Orientador: Renata Guimarães Moreira Whitton / Banca: Sergio Ricardo Batlouni / Banca: Laura Satiko Okada Nakaghi / Banca: Maria Inês Borella / Banca: Renato Massaaki Honji / Resumo: Muitos peixes de interesse na aquicultura, dentre eles a garoupa-verdadeira, Epinephelus marginatus, exibem disfunções reprodutivas devido ao confinamento, que por sua vez, afetam o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas que controla os processos reprodutivos em vertebrados. O objetivo deste trabalho foi estudar o perfil dos esteroides gonadais e hôrmonio folículo estimulate (FSH) ao longo do ciclo reprodutivo, durante a reprodução induzida e na estimulação da vitelogênese em fêmeas de E. marginatus em cativeiro. Durante o ciclo anual a concentração de andrógenos não se alterou. Por outro lado, o nível plasmático de 17β-estradiol (E2) foi significativamente superior no período final, em comparação com o período inicial de confinamento. Concentrações plasmáticas de 17 α- hidroxiprogesterona (17α-OHP) foram significativamente mais elevadas nos meses de outubro, novembro e janeiro em relação aos meses de maio, junho, julho e agosto, e os níveis de FSH plasmáticos foram superiores em janeiro quando comparados aos meses de junho, julho, agosto e setembro, porém, os ovócitos permaneceram na fase de crescimento primário durante todo o ciclo anual. No primerio experimento de indução hormonal (fêmeas não vitelogênicas) apenas a concentração de 17α-OHP aumentou após a estimulação com gonadotropina coriônica humana (hCG), mas este aumento não se refletiu no diâmetro dos ovócitos e ovulação. No segundo experimento, fêmeas vitelogênicas capturadas no ambiente natural foram induzidas e ovularam no período de 24 a 32 horas após a terceira dose de hCG, apresentando dois padrões diferentes de desova: a desova total ou em pequenos lotes, e os níveis plasmáticos de E2, testosterona (T) e 17α-OHP apresentaram aumento progressivo ao longo dos períodos amostrais. No experimento com implantes de estradiol houve aumento deste estrógeno no plasma, mas sem desencadear a vitelogênese. Por fim, consideramos que... / Abstract: Many fish of interest in aquaculture, including the dusky grouper, Epinephelus marginatus exhibit reproductive dysfunctions due to confinement, which in turn affect the hypothalamus-pituitary-gonadal axis that controls the reproductive processes in vertebrates. The aim of this study was to evaluate the profile of gonadal steroids and follicle-stimulating hormone (FSH) throughout the reproductive cycle, during the induced spawning and vitellogenesis induction in E. marginatus females in captivity. During the annual cycle, the concentration of androgens did not change. Moreover, the plasma levels of 17β-estradiol (E2) was significantly higher in the end of the period compared with the initial period of confinement. Plasma concentrations of 17 α-hydroxyprogesterone (17α-OHP) were significantly higher in October, November and January than May, June, July and August, and serum FSH levels were higher in January compared to June, July, August and September, however, the oocytes remained at the stage of primary growth throughout the annual cycle. In the first hormonal induction experiment (non vitellogenic females) only 17α-OHP increased after stimulation with human chorionic gonadotropin (hCG), however this increase was not reflected in the diameter of oocytes and ovulation. In the second experiment, vitellogenic females captured in the natural environment were induced to spawning and ovulated within 24 to 32 hours after the third dose of hCG, showing two different patterns of spawning: the total spawning or spawning in small batches, and plasma levels of E2, testosterone (T) and 17α -OHP presented a progressive increase over the sampling periods. In the experiment with estradiol implants, an increase of this estrogen was observed, but vitellogenesis was not triggered. Finally, we consider that the use of hCG is viable to induce the final maturation and ovulation in vitellogenic females and we suggest a period of about 3 years of ... / Doutor

A maturação in vitro (MIV) de oócitos é uma técnica de Reprodução Assistida (RA) que apresenta inúmeras vantagens e aplicabilidades. No entanto, a qualidade dos gametas imaturos que são destinados a ela é bastante divergente, tornando-se necessário o desenvolvimento de técnicas que auxiliem na seleção dos gametas competentes, ou seja, aptos à MIV. A partir do conhecimento de que oócitos em fase de crescimento apresentam alta atividade específica da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), e que oócitos que finalizaram seu crescimento apresentam baixa atividade específica dessa enzima, foi proposta a coloração dos gametas com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB) como método de seleção dos oócitos competentes. Esse corante é capaz de ser metabolizado pela G6PDH, resultando na coloração dos gametas capacitados (classificados como BCB positivo), mas não dos gametas que ainda estão em fase de crescimento, que permanecem incolores e são classificados como BCB negativo. Em animais, foi demonstrado que essa técnica permite selecionar melhor os gametas e, consequentemente, aumentar não só as taxas de maturação oocitária nuclear e citoplasmática, como também as taxas de fertilização, de formação de blastocisto e de nascidos vivos. No entanto, apenas modelos animais foram utilizados até o presente momento. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência e a segurança da exposição de gametas humanos ao BCB como método de seleção de gametas competentes antes da MIV. Para isso, três diferentes perfis de pacientes tiveram seus oócitos imaturos incluídos no estudo: 6 pacientes cuja ovulação foi induzida e gametas imaturos foram captados (17 oócitos); 3 pacientes ooforectomizadas (20 oócitos recuperados); e 32 gestantes cujos oócitos foram captados durante a cesareana (92 oócitos recuperados). Os oócitos imaturos foram divididos em dois grupos: controle (colocado imediatamente para MIV) e tratado – exposto a 26 μM de BCB por 60 minutos. Após coloração, de acordo com a coloração do citoplasma, o grupo tratado foi classificado em BCB positivo ou negativo e destinado à MIV. Após 24 e 48 horas de MIV, foi avaliado o grau de maturação nuclear. A taxa de MIV dos oócitos recuperados de pacientes estimuladas e ooforectomizadas foi igual entre os grupos após 24 e 48 horas. No entanto, a taxa de MIV foi significativamente superior no grupo BCB positivo quando comparado com o grupo BCB negativo, tanto para os oócitos de todas as pacientes (P = 0,024 e P = 0,015) como quando os oócitos das gestantes (P = 0,004 e P = 0,032) foram avaliados separadamente, após 24 e 48 horas de MIV, respectivamente. O grupo controle foi similar ao grupo BCB positivo. A taxa de retomada de meiose (ausência de vesícula germinativa) após 24 horas foi igual entre os grupos, independente da fonte de recuperação dos gametas. Contudo, ao avaliar todos os gametas após 48 horas de MIV, a taxa de retomada de meiose foi superior no grupo BCB positivo, quando comparado com os demais grupos (P = 0,035). Quando os oócitos foram avaliados em conjunto, o grupo BCB positivo apresentou as menores taxas de degeneração (P = 0,002). Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o BCB pode ser um bom marcador na seleção de oócitos humanos competentes e não é tóxico para o gameta humano. / The in vitro maturation (IVM) is an Assisted Reproduction Technique (ART) that presents many advantages. However, the quality of immature oocytes destined to IVM is very divergent. That’s why pre-selection procedures of developmentally competent oocytes are important. Growing oocytes synthesize glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), but this enzyme is inactivated in oocytes that have completed their growth phase. Once Brilliant Cresyl Blue (BCB) can be reduced by G6PDH, it is suggested that BCB staining can select fully grown oocytes, when exposed to BCB – the cytoplasm of these eggs will appear blue, being classified as BCB positive, whereas oocytes still in growth phase will not be stained (cytoplasm will appear colourless, being classified as BCB negative). It has been already demonstrated that this selection can improve not only nuclear and cytoplasmic oocyte maturation, but also fertilization and blastocyst rates. However, only animal models were utilized until the present. Consequently, the aim of the experiment was to evaluate the efficiency and safety of BCB staining as a selection of developmentally competent immature human oocytes before IVM. Three kinds of patients were included in the study: 6 hormonal stimulated patients with immature oocytes at retrieval (17 oocytes); 3 ooforectomized patients (20 oocytes recovered); and 32 pregnant patients during cesarean section (92 oocytes recovered). Immature oocytes were divided into groups: control (disposed directly to IVM) and treated - exposed to BCB 26μM during 60 minutes. After staining, treated group was classified as cytoplasm coloration, BCB positive or negative, and then disposed to IVM. After 24 and 48 hours of IVM, nuclear status was checked. The IVM rate of immature oocytes recovered from stimulated and ooforectomized patients was equal among groups either after 24 or 48 hours of IVM. Nevertheless, IVM was higher in BCB positive compared to BCB negative after 24 and 48 hours of IVM analyzing oocytes recovered from all patients (P = 0.024 and P = 0.015), and from cesarean patients (P = 0.004 and P = 0.032). The control group was equal to BCB positive. The meiosis resumption rate (absence of germinal vesicle) after 24 hours of IVM was equal among groups, but higher in BCB positive compared to other groups after 48 hours when all gametes were analyzed jointly (P = 0.035). Degeneration rate was lower in BCB positive compared to their counterparts when oocytes were analyzed jointly (P = 0.002). In conclusion, BCB test can be a good marker in pre-selection procedures of developmentally competent human oocytes and, apparently, it is not toxic to the gamete.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present study as conducted to examine semiquantitative gene expression of annexin II (ANEII) during all follicular phases of folliculogenesis in bovine, in preantral follicles and oocytes of antral follicles too in different size (<3mm, 5-8mm e >9mm in diameter). It was investigated the gene expression of ANEII influenced by retinol during oocyte maturation. In addition we examine annexin II (ANEII) presence during embryonic development and regulation of gene expression to ANEII by retinol and insulin like growth factor (IGF-I) was availed. Bovine ovaries from adults and fetal females was collected in abattoir and cumulus-oocyte complexes and preantral follicles were recovered. mRNA extraction and cDNA formation was carried out to produce ANEII amplification by polymerase chain reaction. Bovine embryos were used at initial phases of development from in vitro production in SOF medium or retinol and/or IGF-I supplemented. Bovine embryos were submitted to mRNA extraction and cDNA formation and ANEII amplification was obtained by polymerase chain reaction (PCR). Preantral follicles at secondary stages presented gene expression to ANEII. Oocytes from different follicular sources in germinal vesicle (GV) stage were significantly different (p<0,05) in gene expression. Gene expression to ANEII in oocytes of larger 8mm follicles were significantly higher than those from 3mm and 5-8mm (p<0,05). The similar results were obtained in metaphase II (MII) phase. However difference was not observed between oocytes from 3mm and 5-8mm follicles. Oocytes from follicles larger 8mm presented higher ANEII expression than those from 3mm follicles, but difference was not observed to the oocytes from 5-8mm (p<0,05). The ANEII gene expression was increase with retinol supplementation during maturation process in contrast to control group (p<0,05). The ANEII was present during early embryonic development except in 16 cells. The rate of embryo production was increased by supplementation with retinol in culture medium (p<0,05) in contrast with control and IGF-I group. The control group (20,5%; 24/117) was similar with IGF-I group (25,8%; 24/93) and both were significantly lower than retinol (37,8%; 45/119). Semi quantitative analyses of ANEII gene expression was significantly higher in control group than retinol or IGF-I embryo treated (p<0,05). However retinol and IGF-I were not different. ANEII have more expression in oocytes in capacitating process. Retinol increases the mRNA availability to ANEII and could be involved in oocyte competence. In conclusion, in vitro embryo production is increased by retinol supplementation and could be regulating the gene expression of ANEII during embryo development. Decrease in gene expression to ANEII determines a qualitative and quantitative increase in in vitro embryo production. / O objetivo do presente estudo foi determinar o perfil de expressão de anexina II (ANEII) em folículos pré-antrais, oócitos e desenvolvimento embrionário bovino, e sua regulação pelo retinol e fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I). Expressão de ANEII foi verificada em folículos primordial, primário e secundário, em oócitos de folículos antrais de diferentes tamanhos (<3mm, 5-8mm e >8mm de diâmetro), em embriões de 2, 4, 8, 16 e 32 células e em blastocisto e blastocisto expandido. Além disso, foi investigada a influência do retinol sobre a expressão de ANEII em oócitos e no desenvolvimento embrionário e, neste último, também foi estudada a participação do IGF-I na expressão dessa proteína. Ovários de fêmeas bovinas adultas e de fetos foram coletados em abatedouro e submetidos a punção folicular ou isolamento de folículos pré-antrais. Complexos cumulus-oócito e folículos préantrais foram processados para extração de RNAm, obtenção de cDNA e realizado reação da polimerase em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos específicos para ANEII. Foram utilizados embriões bovinos produzidos in vitro em diferentes estádios de desenvolvimento em meio SOF e também suplementados com retinol e IGF-I. Os embriões foram processados para extração de RNAm, obtenção de cDNA e realizada a reação da polimerase em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos específicos para ANEII. Apenas folículos préantrais secundários apresentaram expressão de ANEII. Em estádio de vesícula germinativa (VG), os oócitos oriundos de diferentes tamanhos foliculares diferiram entre si (p<0,05) quanto à expressão de ANEII, onde oócitos de folículos <3mm e de 5-8mm foram significativamente inferiores aos oócitos de folículos >8mm. Em metáfase II (MII), oócitos de folículos <3mm apresentaram menor expressão de ANEII em relação à oócitos de folículos >8mm (p<0,05) e não diferiram de oócitos de folículos de 5-8mm. No entanto, oócitos de folículos de 5-8mm foram similar na expressão de ANEII aos oócitos de folículos >8mm. O retinol utilizado no período de maturação promoveu um incremento na expressão de ANEII quando comparado ao controle (p<0,05). A ANEII está presente em todos os estádios de desenvolvimento embrionário precoce, com exceção em embriões de 16 células. A utilização de retinol durante o desenvolvimento embrionário, promoveu um incremento significativo (p<0,05) na produção de blastocisto, avaliados no dia 6 após a fecundação, em relação ao grupo controle e ao grupo IGF-I. No grupo controle foi obtido um percentual de 20,5% (24/117) de blastocistos sobre o número total de oócitos cultivados, não diferindo do grupo IGF-I, onde se obteve um índice de 25,8% (24/93) de blastocistos. No grupo retinol, o percentual de blastocisto foi significativamente superior com 37,8% (45/119). Na avaliação semiquantitativa da expressão de ANEII em embriões produzidos em meio suplementado com IGF-I (10ng/ml de meio) ou retinol (0,1ng/ml de meio), foi observado uma menor expressão de ANEII quando estas substâncias estavam presentes no meio em relação ao controle (p<0,05). A expressão semiquantitativa de ANEII não diferiu entre os grupos retinol e IGF-I. A ANEII tem uma maior expressão em oócitos capacitados e o retinol aumenta a disponibilidade de RNAm para ANEII, podendo estar envolvido na regulação da competência oocitária por diminuir a tradução ou evitar a degradação. A produção de embriões in vitro é incrementada na presença de retinol que atua modulando a expressão de ANEII durante o desenvolvimento embrionário. A diminuição na expressão de ANEII na embriogênese de bovinos determina um aumento qualitativo e quantitativo na produção in vitro de embriões.

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Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Coorientador: Anthony César de Souza Castilho / Banca: Mariana Fernandes Machado / Banca: Ester Siqueira Caixeta / Resumo: O fator de crescimento semelhante à insulina-1 recombinante-3 (IGF-LongR3), um análogo sintético do IGF-1 de maior biodisponibilidade, ainda não foi utilizado no meio de maturação in vitro (MIV) de complexos cumulus-oócito (CCOs). Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar e comparar os efeitos da adição de IGF-LongR3 e do fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) na MIV de CCOs bovinos, sobre a progressão meiótica, apoptose e expressão de genes nos oócitos (GDF9, BMP15, BAX, BCL2, OOSP1, IGFBP2, IGBFP4 e IGFBP5) e respectivas células do cumulus (AREG, EGFR, FSHR, COX2, BAX, BCL2, IGFBP2, IGFBP4 e IGFBP5). Ovários bovinos foram coletados em abatedouro, sendo selecionados 739 CCOs após aspiração de folículos de 2-8mm de diâmetro. A MIV foi realizada em meio base de maturação contendo IGF-1 (100ng/mL), IGF-LongR3 (100ng/mL), e dois grupos controles: 0,1% de álcool polivinílico (PVA) ou 10% de soro fetal bovino (SFB), durante 22-24 horas em estufa a 38,5ºC e 5% de CO2. Posteriormente os oócitos foram desnudados e preparados para a técnica de TUNEL, coloração Hoechst 33342 e RT-qPCR, intencionando-se avaliar a apoptose, maturação nuclear e a expressão gênica, respectivamente. A análise estatística foi realizada por um modelo linear de efeitos mistos, o qual relacionou a mudança de estádio de metáfase 1 para metáfase 2 e a ausência de apoptose entre os grupos experimentais, pelo programa lmer4. Os testes ANOVA e Tukey foram utilizados para análise dos resultados obtidos pelo RT-qPCR. Ao final de dez réplicas de MIV foram avaliados 339 (n= 5 réplicas) oócitos quanto à progressão meiótica e apoptose e 400 (n= 5 réplicas) quanto à expressão gênica. Não foi observada diferença significativa (P<0,05) entre os grupos experimentais com relação à progressão meiótica e apoptose. Foi possível detectar a expressão de mRNA para todos os genes avaliados nos oócitos e respectivas células... / Abstract: The insuline like growth factor-1 recombinant-3 (LongR3-IGF-1) a synthetic analogue of IGF-1 with greater bioavailability has not yet been used in in vitro maturation medium of cumulus-oocyte complexes (COCs). Therefore the aim of this study was to evaluate and compare the effects of LongR3-IGF-1 and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) addition in the IVM of bovine oocytes on meiotic progression, apoptosis, and genic expression COCs (GDF9, BMP15, BAX, BCL2, OOSP1, IGFBP2, IGBFP4 e IGFBP5) and their respectively cumulus cells (AREG, EGFR, FSHR, COX2, BAX, BCL2, IGFBP2, IGFBP4 e IGFBP5). Bovine ovaries were collected in slaughterhouse being selected 739 oocytes after aspiration of follicles from 2-8mm diameter. In vitro maturation (IVM) was performed on basic maturation medium containing IGF-1 (100 ng/ml), LongR3-IGF-1 (100ng/ml), and two control groups: 0.1% polyvinyl alcohol (PVA) or 10% fetal bovine serum (FBS), for 22-24 hours in an incubator at 38.5°C and 5% CO2. Subsequently oocytes were denuded and prepared for TUNEL technique, staining Hoechst 33342 and RT-qPCR, intending to evaluate apoptosis, nuclear maturation and gene expression, respectively. Statistical analysis was performed using a linear mixed effects model, which correlated the change in metaphase stage 1 to 2 and the absence of apoptosis among the experimental groups. ANOVA and Tukey tests were used to analyze the results obtained by RTqPCR. After ten replicas of IVM, 339 oocytes (n=5 pools) were evaluated for meiotic progression and apoptosis and 400 (n=5 pools) for gene expression. There was no statistical difference (P>0,05) between the experimental groups with respect to meiotic progression and apoptosis. It was possible to detect mRNA expression of all evaluated genes in the oocyte and its cumulus cells in all experimental groups. There was statistical difference between the group 10% FBS and IGF-1 and LongR3-IGF-1 groups for the expression of gene IGFBP4 in ... / Mestre

Orientador: Fabíola de Paula Lopes / Banca: Gisele Ziccal Mingoti / Banca: José Antônio Visintin / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: Divergências genéticas de termotolerância foram demonstradas entre animais Bos taurus taurus (Holandesa) e Bos taurus indicus (Nelore). O efeito deletério do estresse térmico sobre o potencial de desenvolvimento do oócito é maior para Bos taurus taurus em comparação aos oócitos Bos taurus indicus. Portanto, o presente estudo determinou o perfil do transcriptoma em oócitos das raças Nelore e Holandesa submetidos ao estresse térmico durante a maturação in vitro (MIV), bem como a abundância de RNAm de genes candidatos em oócitos e células do cumulus submetidos aos mesmos tratamentos. Vacas não lactantes das raças Holandesa e Nelore foram submetidas à aspiração folicular guiada por ultra-som durante a estação fria. Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram aleatoriamente distribuídos nos tratamentos controle (38,5 °C por 22 horas) e estresse térmico (41 °C por 12 horas, seguido de 38,5 °C por 10 horas) durante a MIV. Oócitos desnudados foram submetidos à análise de microarray bovino (Affymetrix). Genes com fold change de pelo menos 1,5 e P<0,05 foram considerados diferencialmente expressos. A análise de microarray demonstrou 127, 9 e 6 genes diferencialmente expressos entre Raça, Temperatura e interação Raça x Temperatura, respectivamente. Os genes diferencialmente expressos foram avaliados por RT-PCR em oócitos e nas suas respectivas células de cumulus. Houve uma correlação positiva entre o fold change do microarray e do RT-PCR dos oócitos para os genes KIF3A, CLDN11, BIRC3, DAP, MT1E, CCT4, DICER1 e DENND3. Em particular, o gene membro da família cinesina 3A (KIF3A) foi induzido em oócitos de Holandesa, enquanto que os genes da proteína associada à morte (DAP) e de tráfego intracelular de membrana domínio DENN/MADD 3 (DENND3) foram reprimidos em oócitos de Holandesa quando comparados a Nelore. A abundância relativa do RNAm da molécula antioxidante metalotioneína 1E ... / Abstract: Genetic divergences in thermotolerance have been demonstrated between Bos taurus taurus (Holstein) and Bos taurus indicus (Nelore) animals. The deleterious effect of heat stress on oocyte developmental potential is greater for Bos taurus taurus as compared to Bos taurus indicus oocytes. Therefore, the present study determined transcriptome profile in Nelore and Holstein oocytes subjected heat shock during in vitro maturation (IVM) as well as mRNA abundance of selected candidate genes in Nelore and Holstein heat-shocked oocytes and cumulus cells. Non-lactating Holstein and Nelore cows were subjected to ultrasound-guided follicle aspiration during the cool season. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were randomly assigned to control (38.5°C for 22 hours) and heat shock (41°C for 12 hours followed by 38.5°C for 10 hours) treatments during IVM. Denuded oocytes were subjected to Affymetrix bovine microarray. Genes with fold change of at least 1.5 and P< 0.05 were considered differently expressed. Microarray analyses demonstrated 127, 9 and 6 genes differentially expressed between Breed, Temperature and Breed x Temperature interaction, respectively. Selected differentially expressed genes were evaluated by RTPCR in oocytes and respective cumulus cells. There was a positive correlation between oocyte microarray and RT-PCR fold change for the genes KIF3A, CLDN11, BIRC3, DAP, MT1E, CCT4, DICER1 and DENND3. In particular, the member of the kinesin family 3A (KIF3A) gene was up-regulated in Holstein oocytes, while the deathassociated protein (DAP) and the protein trafficking gene DENN/MADD domain containing 3 (DENND3) were down-regulated in Holstein oocytes as compared to Nelore. The mRNA relative abundance of the antioxidant molecule metallothionein 1E (MT1E) was higher in Holstein cumulus cells, whereas, claudin 11 (CLDN11) that participates in cellular tight junctions, was higher in Nelore. Moreover, heat shock down regulated MT1E mRNA abundance ... / Doutor

Orientador: José Antonio Dell'Aqua Junior / Banca: Marco Antonio Alvarenga / Banca: Silvia Ferrari / Resumo: A indução de múltiplas ovulações nas espécies domésticas é de extrema importância para a melhoria dos resultados e custos de biotécnicas como a transferência de embriões, inseminação com sêmen de baixa fertilidade, transferência de oócitos, entre outras. Este estudo teve como objetivo determinar se a sulpirida poderia induzir multiplas ovulações em éguas. Dezessete éguas foram aleatoriamente utilizadas nos dois grupos experimentais. No grupo de éguas tratadas com sulpirida 1mg/kg (IM) a cada 12 horas, o protocolo foi iniciado apenas em éguas que alcançaram um folículo de 24 mm ± 2mm de diâmetro e um segundo folículo ≥ 20 ± 2 mm de diâmetro. No grupo controle, utilizou-se o mesmo protocolo de início do tratamento porém as éguas foram tratadas com solução salina 0,9% (IM) a cada 12 horas. Em ambos os grupos, se durante as avaliações ultrassonográficas era verificado crescimento folicular concomitante de dois ou mais folículos, o tratamento perdurava até quando o menor folículo atingisse no mínimo 33 mm de diâmetro. Neste momento a ovulação foi induzida com 1500 UI de hCG. A inseminação artificial foi realizada 24 horas após a indução, e os embriões foram coletados no oitavo dia após a primeira ovulação. As variáveis estudadas foram analisadas utilizando o teste t de Student e teste exacto de Fisher. No grupo tratado, 35% das éguas tiveram mais que uma ovulação e uma média de 1,4 ovulações por ciclo enquanto que no grupo controle apenas 11% das éguas tiveram mais que uma ovulação e uma média de 1,1 ovulações por ciclo. No grupo tratado com sulpirida o tempo de início do tratamento até a primeira ovulação foi de 3,9 ± 0,9 dias enquanto que no grupo controle foi de 4,9 ± 1,0 (P<0,001). A administração da Sulpirida durante o desenvolvimento folicular, estimulou a atividade ovariana e não contribuiu para um aumento significativo nas taxas de duplas ou triplas ... / Abstract: The induction of multiple ovulations in domestic species is of extreme importance to provide improvements of results and costs of biotechnologies such as embryo transfer, artificial insemination with poor quality semen, oocyte transfer among others. This study aimed to determine if sulpiride could induce multiple ovulations in mares. Seventeen mares randomly passed the two experimental groups. In the group of mares treated with sulpiride 1mg/kg (IM) every 12 hours, the protocol was initiated only in mares that have achieved a follicle of 24 mm ± 2 mm in diameter and a second follicle ≥ 20 ± 2 mm in diameter. In the control group, were used the same protocol, but the mares were treated with 0.9% saline solution (IM) every 12 hours. During the ultrasound evaluation if was observed the follicular growth the treatment even when the lower follicle reached at least 33 mm in diameter. At this time the ovulation was induced with 1500 IU of hCG. Artificial insemination was performed 24 hours after ovulation induction, and the embryos were collected on the eighth day after the first ovulation. The variables were analyzed using Student's t Fisher's exact test and test. In group treated, 35% of the mares had more than one ovulation and ovulation an average of 1.4 per cycle while in control group only 11% of the mares had more than one ovulation and ovulation an average of 1.1 per cycle. In the group treated with sulpiride the time of the treatment beginning to the first ovulation was 3,9 ± 0.9 days whereas the control group was 4.9 ± 1.0 (P<0,001). Administration of Sulpiride during follicular development stimulated ovarian activity but did not contribute to a significant increase in the rates of double or triple ovulations, however some mares had a higher incidence of multiple ovulations when subjected to the proposed protocol, suggesting that further studies should be conducted for clarification of these results / Mestre

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico encontrado em diversos tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos. A síntese do NO é realizada pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Um dos mecanismos de ação do NO é dado pela ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), resultando na produção de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), um mensageiro secundário nessa via de sinalização celular. O GMPc por sua vez é capaz de modular a atividade de algumas fosfodiesterases (PDEs), enzimas responsáveis pela degradação do GMPc e de outro nucleotídeo cíclico, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da elevação dos níveis de NO por meio do doador de óxido nítrico (SNAP) e o uso de inibidores de diferentes isoformas de fosfodiesterases no meio de cultivo durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos sobre a retomada da meiose, concentração de NO e níveis de GMPc e AMPc. Deste modo, os complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram cultivados por até 9 horas com o doador de NO (SNAP - 10-7 M) associado ou não ao inibidor de GCs (ODQ - 10-5 M) e associado ou não aos inibidores das fosfodiesterases, PDE5 (Sildenafil - 10&micro;M), PDE3 (Cilostamide - 20&micro;M) e PDE8 (Dipiridamole - 50&micro;M). As amostras foram avaliadas quanto a taxa de retomada da meiose, níveis de NO (9h de MIV) e níveis dos nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc (0, 1, 2 e 3h de MIV). O SNAP retardou o rompimento da vesícula germinativa com 9horas de cultivo (P&lt;0,05) e quando o SNAP foi associado ao ODQ o efeito foi revertido (P&gt;0,05). A inclusão de SNAP no cultivo, os níveis de NO foram elevados (P&lt;0,05). Os níveis de GMPc só foram influenciados positivamente pelo SNAP com 1 hora de cultivo (P&lt;0,05) e após 2 e 3 horas, esta influência não persistiu (P&gt;0,05), visto que o ODQ aboliu o efeito. A influência do SNAP foi devido ao estímulo da GCs. Para os níveis de AMPc, o doador de NO não foi capaz de influenciar suas concentrações durante as 3 horas de cultivo (P&gt;0,05). Quando o SNAP foi associado ao Sildenafil (SNAP+SIL) não houve diferença em relação ao grupo imaturo (P&gt;0,05), porém, também não se diferiu do tratamento SNAP e controle (P&gt;0,05). Para as taxas de retomada de meiose todos os tratamentos foram eficientes e conseguiram retardar a quebra da vesícula germinativa diante do grupo controle (P&lt;0,05), sendo o grupo SNAP+CIL mais eficiente. Para os níveis de AMPc, nem mesmo com a utilização de inibidores das PDE3 e PDE8 foi possível atenuar a queda do nucleotídeo. Em conclusão, o SNAP exerceu influência na retomada da meiose, na concentração de NO e nos níveis de GMPc sendo que sua ação se deve à atividade da GCs. Não houve influência sobre os níveis de AMPc, quando o SNAP foi associado a inibidores específicos de fosfodiesterases, mesmo quando apresentaram efeito sobre a retomada da meiose. A via NO/GCs/GMPc não parecer atuar sobre a via PDE3/AMPc, sugerindo a ação de outras vias no controle da meiose. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger found in many cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages. The synthesis of NO is made by the action of nitric oxide synthase (NOS). One of the mechanisms of action of NO is given by the activation of the enzyme soluble guanylate cyclase (sGC), resulting in the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), a secondary messenger in this pathway of cell signaling. The cGMP in turn is capable of modulating the activity of some phosphodiesterases (PDEs), enzymes responsible for degradation of cGMP and other cyclic nucleotide, cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The objective of this study was to investigate the effects of elevated levels of NO via nitric oxide donor (SNAP) and the use of inhibitors of phosphodiesterase isoforms in the culture medium during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP and cAMP levels. Thus, the complexes cumulus-oocyte (COCs) were cultured for cattle up to 9 hours with the NO donor (SNAP - 10-7 M) with or without the inhibitor of sGC (ODQ - 10-5 M) and with or without to inhibitors of phosphodiesterase PDE5 (Sildenafil - 10&micro;M), PDE3 (Cilostamide - 20&micro;M) and PDE8 (Dipyridamole - 50&micro;M). The samples were evaluated for the rate of resumption of meiosis, levels of NO (9h - IVM) and levels of cyclic nucleotides cGMP and cAMP (0, 1, 2 and 3h - IVM). The SNAP delayed with germinal vesicle breakdown of 9hours cultivation (P &lt; 0.05) when SNAP was associated with ODQ was reversed the effect (P&gt; 0.05). The inclusion of SNAP cultivation, NO levels were increased (P&lt;0.05). cGMP levels were positively influenced only by the snap 1 hour in culture (P&lt;0.05) and after 2 and 3 hours, this effect was not maintained (P&lt;0.05), whereas ODQ abolished the effect. The influence of SNAP was due to stimulation of GCs. For cAMP levels, the NO donor was not able to influence their concentrations during the 3 h incubation (P&gt;0.05). When SNAP was associated with Sildenafil (SIL+SNAP) there was no difference compared to the immature group (P&gt;0.05), however, also did not differ from SNAP treatment and control (P&gt;0.05). Rates for resumption of meiosis all treatments were efficient and able delay before germinal vesicle breakdown in the control group (P&lt;0.05), with SNAP+CIL group more efficient. For cAMP levels, even with the use of inhibitors of PDE3 and PDE8 was possible to alleviate the decrease of the nucleotide. In conclusion, SNAP exerted influence on the resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP levels and that its action is due to a GCs activity. There was no effect on cAMP levels, when SNAP was associated with specific phosphodiesterase inhibitors, even when presented effect on the resumption of meiosis. The pathway NO/sGC/cGMP seem not act on the pathway PDE3/AMPc, suggesting the action of other pathways in the control of meiosis.

Tendo em vista a possibilidade da associação de agentes ativadores aliada à influência da idade do oócito no desenvolvimento embrionário, a proposta deste trabalho foi estudar a relação entre o envelhecimento do oócito e a ativação partenogenética. Para tal, oócitos bovinos foram maturados in vitro por um período de 22 h (jovens) e 28 h (envelhecidos). Em seguida, os dois grupos de oócitos foram ativados com os tratamentos: ID3: ionomicina (5 µM por 5 min) + 6DMAP (2 mM por 3 h de incubação); ID6: ionomicina (5 µM por 5 min) + 6DMAP (2 mM por 6 h de incubação); IDS: ionomicina + associação 6DMAP (2 mM) e estrôncio (20 mM; SrCl2) por 6 h e IDSS: ionomicina + (6DMAP+Sr) nas primeiras 3 h, seguido de lavagem e incubação com estrôncio (Sr2+) isoladamente por mais 3 h de incubação. O grupo controle foi cultivado na ausência de qualquer agente ativador (ativação espontânea). Após a ativação os oócitos foram avaliados quanto a: 1) taxa de ativação (formação de pronúcleo às 12 hpa); 2) atividade do fator promotor de maturação (MPF) e proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK) nos intervalos de 5 min, 3 h, 6 h e 10 h; 3) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem às 48 h, dia 7 e 9 taxas de blastocisto e eclosão); 4) qualidade dos embriões (dia 9 pelo número total de células, apoptose e expressão de interferon-t). Em geral, oócitos jovens apresentaram menor taxa de ativação e maior atividade de MPF e MAPK em relação aos envelhecidos. No entanto, a incubação dos oócitos em 6DMAP por 6 h permitiu taxas semelhantes aos envelhecidos com pequeno prejuízo em número de células, sem efeitos em outros critérios de qualidade do embrião. Os dados sugerem possíveis aplicações destes resultados de maneira a contribuir para a TN com flexibilidade de horários e produção de embriões de boa qualidade. / Considering the possibility of the combination of different activating agents associated to the influence of oocyte ageing on embryo development, the purpose of this work to study the relationship between oocyte ageing and parthenogenetic activation. Bovine oocytes were in vitro maturated for 22 (young) and 28 h (aged). Next, both groups of oocytes were activated using the following treatments: ID3: ionomycin (5 µM for 5 min) + 6DMAP (2 mM for 3 h); ID6: ionomycin (5 µM for 5 min) + 6DMAP (2 mM for 6 h); IDS: ionomicyn + 6DMAP (2 mM) and strontium (20 mM; SrCl2) for 6 h and IDSS: ionomicyn + (6DMAP+Sr2+) for the first 3h, followed by incubation with Sr2+ alone for another 3 h. The control group was cultured in the absence of any activating agents (spontaneous activation). After activation, the oocytes were evaluated for: 1) activation rate (pronuclei formation at 12 hpa); 2) activity of maturation promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinase (MAPK) at 5 min, 3 h, 6 h and 10 hpa; 3) embryo development (cleavage rate at 48 h and blastocyst and hatching rates on days 7 and 9); 4) embryo quality (day 9 regarding total cell numbers, apoptosis and interferon-t expression). In general, young oocytes showed lower activation rates and higher MPF and MAPK activity when compared with aged oocytes. However, incubation of the oocytes with 6DMAP for 6 h allowed development rates similar to aged oocytes with a small decrease in total cell number, but without effects on other criteria of embryo quality. The data suggest a possible application of these results in such a way to contribute for timing flexibilization in NT experiments and production of good quality embryos.

Avaliou-se o efeito da dieta com diferentes níveis de energia [mantença (M) e alta energia (1,7M)] nos parâmetros metabólicos, endócrinos e reprodutivos de vacas não lactantes Bos indicus (14 Gir) e Bos taurus (14 HPB) submetidas aspiração folicular (OPU) seguida de produção in vitro de embriões. Os animais foram distribuídos aleatoriamente de acordo com a raça e a dieta. As doadoras foram mantidas em sistema Tie stall e as dietas foram fornecidas duas vezes ao dia (8:00 e 16:00 h). Os animais receberam dieta M por uhm período de adaptação de 21 dias. Após esse período, os grupos experimentais foram submetidos a nove punções foliculares com intervalos de 14 dias. Para realização da OPU, no D0 as doadoras foram sincronizadas com 2 mg de benzoato de estradiol e um implante auricular de norgestomet. No D5, as OPUs foram realizadas. Não houve interação entre as espécies e níveis de energia na dieta para as variáveis estudadas. Não foram observadas diferenças quali-quantitativa dos oócitos entre as dietas. Porém, houve diferença na quantidade e qualidade oocitária entre as espécies estudadas. Vacas Bos indicus apresentaram maior quantidade de estruturas recuperadas e melhor qualidade oocitária que as doadoras Bos taurus. Semelhantemente aos resultados da qualidade e quantidade oocitária, a produção in vitro de embriões também não diferiu entre as dietas e verificou-se maior produção in vitro de embriões em vacas Bos indicus. No entanto, foi observado que o excesso de energia reduziu a produção in vitro de embriões após 60 dias de fornecimento da dieta somente em vacas Bos indicus. Verificou-se menor abundância de transcritos para os genes IGF2R e HSP70.1 em oócitos de vacas alimentadas com alta energia na dieta. Além disso, observou-se que vacas da raça Gir apresentaram maior abundância de transcritos para os genes GLUT1 e IGF1R. Vacas alimentadas com excesso de energia na dieta apresentaram maiores concentrações séricas e no fluido folicular de glicose e colesterol e maiores níveis de AGNE no líquido folicular. Porém, a concentração de nitrogênio ureico no soro e no fluido folicular foi maior nas vacas que receberam dieta de mantença. Quanto ao grupo genético, observou-se que vacas Bos indicus apresentavam maiores concentrações de glicose, colesterol, AGNE e nitrogênio ureico, tanto no líquido folicular quanto no soro. Além disso, as concentrações de insulina e IGF1 no líquido folicular foram maiores nas vacas do Grupo alta energia Bos indicus . Por fim, observou-se quadro de hiperinsulinemia (Gir [insulina] &gt; 51,9 &#956;UI/ml e HPB [insulina] &gt;17,2 &#956;UI/ml) em 60% das vacas Bos indicus que receberam alta energia na dieta. Conclui-se que o aumento de energia na dieta não interferiu na quantidade e qualidade (avaliada visualmente) de oócitos. No entanto, o excesso de energia reduziu a produção in vitro de embriões em vacas Bos indicus após 60 dias de fornecimento da dieta. Além disso, vacas Bos indicus apresentaram melhor qualidade e maior quantidade de oócitos viáveis e produção in vitro de embriões que as doadoras Bos taurus. / The effect of different energy levels in diet [maintenance (M) and high energy (1.7M)] was evaluated on metabolic, endocrine and reproductive parameters of non lactating Bos indicus (n=14) and Bos taurus (n=14) cows submitted to ultrasound guided ovum pick up (OPU) followed by in vitro embryo production. Cows were randomly assigned, according to their breed and diet. The oocyte donors were housed in Tie Stall System and the diets were given twice daily (8:00 AM e 4:00 PM). During 21 days prior to the beginning of experiment, animals were fed with the maintenance diet for their adaptation. After this period, the experimental groups were submitted to nine OPU procedures, fourteen days apart each. To synchronize the donors, cows received 2mg of estradiol benzoate on day 0 (D0) and one norgestomet auricular implant. The OPU were performed on D5. There were no interaction between breeds and energy level in diet for the evaluated variables. No qualitative or quantitative differences were in oocytes between the two diets. However, there was difference in oocyte number and quality between breeds. Bos indicus cows showed higher number of recovered structures and better oocyte quality when compared to Bos taurus donors. Similar to what was found in oocyte quality and number, the in vitro embryo production also did not differ between diets and it was observed that Bos indicus cows had higher production of embryos. However, we verified that the energy surplus reduced in vitro embryo production in Bos indicus cows after 60 days of high energy diet. It was also possible to observe lower oocytes transcripts abundance for IGF2R and HSP70.1 genes of cows fed with high energy diet. Moreover, Gir cows showed higher transcript abundance for GLUT1 and IGF1R genes. Cows fed with excess of energy in diet presented higher serum and follicular fluid concentrations of glucose and cholesterol and increased NEFA levels in follicular fluid. However, the ureic nitrogen concentration was higher in cows which received maintenance diet. When comparing the two genetic groups, it was observed that Bos indicus cows presented higher concentrations of glucose, cholesterol, NEFA and ureic nitrogen both in follicular fluid and in blood. Furthermore, cows that presented decreased blastocyst rate (high energy - Bos indicus) exhibited high follicular fluid concentrations of insulin and IGF1. Finally, it was observed that 60% of Bos indicus cows fed with high energy diet presented yperinsulinemia (Gir [insulin] > 51.9 &#956;UI/ml and HPB [insulin] >17.2 &#956;UI/ml). In conclusion, increasing energy in diet did not interfere in oocyte number and quality (visual evaluation). However, the energy surplus reduced the in vitro embryo production in Bos indicus cows after 60 days of diet. Moreover, Bos indicus cows showed better oocyte quality, higher number of viable oocytes and increased in vitro embryo production than Bos taurus donors.