg/mL BSA; Experiment 2, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing EGF (at concentrations of 0, 10 and 100 ng/mL); and Experiment 3, cumulus-oocyte complex in vitro matured in the absence (BL0) or presence of pre-maturation with 10 μM de BLI (BL12, 12 hours of pre-maturation and 12 hours of IVM, BL24, 24 hours of pre-maturation and 24 hours of IVM). The relative amount of transcripts for GREM1, PTGS2, PFKP and AREG gene was larger than (P <0.05) in cumulus cells of IVMO oocytes in experiments 1 and 2 and for GREM1 gene in experiment 3. In experiment 1, the FCS group exhibited higher (P <0.05) abundance of transcripts of GREM1 and AREG among MIV groups. In experiment 2, the addition of 10 ng/ml to the IVM medium provided an upregulation of EREG. In experiment 3, BL12 showed higher (P <0.05) abundance of AREG and BL24 of EREG and PTX3. Among IVM groups, the GREM1 gene was expressed in larger quantities (P <0.05) in BL12. There was no statistical difference in experiments 1, 2 and 3 among groups of oocytes IVM, IVMO and GV for GDF9, BMP15 and OOSP1 genes. It was concluded that the use of different macromolecules, different EGF concentrations and the performance of pre-culture with BLI change the transcription in the cumulus cell of genes associated with oocyte competence / FAPESP: 2011/20514-3

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-03. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:43Z : No. of bitstreams: 1 000836722_20170301.pdf: 180132 bytes, checksum: 753f2fc6bf6704d0d437a28d4b51d4f2 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-03T11:01:29Z: 000836722_20170301.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-03T11:02:39Z : No. of bitstreams: 1 000836722.pdf: 980013 bytes, checksum: 2c92fb3c55ff70c48ea0cac62876c366 (MD5) / O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de... / The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspases activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8- 5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM ...

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Cláudia Lima Verde Leal / Resumo: O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de... / Abstract: The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspases activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8- 5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM ... / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Eduardo Paulino da Costa / Banca: Álan Maia Borges / Resumo: O objetivo deste estudo foi quantificar a abundância de genes associados com a competência de desenvolvimento em oócitos (GDF-9, BMP15 e OOSP1) e nas células do cumulus (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 e ADAM17), a partir de oócitos imaturos (VG), maturados in vivo (MIVO) e cultivados em meio de MIV com diferentes macromoléculas (SFB, BSA ou PVA), diferentes concentrações de EGF ou pré-cultivados com butirolactona I (BLI) antes da MIV. O delineamento experimental consistiu de três experimentos de MIV de oócitos bovinos, a saber: experimento 1, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo 10% de SFB ou 1 mg/mL de PVA ou 4 mg/mL de BSA; experimento 2, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo EGF (nas concentrações de 0, 10 e 100 ng/mL); e experimento 3, complexos cumulus-oócito maturados in vitro na ausência (BL0) ou presença de pré-maturação com 10 μM de BLI ( BL12, 12 horas de pré-maturação e 12 horas de MIV; BL24, 24 horas de prématuração e 24 horas de MIV). A quantidade relativa de transcritos para o gene GREM1, PTGS2, PFKP e AREG foi maior do que (P<0,05) nas células do cumulus de oócitos MIVO, nos experimentos 1 e 2 e para o gene GREM1 no experimento 3. No experimento 1, o grupo SFB exibiu maior (P<0,05) abundância de transcritos de GREM1 e AREG entre os grupos MIV. No experimento 2, a adição de 10 ng/mL ao meio de MIV propiciou uma regulação positiva de EREG. No experimento 3, BL12 apresentou maior (P<0,05) abundância de AREG e o BL24 de EREG e PTX3. Entre os grupos de MIV, o gene GREM1 foi expresso em maior quantidade (P<0,05) no BL12. Não houve diferença estatística nos experimentos 1, 2 e 3 entre os grupos de oócitos MIV, MIVO e VG para os genes GDF9, BMP15 e OOSP1. Conclui-se que, a utilização de diferentes macromoléculas, diferentes concentrações de EGF e a realização de précultivo com BLI altera a transcrição nas células ... / Abstract: The aim of this study was to quantify the abundance of genes associated with the development of oocyte competence in oocytes (GDF-9, BMP15 and OOSP1) and in cumulus cells (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 and ADAM-17) of immature oocytes (GV), in vivo matured (IVMO) and cultured in IVM medium with different macromolecules (FCS, BSA or PVA), different EGF concentrations or pre-cultured with butyrolactone I (BLI) before IVM. The experimental design consisted of three IVM experiments of bovine oocytes, namely: experiment 1, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing 10% FCS or 1 mg/mL PVA or 4 mg/mL BSA; Experiment 2, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing EGF (at concentrations of 0, 10 and 100 ng/mL); and Experiment 3, cumulus-oocyte complex in vitro matured in the absence (BL0) or presence of pre-maturation with 10 μM de BLI (BL12, 12 hours of pre-maturation and 12 hours of IVM, BL24, 24 hours of pre-maturation and 24 hours of IVM). The relative amount of transcripts for GREM1, PTGS2, PFKP and AREG gene was larger than (P <0.05) in cumulus cells of IVMO oocytes in experiments 1 and 2 and for GREM1 gene in experiment 3. In experiment 1, the FCS group exhibited higher (P <0.05) abundance of transcripts of GREM1 and AREG among MIV groups. In experiment 2, the addition of 10 ng/ml to the IVM medium provided an upregulation of EREG. In experiment 3, BL12 showed higher (P <0.05) abundance of AREG and BL24 of EREG and PTX3. Among IVM groups, the GREM1 gene was expressed in larger quantities (P <0.05) in BL12. There was no statistical difference in experiments 1, 2 and 3 among groups of oocytes IVM, IVMO and GV for GDF9, BMP15 and OOSP1 genes. It was concluded that the use of different macromolecules, different EGF concentrations and the performance of pre-culture with BLI change the transcription in the cumulus cell of genes associated with oocyte competence / Doutor

Orientador: José Buratini Junior / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Juliano da Silveira / Banca: Marcelo Marcondes Seneda / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: O oócito é responsável por regular os mecanismos da maturação do complexo cumulus oócito (COC) principalmente via secreção de fatores. parácrinos.Dentre os fatores secretados pelo oócito (OSF) desta-se o fator de crescimento dos fibroblastos 10 (FGF10), e dois fatores TGFβ mais estudados a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15) e fator de crescimento de diferenciação 9 (GDF9) e estão associados com o desenvolvimento da competência oocitária. O presente trabalho investigou a regulação do oócito sobre as células do cumulus em dois cenários atuais da maturação in vitro, na presença de hormônio folículo estimulante (FSH) ou ampirregulina (AREG). A ausência do oócito afeta a expansão das células do cumulus e também o consumo de glicose e a produção de lactato e a adição de oócitos desnudos reverte o efeito da oocectomia na expansão mas não no consumo de glicose nem na produção de lactato. A oocectomia afeta também a expressão gênica reduzindo a abundância de RNAm de hialurona sintetase 2 HAS2 e elevando a expressão de prostaglandina sintase 2 (PTGS2), pentraxina 3 (PTX3) e proteína indutora do fator de necrose tumoral 6 (TNFAIP6) na presença de FSH e AREG. A adição de oócitos desnudos reverte o efeito da oocectomia sobre a expressão de RNAm de AREG às 4 horas de cultivo, HAS2 e PTGS2 às 22 horas de cultivo apenas quando os complexos foram cultivados na presença de AREG. Adicionalmente foi investigado a ação isolada do FGF10 sobre a diferenciação das células do cumulus. O FGF10 re... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The oocyte is responsible for regulating mechanisms of cumulus oocyte complex (COC) maturation mainly through secretion of paracrine factors. Including oocyte secreted factors (OSF) are the fibroblast growth factor 10 (FGF10), and two TGF beta factors most studied, bone morphogenetic protein 15 (BMP15) differentiation and growth factor 9 (GDF9), and they are associated with the oocyte development of competence. This study investigated the regulation of oocyte cumulus cells on two current scenarios in vitro maturation in the presence of follicle stimulating hormone (FSH) or ampirregulina (AREG). The absence of oocyte affects the expansion of the cumulus cells and also the glucose consumption and lactate production and addition of denuded oocytes reverses the effect of the expansion oocectomia but not glucose consumption or lactate production. The oocectomia also affects gene expression by reducing the abundance of mRNA hialurona synthetase 2 HAS2 and raising synthase prostaglandin expression 2 (PTGS2), pentraxin 3 (PTX3) and inducing protein of the tumor necrosis factor 6 (TNFAIP6) in the presence of FSH and AREG. The addition of denuded oocytes reverses the effect of AREG on oocectomia mRNA expression at 4 hours of culture, HAS2 and PTGS2 to 22 hours of cultivation only when complexes were grown in the presence of AREG. Additionally it investigated the isolated FGF10 action on the differentiation of cumulus cells. FGF10 reverses the effect of on the expansion of the cells and the expression of HAS2 and GFPT1apenas to 22 hours in cumulus but not glucose consumption or lactate production, which shows a delayed effect of FGF10 necessitating the presence of other OSF to soon effect as seen previously in the literature. Complementary to the results, it appears that the cumulus cells have an intracumulus control Smad2-activation by the presence of GDF9 and BMP15 in cumulus cells. In summary the oocyte... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Banca: José Antônio Visintin / Banca: Marcelo Fábio Gouvia Nogueira / Resumo: As alterações no microambiente do trato reprodutivo comprometem a competência oocitária e o desenvolvimento embrionário pré-implantacional em bovinos. Vacas Bos indicus apresentam adaptações fenotípicas e genotípicas conferindo maior resistência e tolerância à temperatura elevada quando comparadas as vacas Bos taurus, que sofrem redução nos índices de prenhez durante os meses quentes do ano. Esta infertilidade causada pelo estresse térmico é um problema de ordem multifatorial, entretanto já foi demonstrado que o oócito e embrião são extremamente susceptíveis aos efeitos deletérios da temperatura elevada. Os danos celulares desencadeados pela temperatura elevada podem ser manipulados pelo fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I), que além de minimizar a morte celular espontânea, resgata células que já iniciaram apoptose induzida por diferentes agentes ou estresses. A primeira etapa deste projeto visou avaliar o efeito dose resposta do IGF-I durante a maturação in vitro (MIV) em meio quimicamente não definido (pré-experimento 1: meio MIV - 10% de soro fetal bovino) e semidefinido (pré-experimento 2: meio MIV - 6 mg/mL de albumina sérica bovina) na competência de desenvolvimento de oócitos bovinos. Para tanto, complexos cumulus-oócito (CCOs) de vacas (mestiças Bos indicus) oriundas de abatedouro foram maturados in vitro em meio MIV não definido ou semidefinido suplementado com 0 (controle veículo), 6,25; 12,5; 25; 50; 100 ou 200 ng/mL de IGF-I por 22-24 h. Em seguida os oócitos foram fecundados (FIV) e cultivados in vitro (CIV). A adição de 25 ng/mL de IGF-I no meio MIV semidefinido ou não definido aumentou a porcentagem de oócitos clivados no dia 3 e a taxa de blastocisto no dia 8 após a fecundação. Dessa forma, a dose de 25 ng/mL de IGF-I foi utilizada na segunda etapa deste projeto, cujo objetivo foi avaliar o papel do IGF-I na competência de desenvolvimento de ... / Abstract: Microenvironmental alterations on reproductive tract compromise oocyte competence and pre-implicational embryo development in bovine. This fact is well characterized in animals exposed to heat stress. Bos indicus have fenotypic and genotypic adaptations which confers a higher tolerance to high temperatures compared with Bos taurus, suffering a reduction in the pregnancy rates during the hot months. This infertility caused by heat stress is a multifactorial problem, however it has been shown that oocyte and embryo are very susceptible to deleterious effects of high temperature. The cellular damage induced by high temperature could be manipulated by insulin-like growth factor I (IGF-I), which besides minimizing the spontaneous cell death, IGF-I rescue cells which have already initiated the apoptosis induced by different agents or stresses. The first step of this project aimed to evaluate dose-response effect of IGF-I during the maturation in vitro (MIV) in a non-defined medium (pre-experiment 1: MIV - 10% of bovine fetal serum) and semi-defined (preexperiment 2: MIV - 6 mg/mL of bovine albumin serum) in competence of bovine oocytes. Therefore, cumulus-oocyte complexes (CCOs) obtained of cows (Bos indicus crossbreed) from a slaughterhouse were matured in vitro in non-defined and semidefined MIV medium supplemented with 0 (vehicle control), 6,25; 12,5; 25; 50; 100 or 200 ng/mL of IGF-I for 22-24 h. After, oocytes were fertilized (FIV) and cultured in vitro (CIV). The adition of 25 ng/ml of IGF-I on non-defined and semi-defined MIV medium increased porcentage of cleavage on day 3 and blastocysts rate in day 8 after fertilization. In this way, 25 ng/ml IGF-I was used on second step of this experiment, which objective was to evaluate the role of IGF-I on oocyte competence of oocytes collected from Bos indicus - Nelore (NEL; n= 6) and Bos taurus-Holstein (HPB; n= 6) exposed to heat stress. Therefore, cows adapted ... / Mestre

A maturação in vitro (MIV) de oócitos é uma técnica de Reprodução Assistida (RA) que apresenta inúmeras vantagens e aplicabilidades. No entanto, a qualidade dos gametas imaturos que são destinados a ela é bastante divergente, tornando-se necessário o desenvolvimento de técnicas que auxiliem na seleção dos gametas competentes, ou seja, aptos à MIV. A partir do conhecimento de que oócitos em fase de crescimento apresentam alta atividade específica da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), e que oócitos que finalizaram seu crescimento apresentam baixa atividade específica dessa enzima, foi proposta a coloração dos gametas com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB) como método de seleção dos oócitos competentes. Esse corante é capaz de ser metabolizado pela G6PDH, resultando na coloração dos gametas capacitados (classificados como BCB positivo), mas não dos gametas que ainda estão em fase de crescimento, que permanecem incolores e são classificados como BCB negativo. Em animais, foi demonstrado que essa técnica permite selecionar melhor os gametas e, consequentemente, aumentar não só as taxas de maturação oocitária nuclear e citoplasmática, como também as taxas de fertilização, de formação de blastocisto e de nascidos vivos. No entanto, apenas modelos animais foram utilizados até o presente momento. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência e a segurança da exposição de gametas humanos ao BCB como método de seleção de gametas competentes antes da MIV. Para isso, três diferentes perfis de pacientes tiveram seus oócitos imaturos incluídos no estudo: 6 pacientes cuja ovulação foi induzida e gametas imaturos foram captados (17 oócitos); 3 pacientes ooforectomizadas (20 oócitos recuperados); e 32 gestantes cujos oócitos foram captados durante a cesareana (92 oócitos recuperados). Os oócitos imaturos foram divididos em dois grupos: controle (colocado imediatamente para MIV) e tratado – exposto a 26 μM de BCB por 60 minutos. Após coloração, de acordo com a coloração do citoplasma, o grupo tratado foi classificado em BCB positivo ou negativo e destinado à MIV. Após 24 e 48 horas de MIV, foi avaliado o grau de maturação nuclear. A taxa de MIV dos oócitos recuperados de pacientes estimuladas e ooforectomizadas foi igual entre os grupos após 24 e 48 horas. No entanto, a taxa de MIV foi significativamente superior no grupo BCB positivo quando comparado com o grupo BCB negativo, tanto para os oócitos de todas as pacientes (P = 0,024 e P = 0,015) como quando os oócitos das gestantes (P = 0,004 e P = 0,032) foram avaliados separadamente, após 24 e 48 horas de MIV, respectivamente. O grupo controle foi similar ao grupo BCB positivo. A taxa de retomada de meiose (ausência de vesícula germinativa) após 24 horas foi igual entre os grupos, independente da fonte de recuperação dos gametas. Contudo, ao avaliar todos os gametas após 48 horas de MIV, a taxa de retomada de meiose foi superior no grupo BCB positivo, quando comparado com os demais grupos (P = 0,035). Quando os oócitos foram avaliados em conjunto, o grupo BCB positivo apresentou as menores taxas de degeneração (P = 0,002). Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o BCB pode ser um bom marcador na seleção de oócitos humanos competentes e não é tóxico para o gameta humano. / The in vitro maturation (IVM) is an Assisted Reproduction Technique (ART) that presents many advantages. However, the quality of immature oocytes destined to IVM is very divergent. That’s why pre-selection procedures of developmentally competent oocytes are important. Growing oocytes synthesize glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), but this enzyme is inactivated in oocytes that have completed their growth phase. Once Brilliant Cresyl Blue (BCB) can be reduced by G6PDH, it is suggested that BCB staining can select fully grown oocytes, when exposed to BCB – the cytoplasm of these eggs will appear blue, being classified as BCB positive, whereas oocytes still in growth phase will not be stained (cytoplasm will appear colourless, being classified as BCB negative). It has been already demonstrated that this selection can improve not only nuclear and cytoplasmic oocyte maturation, but also fertilization and blastocyst rates. However, only animal models were utilized until the present. Consequently, the aim of the experiment was to evaluate the efficiency and safety of BCB staining as a selection of developmentally competent immature human oocytes before IVM. Three kinds of patients were included in the study: 6 hormonal stimulated patients with immature oocytes at retrieval (17 oocytes); 3 ooforectomized patients (20 oocytes recovered); and 32 pregnant patients during cesarean section (92 oocytes recovered). Immature oocytes were divided into groups: control (disposed directly to IVM) and treated - exposed to BCB 26μM during 60 minutes. After staining, treated group was classified as cytoplasm coloration, BCB positive or negative, and then disposed to IVM. After 24 and 48 hours of IVM, nuclear status was checked. The IVM rate of immature oocytes recovered from stimulated and ooforectomized patients was equal among groups either after 24 or 48 hours of IVM. Nevertheless, IVM was higher in BCB positive compared to BCB negative after 24 and 48 hours of IVM analyzing oocytes recovered from all patients (P = 0.024 and P = 0.015), and from cesarean patients (P = 0.004 and P = 0.032). The control group was equal to BCB positive. The meiosis resumption rate (absence of germinal vesicle) after 24 hours of IVM was equal among groups, but higher in BCB positive compared to other groups after 48 hours when all gametes were analyzed jointly (P = 0.035). Degeneration rate was lower in BCB positive compared to their counterparts when oocytes were analyzed jointly (P = 0.002). In conclusion, BCB test can be a good marker in pre-selection procedures of developmentally competent human oocytes and, apparently, it is not toxic to the gamete.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-29Bitstream added on 2014-08-13T18:00:52Z : No. of bitstreams: 1 000753005.pdf: 2398846 bytes, checksum: 88a9bdc09aaab4eb0166b0e572c83bb7 (MD5) / As alterações no microambiente do trato reprodutivo comprometem a competência oocitária e o desenvolvimento embrionário pré-implantacional em bovinos. Vacas Bos indicus apresentam adaptações fenotípicas e genotípicas conferindo maior resistência e tolerância à temperatura elevada quando comparadas as vacas Bos taurus, que sofrem redução nos índices de prenhez durante os meses quentes do ano. Esta infertilidade causada pelo estresse térmico é um problema de ordem multifatorial, entretanto já foi demonstrado que o oócito e embrião são extremamente susceptíveis aos efeitos deletérios da temperatura elevada. Os danos celulares desencadeados pela temperatura elevada podem ser manipulados pelo fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I), que além de minimizar a morte celular espontânea, resgata células que já iniciaram apoptose induzida por diferentes agentes ou estresses. A primeira etapa deste projeto visou avaliar o efeito dose resposta do IGF-I durante a maturação in vitro (MIV) em meio quimicamente não definido (pré-experimento 1: meio MIV - 10% de soro fetal bovino) e semidefinido (pré-experimento 2: meio MIV - 6 mg/mL de albumina sérica bovina) na competência de desenvolvimento de oócitos bovinos. Para tanto, complexos cumulus-oócito (CCOs) de vacas (mestiças Bos indicus) oriundas de abatedouro foram maturados in vitro em meio MIV não definido ou semidefinido suplementado com 0 (controle veículo), 6,25; 12,5; 25; 50; 100 ou 200 ng/mL de IGF-I por 22-24 h. Em seguida os oócitos foram fecundados (FIV) e cultivados in vitro (CIV). A adição de 25 ng/mL de IGF-I no meio MIV semidefinido ou não definido aumentou a porcentagem de oócitos clivados no dia 3 e a taxa de blastocisto no dia 8 após a fecundação. Dessa forma, a dose de 25 ng/mL de IGF-I foi utilizada na segunda etapa deste projeto, cujo objetivo foi avaliar o papel do IGF-I na competência de desenvolvimento de ... / Microenvironmental alterations on reproductive tract compromise oocyte competence and pre-implicational embryo development in bovine. This fact is well characterized in animals exposed to heat stress. Bos indicus have fenotypic and genotypic adaptations which confers a higher tolerance to high temperatures compared with Bos taurus, suffering a reduction in the pregnancy rates during the hot months. This infertility caused by heat stress is a multifactorial problem, however it has been shown that oocyte and embryo are very susceptible to deleterious effects of high temperature. The cellular damage induced by high temperature could be manipulated by insulin-like growth factor I (IGF-I), which besides minimizing the spontaneous cell death, IGF-I rescue cells which have already initiated the apoptosis induced by different agents or stresses. The first step of this project aimed to evaluate dose-response effect of IGF-I during the maturation in vitro (MIV) in a non-defined medium (pre-experiment 1: MIV - 10% of bovine fetal serum) and semi-defined (preexperiment 2: MIV - 6 mg/mL of bovine albumin serum) in competence of bovine oocytes. Therefore, cumulus-oocyte complexes (CCOs) obtained of cows (Bos indicus crossbreed) from a slaughterhouse were matured in vitro in non-defined and semidefined MIV medium supplemented with 0 (vehicle control), 6,25; 12,5; 25; 50; 100 or 200 ng/mL of IGF-I for 22-24 h. After, oocytes were fertilized (FIV) and cultured in vitro (CIV). The adition of 25 ng/ml of IGF-I on non-defined and semi-defined MIV medium increased porcentage of cleavage on day 3 and blastocysts rate in day 8 after fertilization. In this way, 25 ng/ml IGF-I was used on second step of this experiment, which objective was to evaluate the role of IGF-I on oocyte competence of oocytes collected from Bos indicus – Nelore (NEL; n= 6) and Bos taurus-Holstein (HPB; n= 6) exposed to heat stress. Therefore, cows adapted ...

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-04Bitstream added on 2015-04-09T12:48:24Z : No. of bitstreams: 1 000815814.pdf: 419662 bytes, checksum: b03fc09d9d326c880d6e914d837b278f (MD5) / Animais da raça Holandesa, criados nas regiões de clima temperado a quente apresentam baixa eficiência quanto ao número, qualidade e competência oocitária para a produção in vitro de embriões, em comparação às raças Zebuínas. Por outro lado o controle da onda folicular e a estimulação com FSH exógeno pode incrementar o número e melhorar a qualidade e competência oocitária para a produção embrionária. Com o objetivo comparativo sete novilhas, sete vacas não lactantes e sete vacas em lactação foram utilizadas em um delineamento em “crossover” foram submetidas a quatro tratamentos: T1 – Aspiração folicular ao acaso em dia aleatório do ciclo estral; T2 – Aspiração folicular dois dias após a remoção do folículo dominante; T3 - Aspiração folicular 24 horas após remoção do folículo dominante e estimulação com dose única de FSH (100 UI para novilhas e 200 UI para vacas não lactantes ou em lactação) vinte quatro horas antes da aspiração folicular; T4 – Aspiração folicular após estimulação e indução do pico de LH (inserção de implante de progestágeno, aspiração do folículo dominante e estimulação com FSH na dose de 250 UI para novilhas, 500 UI para vacas não lactantes e lactantes, subdividas em 8 doses decrescentes, indução de luteólise e retirada do implante 36 horas antes do GnRH e aspiração folicular 24 horas após a administração de GnRH). Não foi observada diferença estatística entre os tratamentos (P>0,05) quando foi avaliada a recuperação de oócitos, no entanto a categoria de novilhas obteve melhores resultados e apresentou diferença estatística (P<0,05) quando comparada com vacas lactantes e não lactantes, porém não foi observada diferença estatística entre as categorias vacas não lactantes ou vacas lactantes. Quando os oócitos viáveis foram avaliados, a categoria de novilhas apresentou melhor resultado e diferença significativa ... / Holstein cows, bred in temperate to hot climate have low efficiency on the number, quality and oocyte competence for in vitro production of embryos, compared to Zebu breeds. On the other hand the control of follicular wave and stimulation with exogenous FSH can increase the number and improve the quality and oocyte competence for embryo production. With the comparative goal seven heifers, seven non-lactating cows and seven lactating cows were used in a complete crossover were subjected to four treatments: T1 - Follicular Aspiration randomly at any time of the estrous cycle; T2 - Follicular Aspiration two days after removal of the dominant follicle; T3 - Follicular Aspiration 24 hours after removal of the dominant follicle and stimulation with single dose of FSH (100 IU to 200 IU for heifers and non-lactating cows or lactating) twenty four hours before follicular aspiration; T4 - Follicular Aspiration after stimulation and induction of the LH surge (progestagen implant insertion, aspiration of the dominant follicle and FSH stimulation at a dose of 250 IU to 500 IU for heifers and non-lactating and lactating cows, subdivided in 8 decreasing doses, induce luteolysis and removal of the implant 36 hours before of the GnRH and follicular aspiration 24 hours after GnRH administration). No statistical difference between treatments (P>0.05) was evaluated oocyte retrieval was observed, however category heifers achieved better results and statistical differences (P<0.05) compared with lactating cows and non-lactating, although no statistical difference between the categories of non-lactating cows and lactating cows was observed. When the viable oocytes were evaluated, the grade of heifers showed better results and significant difference (P <0.05) compared with lactating and non-lactating cows, and no significant difference was observed between non-lactating cows and lactating cows (P>0.05). In relation to treatments, treatment 1 (T1) differed ...

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Naiara Saraiva Zoccal / Banca: Fábio Morato Monteiro / Banca: José Octavio Jacomini / Banca: Maria Emilia Franco Oliveira / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Resumo: A progesterona e seus análogos têm sido utilizados para diversas finalidades na reprodução animal. O objetivo deste estudo foi avaliar a influencia da progesterona injetável no número de oócitos recuperados, na qualidade oocitária e produção embrionária de novilhas Nelore pré-púberes. Foram utilizadas 31 fêmeas com idade entre 18 a 20 meses, não gestantes e não cíclicas. As doadoras de oócitos foram divididas em 3 grupos experimentais em delineamento crossover da seguinte maneira: Grupo P0 (n=11), os animais deste grupo receberam duas aplicações de solução placebo (1 mL), com intervalo de 7 dias iniciando 14 dias (D-14) antes da primeira aspiração (D-0); Grupo P7 (n=10): os animais receberam uma aplicação de solução placebo (1 mL) 14 dias (D-14) e uma de progesterona (P4) injetável (150mg) 7 dias (D-7) antes da aspiração; Grupo P14 (n=10), neste grupo os animais receberam duas aplicações de P4 injetável (150mg) com intervalo de 7 dias, a primeira 14 dias (D-14) e a segunda 7 (D-7) dias antes da aspiração. Realizaram-se um total de três aspirações foliculares em intervalos de 28 dias. Os animais que apresentaram CL durante o experimento foram alocados em um grupo separado para serem analisados e comparados com o grupo sem CL. Os oócitos recuperados foram selecionados e submetidos aos procedimentos da PIVE. Após a confirmação da homocedasticidade (BoxCox) e normalidade (teste de Cramér-von Mises) dos dados, realizou-se a análise de variância (ANOVA). O teste de Tukey foi utilizado para as comparações das médias das variáveis, para as correlações dos dados foi utilizado o teste de correlação de Pearson, e significantes quando p≤ 0,05. Não foram verificadas diferenças significativas (p>0,05) quanto ao número de oócitos recuperados (oócitos totais), oócitos viáveis (G I, II, III), entre os animais tratados (grupos P7 e P14) em relação aos animais que não receberam P4 (grupo P0). As... / Abstract: Progesterone has been used for various purposes in the animal reproduction. The objective of this study was to evaluate the influence of exogenous progesterone injection in the number of recovered oocyte, oocyte quality and embryo production of prepubertal Nelore heifers. We used 31 females (18 to 20 months) non pregnant and without corpus luteum (CL). Cows were divided in 3 groups in a cross-over design: Group I P0 (n=11), animals received two placebo solution applications (1 mL), 7-day interval and starting 14 days (D-14) before the first aspiration (D-0); Group II P7 (n=10) treated group, the animals received a placebo solution application (1 mL) 14 days (D-14) and injecting progesterone (P4; 150 mg) 7 days (D-7) before aspiration; Group III P14 (n = 10), animals received two injections of P4 (150mμg) with an interval of 7 days, the first 14 days (D-14) and the second 7 days (D-7) before aspiration. We conducted 3 aspiration with 28-day intervals. The animals with CL during the experiment were placed in a separate group to be analyzed and compared with the group without CL. The recovered oocytes were selected and submitted to the procedures of the in vitro embryo production (IVEP). After confirming the homocedasticity (BoxCox) and normality (Cramér-von Mises test) of the data, carried out the analysis of variance (ANOVA). Tukey's test was used to compare the means of the variables and the pearson correlation test was used for correlations of the data, considered significant when p ≤ 0.05. There were no significant differences (p> 0.05) in the number of oocytes retrieved (total oocytes), viable oocytes (GI, II, III), between the animals treated (P7 and P14 groups) and animals that did not receive P4 (P0 group). The animals showed an average of 14.98 ± 10.82 oocytes collected by aspiration session. The mean and standard deviation of rates (%) of viable oocytes and embryos produced did not differ (p> 0.05) between groups. The ... / Doutor