Replicative and chronological lifespan are two different modes of cellular aging. Chronological lifespan is defined as the duration during which quiescent normal cells retain their capacity to re-enter the proliferative cycle. This study investigates whether changes in metabolism occur during aging of quiescent normal human fibroblasts (NHFs) and the mechanisms that regulate these changes. Bioenergetics measurements were performed in quiescent NHFs from younger (newborn, 3-d, 5-m, and 1-y) and older (58-y, 61-y, 63-y, 68-y, and 70-y) donors as well as NHFs from the same individual at different ages (29-y, 36-y, and 46-y). Results show significant changes in cellular metabolism during aging of quiescent NHFs: old NHFs exhibit significant decreases in glycolytic flux and lactate levels, and increases in oxygen consumption rate (OCR) and ATP levels compared to young NHFs. Results from Seahorse Mito Stress Test show that old NHFs with a lower Bioenergetic Health Index (BHI) are more prone to oxidative stress compared to young NHFs with a higher BHI. The increase in OCR in old NHFs is associated with a shift in mitochondrial dynamics more towards fusion. Genetic knock-down of mitofusin 1 (MFN1) and optic atrophy 1 (OPA1) in old NHFs decreased OCR and shifted metabolism more towards glycolysis. Downregulation of MFN1 and OPA1 also suppressed the radiation-induced increase in doubling time of NHFs. These results suggest that a metabolic shift from glycolysis in young to mitochondrial respiration in old NHFs occurs during the chronological lifespan, and MFN1 and OPA1 regulate this process. Age-associated metabolic reprogramming can also impact the age-related disease progression such as cancer. Recent evidence suggests a significant role of fibroblasts in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) stromal cellularity, metabolism, and therapy response. Considering PDAC being an age-related disease and a dismal 5-y survival of less than 9%, this study investigates whether stromal aging regulates PDAC progression. Results show that NHFs from older healthy individuals stimulate proliferation of PDAC cells compared to younger NHFs. Results from an in vivo study show that rate of tumor growth in xenografts of PDAC cells cultured with the old NHFs is significantly increased compared to the co-cultures of the young NHFs. In addition, decreased survival was also observed in mice carrying xenograft of co-culture of PDAC and the old NHFs compared to the young NHFs. Results from quantitative RT-PCR assays show that arachidonic acid lipoxygenase (ALOX12) expression decreased in PDAC, but increased in stromal fibroblasts in an age-dependent manner. Molecular inhibition of ALOX12 in the old NHFs suppressed PDAC proliferation in co-culture. These results show that aging of stromal fibroblasts aging promotes progression of PDAC, and identified ALOX12 and its metabolite 12-hydroxyeicosatetraenoic acid (12(S)-HETE) as critical regulators of PDAC proliferation. Taken together, findings from this project demonstrate that age-associated metabolic reprogramming of NHFs from glycolysis in young to mitochondrial respiration in old regulates fibroblasts-induced stimulation of proliferation of human PDAC. Importantly, results from this study are anticipated to contribute to the development of novel approaches targeting stromal aging for cancer prevention and therapy response.

Mitochondria exist in a dynamic network regulated by the opposing processes of mitochondrial fusion and fission. Regulation of mitochondrial morphology is critical for metabolism, quality control and cell survival, among other cellular processes. Large GTPases are responsible for shaping the mitochondrial network. Mitofusins 1 and 2 and Opa1 regulate outer and inner mitochondrial membrane fusion, respectively. Conversely, Drp1 is recruited to mitochondria to carry out fission. Although many proteins have been implicated in these processes, there are still many unknowns. We sought to identify novel regulators of mitochondrial morphology and conducted a genome-wide RNAi screen to identify candidate genes. We identified Reactive Oxygen species Modulator 1 (ROMO1) as a novel regulator of mitochondrial fusion and cristae integrity. In the absence of ROMO1, the mitochondrial network fragments and cristae are lost. These defects lead to impaired mitochondrial respiration and sensitization to cytochrome c release and downstream apoptosis. ROMO1 is regulated by mitochondrial REDOX at 4 cysteine residues that couple REDOX signaling to mitochondrial morphology. We have characterized ROMO1 as an interactor with the MINOS complex, required for cristae junction maintenance, and the inner mitochondrial membrane fusion GTPase OPA1. Through these interactions ROMO1 couples cristae junction security to mitochondrial fusion.

L’ADOA-1 (Autosomal dominant optic atrophy) est une maladie neurologique pouvant être causée par la mutation de la protéine mitochondriale OPA1 (Optic atrophy type 1) et pouvant conduire à une cécité. Certains patients peuvent présenter un dysfonctionnement mitochondrial plus généralisé, et développer d'autres complications neuromusculaires (ADOA-1+). La protéine OPA1 est une dynamine GTPasique impliquée dans la dynamique mitochondriale en modulant la fusion des membranes internes, et plus largement dans le maintien des fonctions mitochondriales. Le rôle de cette protéine a été étudié dans beaucoup de types cellulaires, mais peu d’études se sont intéressées à la cellule cardiaque qui pourtant possède de nombreuses mitochondries.La 1ère question soulevée par cette thèse était de déterminer l’implication de la protéine OPA1 dans l’organisation du réseau mitochondrial et dans le fonctionnement de la cellule cardiaque en condition physiologique ou pathologique. Pour répondre à cela, nous avons utilisé un modèle murin hétérozygote pour Opa1 (Opa1+/-). Nous avons montré que dans le cardiomyocyte adulte, la diminution d’expression d’OPA1 induisait un déséquilibre de la balance fusion/fission, qui se traduisait par une désorganisation du réseau mitochondrial, ainsi qu’une altération de la morphologie des mitochondries. Cependant, ces modifications n’engendraient pas d’altération des capacités oxydatives des mitochondries, mais conduisaient à une perturbation des propriétés d’ouverture du PTP. En outre, la déficience en OPA1 n’influençait pas la fonction cardiaque en condition physiologique, mais était associée à son altération plus sévère en condition pathologique. La 2nde question de cette thèse était de savoir l’implication d’OPA1 dans la réponse à un stress physiologique des cellules musculaires squelettiques, et ainsi étudier le lien éventuel entre OPA1 et la mise en place de la biogénèse mitochondriale. Nous avons donc soumis nos souris Opa1+/- à un exercice d’endurance. Nos résultats ont révélé que nos deux groupes d’animaux disposaient des mêmes capacités physiques à l’entraînement. L’adaptation des souris Opa1+/- à l’entrainement s’effectuait par un remodelage métabolique, vraisemblablement pour contrer un défaut d’adaptation de la biogénèse mitochondriale. En conclusion, nos résultats ont permis de mieux définir le rôle de la protéine OPA1 dans les muscles striés et son implication dans l’adaptation à un stress. Ce travail nous ouvre des perspectives sur le rôle de la dynamique mitochondriale dans l’adaptation à un stress. / ADOA-1 (Autosomal dominant optic atrophy) is a neurological disease that can be caused by mutations in mitochondrial protein OPA1 (Optic atrophy type 1) and can lead to blindness. Some patients with OPA1 mutations may have a generalized mitochondrial dysfunction, and may develop additional neuromuscular complications (ADOA-1+). OPA1 protein is a GTPase dynamin involved in mitochondrial dynamics by controlling the fusion of inner membranes, and also in the maintenance of mitochondrial functions. The role of this protein has been studied in many cell types, but only few studies have been done on cardiac cell, which nevertheless has many mitochondria.The first question raised by this thesis was to determine the involvement of OPA1 protein in mitochondrial network organization and the functioning of the cardiac cell in physiological or pathological condition. To answer this, we used a mouse model heterozygous for Opa1 (Opa1+/-). We have shown that in adult cardiomyocytes, a decrease expression of OPA1 induces an imbalance fusion/fission, which results in a disruption of mitochondrial network, as well as alteration of the morphology of mitochondria. However, these changes did not alter oxidative capacities, but leads to a disturbance of PTP opening. Additionally, OPA1 deficiency did not affect cardiac function under physiological conditions, but it is associated with a stronger impairment of cardiac function in pathological condition.The 2nd part of this thesis was to determine the involvement of OPA1 in response to physiological stress in cells of skeletal muscle, and thus to study the possible link between OPA1 and mitochondrial biogenesis activation. For this, we submitted our Opa1+/- mice to an exercise training. Our results showed that both groups of animals were able to perform the same physical activity. The adaptation of Opa1+/- mice to training did not involve mitochondrial biogenesis and led to a specific response involving a metabolic remodelling towards higher fatty acids utilization.In conclusion, our results allowed us a better understanding of OPA1 role in striated muscle and its involvement for adaptation to a stress. This work opens new perspectives on the role of mitochondrial dynamics in cardiac and muscle cells and during adaptation to a stress

Les jeunes oiseaux exposés au froid assurent leur homéothermie en stimulant les oxydations mitochondriales dans les muscles squelettiques. L’exposition prolongée au froid accroit les capacités de thermogenèse musculaire grâce à une plasticité bioénergétique mitochondriale dont le contrôle reste hypothétique. Chez les mammifères, des protéines de fusion (les mitofusines (Mfns) et OPA1(OPtic Atrophy 1)) participent au remaniement des réseaux dynamiques mitochondriaux dans de multiples types cellulaires. Le but de ce travail de thèse était de caractériser l’expression d’homologues aviaires des protéines de fusion mammaliennes et d’étudier leurs variations d’expression lors de la mise en place des processus bioénergétiques chez l’oiseau en croissance, lors d’une exposition aiguë ou prolongée au froid ou lors de challenges nutritionnels ou endocrines.Sur le plan méthodologique, une approche intégrative a été utilisée de l’animal entier (calorimétrie indirecte) à l’expression protéique (western blot) ou transcriptionnelle (RT-PCR) en passant par des mesures de la fonctionnalité bioénergétique sur des fibres musculaires perméabilisées et mitochondries isolées. Deux modèles animaux ont été utilisés, une espèce naturellement adaptée aux conditions extrêmes de l’Antarctique, le manchot Adélie (Pygoscelisadeliae), et un modèle de laboratoire, le canard de Barbarie (Cairina moschata). Nos résultats ont permis de caractériser chez l’oiseau l’expression de protéines de fusion (Mfn2, OPA1) immunoréactives homologues à celles des mammifères. Le séquençage d’une partie de la séquence codante des gènes codant les Mfns a montré une bonne similitude entre les espècesd’oiseaux et les mammifères. Chez le manchot, l’abondance relative de ces protéines dans lesmitochondries musculaires variait avec la croissance et l’exposition thermique en corrélation positiveavec les capacités bioénergétiques musculaires. Chez le canard, l’activité respiratoire et l’abondance relative de ces protéines étaient également corrélées suite à un jeûne de 60h ou, bien que dans une moindre mesure, après altération pharmacologique du statut thyroïdien.Ces résultats montrent pour la première fois chez l’oiseau l’expression de protéines homologues aux protéines de fusion des mammifères. L’association entre les variations d’expression de ces protéines et les modifications bioénergétiques du muscle squelettique indiquent qu’elles pourraient contribuer à la plasticité bioénergétique observée chez l’oiseau en croissance. Ces résultats suggèrent que des modifications potentielles de l’organisation des réseaux mitochondriaux musculaires pourraient contribuer aux réponses adaptatives des organismes face aux contraintes environnementales. / Cold-exposed young birds maintain their homeothermy by stimulating mitochondrial oxidations in skeletal muscle. Prolonged cold exposure enhances muscle thermogenic capacities through mitochondrial bioenergetics plasticity which control still remains hypothetical. In mammals, fusion proteins (mitofusins (Mfns) and OPA1 (Optic Atrophy 1)) contribute to the permanent and dynamic changes in mitochondrial networks in multiple cell types. The aim of our work was to characterize the expression of avian homologues of mammalian fusion proteins and to study the variations of their expression during the establishment of bioenergetics processes in growing birds, during an acute or a prolonged cold exposure and finally during nutritional or endocrine challenges. Methodologically, an integrative approach has been used from whole animal (indirect calorimetry) to protein (western-blot) or gene (RT-PCR) expression through measurements of the bioenergetics functionality of permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria. Two animal models were used, a species naturally adapted to Antarctica harsh conditions, the Adélie penguin (Pygoscelis adeliae), and a laboratory model, the Muscovy duck (Cairina moschata).Our results allowed us to characterize, in birds, the expression of immunoreactive fusion proteins (Mfn2, OPA1) which were homologous to those of mammals. The sequencing of a part of the coding sequence of Mfns genes showed a great similitude between avian and mammalian species. In penguins, the relative abundance of these proteins in muscle mitochondria was modified by growth in the cold and was positively correlated with muscle bioenergetics capacities. In ducks, the respiratory activity and the relative abundance of these proteins were also correlated after a 60h fasting period or,though a lesser extent, after a pharmacological alteration of thyroid status. Our results show, for the first time in birds, the expression of proteins homologous to mammalian fusion proteins. The association between the changes in expression of these proteins and the bioenergetics modifications in skeletal muscle indicates that these proteins could contribute to thebioenergetics plasticity observed in growing chicks. These results suggest that potential modifications of the muscle mitochondrial network organization could play a role in the adaptive responses of organisms to the environmental constraints.

During aging there is a decline in (MuSCs) and muscle regeneration, though the underlying reason is unknown. Interestingly, mitochondrial fragmentation is a common feature in aging, however, how this impacts MuSC function and maintenance has not been investigated. To address the effect of mitochondrial fragmentation in MuSCs, we generated a knockout mouse model using the Pax7CreERT2 inducible system to target deletion of the mitochondrial fusion protein Opa1 specifically within MuSCs (Opa1-KO). Analysis of MuSC function following muscle injury revealed a defect in the regenerative potential of Opa1-KO MuSCs. Moreover, following injury there was a substantial decrease in the number of MuSC in Opa1-KO animals with a concomitant increase in the number of committing cells, illustrating that loss of Opa1 drives MuSC towards commitment at the expense of self-renewal. Furthermore, loss of Opa1 in MuSCs alters the quiescence state, priming MuSCs for activation, as indicated by a reduction in quiescence-related genes, increased EdU incorporation, and enhanced cell cycle kinetics. To address the impact of mitochondrial dysfunction on muscle stem cell capacity, we generated a model of chronic Opa1 loss. Analysis of muscle stem cell function 3 months after Opa1 ablation revealed mitochondrial dysfunction and a defect in proliferation upon activation, leading to failed muscle regeneration. These data are the first to demonstrate a novel role for mitochondrial structure in the regulation of MuSC maintenance and regenerative capacity.

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Les mitochondries sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que le catabolisme des nutriments, la phosphorylation oxydative, l'apoptose et la régulation des flux calciques. Elles ont une structure dynamique, qui s'adapte en permanence aux besoins cellulaires, et sont sous le contrôle de réseaux de régulation coordonnant leur masse, leur structure et leurs fonctions. Le protéome mitochondrial est ainsi composé d'une très grande diversité de protéines qui dérive en partie de l'ancêtre procaryote des mitochondries et résulte majoritairement d'une information codée par le génome nucléaire, mais aussi d'une information plus restreinte portée par le génome mitochondrial. Sept cents protéines mitochondriales ont été caractérisées chez l'homme, grâce à diverses approches de protéomique, de génomique et de bio-informatique, mais il est probable que les mitochondries en comportent un nombre bien supérieur. La caractérisation de ces protéines est essentielle à la compréhension des nombreuses maladies génétiques et communes associées à des dysfonctionnements mitochondriaux. Au cours de ce travail de thèse nous avons comparé in silico les séquences des protéines mitochondriales humaines avec celles des procaryotes, mettant en évidence que les protéines impliquées dans les pathologies sont majoritairement homologues à des protéines procaryotes. Nous avons ensuite développé une stratégie de recherche bio-informatique de nouvelles protéines mitochondriales basée sur leur origine procaryote et la présence d'une extension N-terminale caractéristique. L'ensemble des protéomes procaryotes connus a été comparé au génome humain et différents outils de filtrage ont été développés pour identifier de nouvelles protéines. Parallèlement à cette stratégie globale de criblage, nous nous sommes focalisés sur l'étude d'une des protéines participant à la fusion mitochondriale qui est associée à l'atrophie optique autosomique dominante, la protéine Opa1. Cette dynamine GTPase est impliquée dans le remodelage de la membrane interne mitochondriale, l'apoptose, la maintenance de l'ADN mitochondrial et le métabolisme énergétique. Nous avons développé une base de données internationale répertoriant les différents variants affectant Opa1 afin de caractériser son spectre mutationnel. Cet outil a secondairement servi à une étude clinique multicentrique portant sur près de mille patients porteurs d'une neuropathie optique. À travers ces deux approches, nous avons pu développer de nouveaux outils bio-informatiques qui devraient contribuer à une meilleure compréhension de la physiopathologie mitochondriale.

L'atrophie optique autosomique dominante (ADOA) et la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A) sont deux neuropathies héréditaires respectivement liées aux mutations des gènes OPA1 et MFN2. Les protéines OPA1 et MFN2 sont impliquées dans la dynamique de fusion des mitochondries. Ces organites intracellulaires sont essentiels dans les processus de synthèse d'ATP. L'hypothèse d'un déficit énergétique impliqué dans la physiopathologie de ces neuropathies devait alors être testée. Nous avons mis en évidence une baisse d'efficacité des phosphorylations oxydatives dans les fibroblastes de peau de patients atteints d'ADOA et de CMT2A. Ce découplage est associé à une baisse d'activité du complexe IV et à une augmentation de l'activité du complexe V dans le cas de l'ADOA. Dans le cas de la CMT2A, le découplage est associé à une augmentation de l'activité et de la quantité de la translocase des nucléotides adényliques (ANT). Une étude sur mitochondries isolées de cerveaux d'un modèle murin MFN2(R94Q) de CMT2A montre une baisse d'activité des complexes II et V associée à l'ouverture du canal mitochondrial potassique sensible à l'ATP (mKATP). Nos résultats montrent qu'OPA1 et MFN2, deux protéines de la dynamique mitochondriale ont un rôle majeur dans la régulation énergétique mitochondriale.

L'ADOA-1 (Autosomal dominant optic atrophy) est une maladie neurologique pouvant être causée par la mutation de la protéine mitochondriale OPA1 (Optic atrophy type 1) et pouvant conduire à une cécité. Certains patients peuvent présenter un dysfonctionnement mitochondrial plus généralisé, et développer d'autres complications neuromusculaires (ADOA-1+). La protéine OPA1 est une dynamine GTPasique impliquée dans la dynamique mitochondriale en modulant la fusion des membranes internes, et plus largement dans le maintien des fonctions mitochondriales. Le rôle de cette protéine a été étudié dans beaucoup de types cellulaires, mais peu d'études se sont intéressées à la cellule cardiaque qui pourtant possède de nombreuses mitochondries.La 1ère question soulevée par cette thèse était de déterminer l'implication de la protéine OPA1 dans l'organisation du réseau mitochondrial et dans le fonctionnement de la cellule cardiaque en condition physiologique ou pathologique. Pour répondre à cela, nous avons utilisé un modèle murin hétérozygote pour Opa1 (Opa1+/-). Nous avons montré que dans le cardiomyocyte adulte, la diminution d'expression d'OPA1 induisait un déséquilibre de la balance fusion/fission, qui se traduisait par une désorganisation du réseau mitochondrial, ainsi qu'une altération de la morphologie des mitochondries. Cependant, ces modifications n'engendraient pas d'altération des capacités oxydatives des mitochondries, mais conduisaient à une perturbation des propriétés d'ouverture du PTP. En outre, la déficience en OPA1 n'influençait pas la fonction cardiaque en condition physiologique, mais était associée à son altération plus sévère en condition pathologique. La 2nde question de cette thèse était de savoir l'implication d'OPA1 dans la réponse à un stress physiologique des cellules musculaires squelettiques, et ainsi étudier le lien éventuel entre OPA1 et la mise en place de la biogénèse mitochondriale. Nous avons donc soumis nos souris Opa1+/- à un exercice d'endurance. Nos résultats ont révélé que nos deux groupes d'animaux disposaient des mêmes capacités physiques à l'entraînement. L'adaptation des souris Opa1+/- à l'entrainement s'effectuait par un remodelage métabolique, vraisemblablement pour contrer un défaut d'adaptation de la biogénèse mitochondriale. En conclusion, nos résultats ont permis de mieux définir le rôle de la protéine OPA1 dans les muscles striés et son implication dans l'adaptation à un stress. Ce travail nous ouvre des perspectives sur le rôle de la dynamique mitochondriale dans l'adaptation à un stress.

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