Actuellement, il existe une forte demande de Headstage et de microsystèmes intégrés implantables pour étudier l’activité cérébrale de souris de laboratoire en mouvement libre. De tels dispositifs peuvent s’interfacer avec le système nerveux central dans les paradigmes électriques et optiques pour stimuler et surveiller les circuits neuronaux, ce qui est essentiel pour découvrir de nouveaux médicaments et thérapies contre des troubles neurologiques comme l’épilepsie, la dépression et la maladie de Parkinson. Puisque les systèmes implantables ne peuvent pas utiliser une batterie ayant une grande capacité en tant que source d’énergie primaire dans des expériences à long terme, la consommation d’énergie du dispositif implantable est l’un des principaux défis de ces conceptions. La première partie de cette recherche comprend notre proposition de la solution pour diminuer la consommation d’énergie des microcircuits implantables. Nous proposons un nouveau circuit de décalage de niveau qui convertit les niveaux de signaux sub-seuils en niveaux ultra-bas à haute vitesse en utilisant une très faible puissance et une petite zone de silicium, ce qui le rend idéal pour les applications de faible puissance. Le circuit proposé introduit une nouvelle topologie de décaleur de niveau de tension utilisant un condensateur de décalage de niveau pour augmenter la plage de tensions de conversion, tout en réduisant considérablement le retard de conversion. Le circuit proposé atteint un délai de propagation plus court et une zone de silicium plus petite pour une fréquence de fonctionnement et une consommation d’énergie donnée par rapport à d’autres solutions de circuit. Les résultats de mesure sont présentés pour le circuit proposé fabriqué dans un processus CMOS TSMC de 0,18- mm. Le circuit présenté peut convertir une large gamme de tensions d’entrée de 330 mV à 1,8 V et fonctionner sur une plage de fréquence de 100 Hz à 100 MHz. Il a un délai de propagation de 29 ns et une consommation d’énergie de 61,5 nW pour les signaux d’entrée de 0,4 V, à une fréquence de 500 kHz, surpassant les conceptions précédentes. La deuxième partie de cette recherche comprend nos systèmes de transfert d’énergie sans fil proposé pour les applications optogénétiques. L’optogénétique est la combinaison de la méthode génétique et optique d’excitation, d’enregistrement et de contrôle des neurones biologiques. Ce système combine plusieurs technologies telles que les MEMS et la microélectronique pour collecter et transmettre les signaux neuronaux et activer un stimulateur optique via une liaison sans fil. Puisque les stimulateurs optiques consomment plus de puissance que les stimulateurs électriques, l’interface utilise la transmission de puissance par induction en utilisant des moyens innovants au lieu de la batterie avec la petite capacité comme source d’énergie. / Notre première contribution dans la deuxième partie fournit un système de cage domestique intelligent basé sur des barrettes multi-bobines superposées à travers un récepteur multicellulaire implantable mince de taille 1×1 cm2, implanté sous le cuir chevelu d’une souris de laboratoire, et unité de gestion de l’alimentation intégrée. Ce système inductif est conçu pour fournir jusqu’à 35,5 mW de puissance délivrée à un émetteur-récepteur full duplex de faible puissance entièrement intégré pour prendre en charge des implants neuronaux à haute densité et bidirectionnels. L’émetteur (TX) utilise une bande ultra-large à impulsions radio basée sur des approches de combinaison, et le récepteur (RX) utilise une topologie à bande étroite à incrémentation de 2,4 GHz. L’émetteur-récepteur proposé fournit un débit de données de liaison montante TX à 500 Mbits/s double et un débit de données de liaison descendante RX à 100 Mbits/s, et est entièrement intégré dans un processus CMOS TSMC de 0,18-mm d’une taille totale de 0,8 mm2 . La puissance peut être délivrée à partir d’un signal de porteuse de 13,56-MHz avec une efficacité globale de transfert de puissance supérieure à 5% sur une distance de séparation allant de 3 cm à 5 cm. Notre deuxième contribution dans les systèmes de collecte d’énergie porte sur la conception et la mise en oeuvre d’une cage domestique de transmission de puissance sans fil (WPT) pour une plate-forme de neurosciences entièrement sans fil afin de permettre des expériences optogénétiques ininterrompues avec des rongeurs de laboratoire vivants. La cage domestique WPT utilise un nouveau réseau hybride de transmetteurs de puissance (TX) et des résonateurs multi-bobines segmentés pour atteindre une efficacité de transmission de puissance élevée (PTE) et délivrer une puissance élevée sur des distances aussi élevées que 20 cm. Le récepteur de puissance à bobines multiples (RX) utilise une bobine RX d’un diamètre de 1 cm et une bobine de résonateur d’un diamètre de 1,5 cm. L’efficacité moyenne du transfert de puissance WPT est de 29, 4%, à une distance nominale de 7 cm, pour une fréquence porteuse de 13,56 MHz. Il a des PTE maximum et minimum de 50% et 12% le long de l’axe Z et peut délivrer une puissance constante de 74 mW pour alimenter le headstage neuronal miniature. En outre, un dispositif implantable intégré dans un processus CMOS TSMC de 0,18-mm a été conçu et introduit qui comprend 64 canaux d’enregistrement, 16 canaux de stimulation optique, capteur de température, émetteur-récepteur et unité de gestion de l’alimentation (PMU). Ce circuit est alimenté à l’intérieur de la cage du WPT à l’aide d’une bobine réceptrice d’un diamètre de 1,5 cm pour montrer les performances du circuit PMU. Deux tensions régulées de 1,8 V et 1 V fournissent 79 mW de puissance pour tout le système sur une puce. Notre dernière contribution est un système WPT insensible aux désalignements angulaires pour alimenter un headstage pour des applications optogénétiques qui a été précédemment proposé par le Laboratoire de Microsystèmes Biomédicaux (BioML-UL) à ULAVAL. Ce système est la version étendue de notre deuxième contribution aux systèmes de collecte d’énergie.Dans la version mise à jour, un récepteur de puissance multi-bobines utilise une bobine RX d’un diamètre de 1,0 cm et une nouvelle bobine de résonateur fendu d’un diamètre de 1,5 cm, qui résiste aux défauts d’alignement angulaires. Dans cette version qui utilise une cage d’animal plus petite que la dernière version, 4 résonateurs sont utilisés côté TX. De plus, grâce à la forme et à la position de la bobine de répéteur L3 du côté du récepteur, la liaison résonnante hybride présentée peut correctement alimenter la tête sans interruption causée par le désalignement angulaire dans toute la cage de la maison. Chaque 3 tours du répéteur RX a été enveloppé avec un diamètre de 1,5 cm, sous différents angles par rapport à la bobine réceptrice. Les résultats de mesure montrent un PTE maximum et minimum de 53 % et 15 %. La méthode proposée peut fournir une puissance constante de 82 mW pour alimenter le petit headstage neural pour les applications optogénétiques. De plus, dans cette version, la performance du système est démontrée dans une expérience in-vivo avec une souris ChR2 en mouvement libre qui est la première expérience optogénétique sans fil et sans batterie rapportée avec enregistrement électrophysiologique simultané et stimulation optogénétique. L’activité électrophysiologique a été enregistrée après une stimulation optogénétique dans le Cortex Cingulaire Antérieur (CAC) de la souris. / Our first contribution in the second part provides a smart home-cage system based on overlapped multi-coil arrays through a thin implantable multi-coil receiver of 1×1 cm2 of size, implantable bellow the scalp of a laboratory mouse, and integrated power management circuits. This inductive system is designed to deliver up to 35.5 mW of power delivered to a fully-integrated, low-power full-duplex transceiver to support high-density and bidirectional neural implants. The transmitter (TX) uses impulse radio ultra-wideband based on an edge combining approach, and the receiver (RX) uses a 2.4- GHz on-off keying narrow band topology. The proposed transceiver provides dual-band 500-Mbps TX uplink data rate and 100-Mbps RX downlink data rate, and it is fully integrated into 0.18-mm TSMC CMOS process within a total size of 0.8 mm2. The power can be delivered from a 13.56-MHz carrier signal with an overall power transfer efficiency above 5% across a separation distance ranging from 3 cm to 5 cm. Our second contribution in power-harvesting systems deals with designing and implementation of a WPT home-cage for a fully wireless neuroscience platform for enabling uninterrupted optogenetic experiments with live laboratory rodents. The WPT home-cage uses a new hybrid parallel power transmitter (TX) coil array and segmented multi-coil resonators to achieve high power transmission efficiency (PTE) and deliver high power across distances as high as 20 cm. The multi-coil power receiver (RX) uses an RX coil with a diameter of 1 cm and a resonator coil with a diameter of 1.5 cm. The WPT home-cage average power transfer efficiency is 29.4%, at a nominal distance of 7 cm, for a power carrier frequency of 13.56-MHz. It has maximum and minimum PTE of 50% and 12% along the Z axis and can deliver a constant power of 74 mW to supply the miniature neural headstage. Also, an implantable device integrated into a 0.18-mm TSMC CMOS process has been designed and introduced which includes 64 recording channels, 16 optical stimulation channels, temperature sensor, transceiver, and power management unit (PMU). This circuit powered up inside the WPT home-cage using receiver coil with a diameter of 1.5 cm to show the performance of the PMU circuit. Two regulated voltages of 1.8 V and 1 V provide 79 mW of power for all the system on a chip. Our last contribution is an angular misalignment insensitive WPT system to power up a headstage which has been previously proposed by the Biomedical Microsystems Laboratory (BioML-UL) at ULAVAL for optogenetic applications. This system is the extended version of our second contribution in power-harvesting systems. In the updated version a multi-coil power receiver uses an RX coil with a diameter of 1.0 cm and a new split resonator coil with a diameter of 1.5 cm, which is robust against angular misalignment. In this version which is using a smaller animal home-cage than the last version, 4 resonators are used on the TX side. Also, thanks to the shape and position of the repeater coil of L3 on the receiver side, the presented hybrid resonant link can properly power up the headstage without interruption caused by the angular misalignment all over the home-cage. Each 3 turns of the RX repeater has been wrapped up with a diameter of 1.5 cm, in different angles compared to the receiver coil. Measurement results show a maximum and minimum PTE of 53 % and 15 %. The proposed method can deliver a constant power of 82 mW to supply the small neural headstage for the optogenetic applications. Additionally, in this version, the performance of the system is demonstrated within an in-vivo experiment with a freely moving ChR2 mouse which is the first fully wireless and batteryless optogenetic experiment reported with simultaneous electrophysiological recording and optogenetic stimulation. Electrophysiological activity was recorded after delivering optogenetic stimulation in the Anterior Cingulate Cortex (ACC) of the mouse. / Currently, there is a high demand for Headstage and implantable integrated microsystems to study the brain activity of freely moving laboratory mice. Such devices can interface with the central nervous system in both electrical and optical paradigms for stimulating and monitoring neural circuits, which is critical to discover new drugs and therapies against neurological disorders like epilepsy, depression, and Parkinson’s disease. Since the implantable systems cannot use a battery with a large capacity as a primary source of energy in long-term experiments, the power consumption of the implantable device is one of the leading challenges of these designs. The first part of this research includes our proposed solution for decreasing the power consumption of the implantable microcircuits. We propose a novel level shifter circuit which converting subthreshold signal levels to super-threshold signal levels at high-speed using ultra low power and a small silicon area, making it well-suited for low-power applications such as wireless sensor networks and implantable medical devices. The proposed circuit introduces a new voltage level shifter topology employing a level-shifting capacitor to increase the range of conversion voltages, while significantly reducing the conversion delay. The proposed circuit achieves a shorter propagation delay and a smaller silicon area for a given operating frequency and power consumption compared to other circuit solutions. Measurement results are presented for the proposed circuit fabricated in a 0.18-mm TSMC CMOS process. The presented circuit can convert a wide range of the input voltages from 330 mV to 1.8 V, and operate over a frequency range of 100-Hz to 100-MHz. It has a propagation delay of 29 ns, and power consumption of 61.5 nW for input signals 0.4 V, at a frequency of 500-kHz, outperforming previous designs. The second part of this research includes our proposed wireless power transfer systems for optogenetic applications. Optogenetics is the combination of the genetic and optical method of excitation, recording, and control of the biological neurons. This system combines multiple technologies such as MEMS and microelectronics to collect and transmit the neuronal signals and to activate an optical stimulator through a wireless link. Since optical stimulators consume more power than electrical stimulators, the interface employs induction power transmission using innovative means instead of the battery with the small capacity as a power source.

L’optogénétique est une technique prometteuse pour la modulation de l’activité neuronale. Par l’insertion d’une opsine microbienne dans la membrane plasmique de neurones et par son activation photonique, il devient possible de réguler l’activité neuronale avec une grande résolution temporelle et spatiale. Beaucoup de travaux ont été faits pour caractériser et synthétiser de nouvelles opsines. Ainsi, plusieurs variétés d’opsines sont désormais disponibles, chacune présentant des cinétiques et sensibilités à des longueurs d’onde différentes. En effet, il existe des constructions optogénétiques permettant de moduler à la hausse ou à la baisse l’activité neuronale, telles la channelrhodopsine-2 (ChR2) ou la halorhodopsine (NpHR), respectivement. Les promesses de cette technologie incluent le potentiel de stimuler une région restreinte du cerveau, et ce, de façon réversible. Toutefois, peu d’applications en ce sens ont été réalisées, cette technique étant limitée par l’absorption et la diffusion de la lumière dans les tissus. Ce mémoire présente la conception d’une fibre optique illuminant à un angle de 90° à sa sortie, capable de guider la lumière à des structures bien précises dans le système nerveux central. Nous avons conduit des tests in vivo dans le système visuel de souris transgéniques exprimant la ChR2 dans l’ensemble du système nerveux central. Dans le système visuel, les signaux rétiniens sont conduits au corps genouillé latéral (CGL) avant d’être relayés au cortex visuel primaire (V1). Pour valider la capacité de mon montage optogénétique à stimuler spécifiquement une sous-population de neurones, nous avons tiré profit de l’organisation rétinotopique existant dans le système visuel. En stimulant optogénétiquement le CGL et en tournant la fibre optique sur elle-même à l’aide d’un moteur, il devient possible de stimuler séquentiellement différentes portions de cette structure thalamique et conséquemment, différentes représentations du champ visuel. L’activation des projections thalamiques sera enregistrée au niveau de l’aire V1 à l’aide de l’imagerie optique intrinsèque, une technique qui permet d’imager les variations de la concentration d’oxygène et du volume sanguin dans le tissu neuronal, sur une grande surface corticale. Comme l’organisation rétinotopique est maintenue au niveau de l’aire V1, l’espace activé au niveau du cortex révèlera l’étendue spatiale de notre stimulation optogénétique du CGL. Les expériences in vivo démontrèrent qu’en déplaçant la fibre optique dans le CGL, il nous était possible de stimuler différents sous- ensembles de neurones dans cette structure thalamique. En conclusion, cette étude montre notre capacité à développer un système à base de fibre optique capable de stimuler optogénétiquement une population de neurone avec une grande précision spatiale. / Optogentics is a promising technic for neuronal activity modulation. By inserting a microbial opsin in the plasma membrane and by its photonic activation, it is possible to regulate neuronal activity with high temporal and spatial resolution. A lot of work has been done to characterize and synthetize new opsins. Thus, a wide variety of opsins are now available, presenting different kinetics and sensibility to specific wavelengths. Indeed, different opsins can either increase or decrease neuronal activity such as channelrhodopsin-2 (ChR2) or halorhodopsin (NpHR), respectively. This technology has the potential to stimulate a specific region within the brain in a highly reversible manner. However, little work was accomplished in this way, because to limitations due to absorption and scattering of light in biological tissue. This master’s thesis presents the conception of a side-firing optical fiber, capable of guiding light to specific structures within the brain. We conducted in vivo experiments in the visual system of transgenic mice expressing ChR2 in the entire central nervous system. In the visual system, retinal inputs are relayed to the lateral geniculate nucleus (LGN) before reaching the primary visual cortex (V1). To validate the capacity of the designed optogenetic assembly to stimulate specific sub-populations of neurons, we took advantage of the retinotopic organization existing in the visual system. By optogenetically stimulating the LGN and rotating the optical fiber around its axis with a motor, it is possible to sequentially stimulate different portions of this thalamic structure and consequently, different portions of the visual field. Activation of thalamic projections will be recorded in area V1 using intrinsic optical imaging, a technic allowing to image variations of blood oxygenation and blood volume in neuronal tissue over large cortical areas. Activation at the level of the cortex will reveal the spatial extent of the optogenetic stimulation in the LGN as retinotopic organization is maintained in V1 cortical area. In vivo experiments showed that displacing the optical fiber in the LGN allowed stimulation of different neuronal populations within this thalamic structure. In conclusion, this study demonstrates our capacity to develop a fiber-based system capable of optogenetically stimulating neuronal tissue with high spatial precision.

Le réseau des ganglions de la base (GB) est un ensemble de structures sous corticales, dont la principale fonction est le contrôle du mouvement volontaire. Le Globus Pallidus (GP), équivalent du GPe chez le primate, est un noyau constitué exclusivement de neurones GABAergiques, qui joue un rôle clé dans le fonctionnement des GB de par ses projections inhibitrices diffuses sur l’ensemble des structures de ce macrocircuit. Bien qu’une diversité neuronale au sein du GP ait été suggérée sur les bases de l’origine embryonnaire, de l’expression de protéines spécifiques ou encore de l’activité électrique des neurones, ces différents paramètres n’ont pas été corrélés de manière claire. Notre premier objectif a donc été de corréler les propriétés membranaires de neurones du GP enregistrés en patch-clamp sur des tranches de cerveau de rat avec l’expression spécifique de deux marqueurs neuronaux : une protéine liant le calcium, la parvalbumine (PV) ou un facteur de transcription, Forkhead Box 2 (FoxP2). Nous avons observé des différences électrophysiologiques significatives entre les neurones PV-positifs et FoxP2-positifs. Ce résultat nous a amené à formuler l’hypothèse qu’ayant des propriétés distinctes, les neurones PV-positifs et FoxP2-positifs pouvaient être connectés de manière différente au sein du réseau des ganglions de la base. Nous avons donc réalisé des expériences de traçage neuronal in vivo afin d’identifier les structures cibles de chaque sous-population. Nous montrons que les neurones PV-positifs projettent sur les structures de sortie des ganglions de la base tandis que les neurones FoxP2-positifs projettent uniquement sur le striatum. Enfin, le GP étant majoritairement composé de neurones PV-positifs, nous avons décidé de manipuler spécifiquement l’activité électrique de cette population in vitro et in vivo grâce à l’optogénétique. Nous présentons des résultats montrant que la modulation de l’activité électrique des neurones PV-positifs modifie le comportement moteur chez l’animal vigile. Nos résultats d’immunohistochimie et d’électrophysiologie in vitro démontrent pour la première fois l’existence d’une diversité neuronale au sein du GP. Nos expériences constituent la première étude du rôle des neurones PV-positifs dans le contrôle du mouvement volontaire. / Globus Pallidus (GP in Rodents; GPe in Primates) which belongs to the indirect pathway of basal ganglia is often, if not always, considered as an homogeneous entity which simply relays striatal information through the subthalamic nucleus, downstream to the output of basal ganglia, the substantia nigra pars reticulata. Prototypical GP neurons are often described as fast-spiking GABAergic cells which express parvalbumin (PV) as a neurochemical marker. However, cellular heterogeneity in GP has been suggested by anatomical, neurochemical, fate mapping analysis and electrophysiological activity in vivo but a clear demonstration of the existence of distinct cell types in GP, which requires by definition correlation of electrophysiological activity with neurochemistry and structure, is still missing. The objective of my PhD was i) to determine if the expression of specific neuronal markers in GP neurons is correlated with specific electrophysiological properties, ii) to understand the function of identified cell types in motor control, in order to prove that neuronal diversity exists and matters in GP. We show that electrical activity and repertoire of ionic channels differ in PV-positive and FoxP2-positive neurons. We demonstrate that PV-positive neurons do project on downstream structures whereas FoxP2-positive neurons exclusively target striatum. We report that manipulating PV-positive neurons using optogenetics induce changes in motor behavior. Thus, our results contribute to highlight the function of GP in motor control.

Le maintien de la PCO2 et du pH du sang artériel est vital. Le principal mécanisme de cette régulation, chez les mammifères, est le chémoréflexe respiratoire central au CO2, une hyperventilation en réponse à l’hypercapnie, dont les bases neurales sont l’enjeu d’un débat persistant. Notre travail s’intéresse aux rôles supposés d’un groupe d’interneurones du niveau facial du tronc cérébral, le « noyau rétrotrapézoïde », dans le chémoréflexe au CO2 et l’accélération du rythme respiratoire autour de la naissance. Notre approche est inspirée par la symptomatologie respiratoire du syndrome d’Ondine ou CCHS (apnées et abrogation du chémoréflexe) et son gène causal, codant le facteur de transcription Phox2b, exprimé par les neurones du RTN. Nous avons disséqué le rôle du RTN dans le chémoréflexe central en étudiant les propriétés anatomiques et fonctionnelles in vitro chez l’embryon, et in vivo chez l’animal postnatal, de modèles murins - perte et gain de fonction –ciblant le RTN de la manière la plus sélective possible par génétique intersectionnelle. Ces modèles sont basés (i) sur l’historique d’expression des facteurs de transcription Phox2b, Lbx1, Atoh1 spécifiant les neurones du RTN au cours du développement et (ii) sur la transposition, chez la souris, de mutations humaines, Phox2b27Ala/+ et Lbx1fs/fs affectant ces facteurs, et qui sont respectivement, diagnostique, et proposé comme telle, du CCHS. L’ensemble des mutants étudiés récapitulent chez la souris, des traits phénotypiques exclusifs chez l’embryon et à la naissance: l’abrogation anatomique du RTN, le ralentissement du rythme respiratoire et la perte complète du chémoréflexe. Nos travaux montrent donc que le RTN est un composant obligatoire du circuit chémoréflexe. Nous montrons de plus, que le chémoréflexe n’est pas requis pour la survie des souriceaux à la naissance, cette dernière pourrait être liée au déficit conjoint d’une autre structure de même identité que le RTN, son homologue segmentaire au niveau trigéminal du tronc cérébral: le groupe péri-trigéminal. / The maintenance of PCO2 and pH in arterial blood is vital. The principal mechanism through which this is achieved in mammals is the respiratory chemoreflex, a hyperventilation response to hypercapnia, whose circuitry is still elusive and the matter of a persistent debate. Our work deals with the putative roles of a group of interneurons at facial level of the brainstem, the “retrotrapezoïd nucleus”, in the CO2 chemoreflex and in the acceleration of breathing around birth. Our approach is inspired by the respiratory symptoms of Ondine’s curse or CCHS (apneas and abrogation of the chemoreflex) and its causal gene, encoding the transcription facteur Phox2b, expressed in RTN neurons. We have dissected the role of the RTN by studying the anatomical and functional properties in vitro in embryos and in vivo at birth and postnatally, of gain and loss of function mutant mouse models, as selective as possible towards the RTN through intersectional strategies. Our models are based (i) on the history of expression of the transcription factors Phox2b, Lbx1, Atoh1 that specify RTN neurons during development and (ii) on the transfer into the mouse of the human mutations Phox2b27Ala/+ and Lbx1fs/fs that target these factors and are respectively diagnostic and candidate diagnostic for CCHS. Compoundly, the mutants recapitulate exclusive phenotypic traits in the embryo and at birth: anatomical abrogation of the RTN, a slowed down respiratory rhythm and the complete loss of chemoreflex. Our work demonstrates that the RTN is an obligatory component of the chemoreflex circuit. Furthermore, we show that the chemoreflex is not required for survival at birth and that the latter may be put at risk by the joint deficiency of another structure sharing the same molecular identity with the RTN, in fact its segmental homologue at trigeminal level of the brainstem: the peri-trigeminal group.

Ce travail s'inscrit dans l'étude du réseau neuronal responsable de l'activation corticale au cours du sommeil paradoxal (SP) chez le rongeur. Dans la première partie de ma thèse, j'ai participé à la démonstration que cette activation est limitée à quelques structures limbiques déterminantes pour l'apprentissage, dont le gyrus dentelé de l'hippocampe (GD). Nous avons ensuite montré que l'activation du GD en SP est due à une projection issue du noyau supramammillaire (Sum). J'ai ensuite montré en combinant l'hybridation in situ d'un marqueur des neurones glutamatergiques et GABAergiques et l'immunohistochimie du FOS que les neurones du Sum latéral actifs en SP sont à la fois glutamatergiques et GABAergiques (GLU/GABA). Enfin, j'ai montré que l'augmentation du nombre de neurones FOS+ dans le GD dorsal en SP est abolie après la lésion neurochimique du Sum. De plus, la lésion du Sum induit une nette réduction de la densité de fibres glutamatergiques dans le GD dorsal. Ces résultats indiquent que les neurones du GD dorsal sont activés en SP par les neurones GLU/GABA du Sum latéral. Le deuxième objectif de ma thèse a été de déterminer la fonction de cette voie en SP. Ainsi j'ai utilisé la technique d'optogénétique afin d'inactiver ou activer les fibres GLU/GABA provenant du Sum localisées dans le GD dorsal au cours du SP. Nos résultats montrent que l'activation de ces fibres en SP induit une augmentation de la fréquence et de la puissance du thêta enregistré dans le GD. Ces résultats indiquent que la voie Sum-GD dorsal contrôle le thêta hippocampique et soutiennent l'hypothèse d'un rôle de cette voie dans les processus de consolidation mnésique prenant place au cours du SP / During my PhD I studied the neuronal network responsible for cortical activation during paradoxical sleep (PS) in rodents. In the first part of my thesis, I participated to the demonstration that this activation is limited to a few limbic structures involved in learning, including the dentate gyrus of the hippocampus (DG). Then, we showed that the activation of DG during PS is due to a projection from the supramammillary nucleus (Sum). Besides, by combining the in situ hybridization of markers of GABAergic and glutamatergic neurons and FOS immunohistochemistry, I demonstrated that lateral Sum neurons active in SP are both glutamatergic and GABAergic (GLU/GABA). Finally, I showed that the increasing number of FOS+ neurons in the dorsal DG during PS is abolished by the neurochemical lesion of the Sum. In addition, the Sum lesion induces a clear reduction of the density of glutamatergic fibers in the dorsal DG. These results indicate that during PS, dorsal DG neurons are activated by GLU/GABA neurons located in the lateral Sum. The second aim of my thesis was to determine the function of this pathway during PS. To realize that, I inactivated or activated by optogenetics the Sum GLU/GABA fibers located in the dorsal GD during SP. Our results show that the activation of these fibers during SP induces an increase in the theta frequency and power recorded in the dorsal DG. These results indicate that the Sum-dorsal DG-pathway modulates the hippocampal theta and supports the hypothesis of a role of this pathway in the memory consolidation process during SP

Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont un ensemble de pathologies rétiniennes incurable provoquant la cécité. Les DRH sont caractérisées par le dysfonctionnement/dégénérescence des photorécepteurs et le remodelage de la structure de la rétine. Une des approches thérapeutiques envisagées pour traiter les DRH est la thérapie génique spécifique, c’est à dire le remplacement du gène défectueux par un gène sain. Cependant, bien qu’efficace, la thérapie génique spécifique n’est pas toujours applicable, en particulier quand la dégénérescence est trop avancée ou quand le gène muté n’est pas connu. Afin de traiter tous les cas de DRH quelle que soit leur origine génétique et leur stade de progression, une approche de thérapie génique d’addition est envisagée : Le transfert d’optogène. Cela consiste à convertir les cellules encore présentes dans la rétine malgré la dégénérescence, en cellule photosensible suite à l’expression d’un optogène (protéine photosensible). Mon projet de thèse a consisté dans un premier temps à évaluer le transfert de gène avec un vecteur AAV2/2 dans les cellules ganglionnaires rétiniennes de chien et de primate non-humain. Cette première partie a permis d’initier un second projet qui a eu pour objectif d’évaluer l’efficacité du transfert d’optogène (Channelrhodopsin-2) pour la restauration de la fonction visuelle dans un modèle canin de dystrophie rétinienne (le chien Rpe65- /-). / Inherited retinal dystrophies (IRD), a group of incurable retinal pathologies, are associated with visual impairments due to a malfunction and/or degeneration of photoreceptors and/or retinal pigment epithelium (RPE). Significant progress in the field of gene therapy has allowed the development and the characterization of an innovative tool to treat IRD patients: recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) that carry and deliver therapeutic nucleic acids. However, due to the heterogenic nature of IRD, gene supplementation will not allow to treat all forms of IRD because: (i) the numbers of mutated genes are unknown according to the state of art; (ii) the dominant forms of IRD in which mutations lead to negative effects are not eligible; (iii) the limit of AAV packaging excludes large-sized mutated genes and (iv) this approach is only applicable when photoreceptors are still alive. To treat all IRD patients, a novel therapeutic approach, independently of the mutated gene and the disease kinetic is suitable: the optogene transfer (light-sensitive protein) to restore photosensitivity in neurodegenerative retina by converting surviving retinal cells into photosensors. The primary goal of my research was to promote and characterize adeno-associated virus type 2-(AAV2) transduction in retinal ganglion cells of dog and non-human primate. A second aim was to investigate the feasibility of AAV2-mediated optogenes transfer in retinal ganglion cells as a therapeutic approach to restore visual function in RPE65 deficient dog, a canine model of IRDs.

On assiste à un essor spectaculaire des méthodes optiques pour suivre l’activité de populations neuronales in vivo. Ceci a permis de mettre en évidence des motifs remarquables d’organisation fonctionnelle à l’échelle mésoscopique impliqués dans de nombreuses fonctions cérébrales physiopathologiques. Cette thèse vise à mettre en place les outils permettant de disséquer les circuits sous-tendant ces motifs remarquables selon une approche expérimentale basée uniquement sur la microscopie optique. Plus particulièrement, ces outils ont été optimisés pour décrire la région CA1 de l’hippocampe adulte et le « barrel cortex » au cours du développement. En effet, deux motifs remarquables ont récemment été mis en évidence dans ces structures, les assemblées neuronales de CA1 adulte impliquées d’une part dans des processus de mémorisation et les neurones Hubs du cortex en développement et d’autre part participant au développement postnatal des circuits neuronaux. Dans ce contexte, nous avons développé un nouveau paradigme expérimental combinant imagerie calcique biphotonique in vivo, photostimulation par illumination holographique et analyse mathématique. Nous avons optimisé le choix et la co-expression de la sonde calcique et de l’opsine dans nos conditions expérimentales, et calibré leur utilisation dans les neurones de différentes structures cérébrales. De plus, nous avons conçu et assemblé un nouveau microscope à deux voies d’excitation, une pour l’imagerie calcique et l’autre pour la photostimulation holographique in vivo. Cette nouvelle approche expérimentale est en cours de validation sur les neurones Hubs à forte connectivité du « barrel cortex » en développement. / Over The last five years we have observed a huge improvement of optical methods to monitor the activity of neuronal populations in vivo. With these new approaches, remarkable patterns of functional organization at the mesoscopic scale that are involved in many pathophysiological brain functions were highlighted. This thesis aims to develop tools allowing us to dissect the circuits underlying these remarkable patterns according to an experimental approach based on all optical microscopy. These tools have been optimized to describe the functional organization of CA1 neurons in the adult hippocampus as well as in the barrel cortex during development. Two remarkable patterns have recently been identified in these structures, first, adult CA1 neural assemblies involved in memory processes and second, Hub cortical neurons that shape neuronal circuit during development. We have developed a new experimental paradigm combining in vivo two photon calcium imaging, holography photostimulation and mathematical analysis. We optimized the choice and co-expression of calcium probe (GCaMP6s) and opsin (Chronos and ChR2H134R) in our experimental conditions and calibrated their use in neurons of different brain structures. In addition, we designed and assembled a new two-path excitation microscope, one for calcium imaging and the other for in vivo holography photostimulation. This new experimental approach is being validated on Hub neurons with high connectivity in the developing barrel cortex.

Le cervelet joue un rôle fondamental dans la coordination, l'ajustement, la planification et l'automatisation des mouvements, dans la modulation des réflexes ou encore dans certaines fonctions cognitives. Pour ce faire, il va collecter des informations motrices et sensorielles provenant aussi bien du cortex cérébral que du reste du corps. Ces informations sont relayées vers le cortex et les noyaux cérébelleux via les fibres grimpantes et les fibres moussues. Les fibres grimpantes, projetant depuis l'olive inférieure, convoient des signaux sensori-moteurs impliqués dans certains apprentissages et dans la régulation temporelle des activités cérébelleuses. Ces processus jouent un rôle modulateur de la décharge et des plasticités des cellules de Purkinje. Ces dernières ciblent les noyaux cérébelleux qui représentent l'unique sortie du cervelet. Les efférences de ces noyaux cérébelleux incluent une projection GABAergique dirigée sur l'olive inférieure. Ainsi, les connexions entre l'olive inférieure et le cervelet constituent potentiellement une boucle fermé olivo-cortico-nucléaire. Nos études se basent sur les enregistrements électrophysiologiques in vitro et in vivo de ces trois structures effectués sur un modèle de souris génétiquement modifiées qui permet un contrôle spécifique de la décharge des cellules de Purkinje par l'utilisation de l'optogénétique. La stimulation lumineuse du cortex cérébelleux de ces souris transgéniques active les cellules de Purkinje ainsi que la boucle olivo-cortico-nucléaire sur un délai total d'environ 100 ms. Ces résultats démontrent pour la première fois que les cellules de Purkinje contrôlent de manière phasique leurs afférences olivaires et que ce processus pourrait participer à la régulation des apprentissages moteurs cérébelleux. / The cerebellum plays a fundamental role in coordination, adjustment, planning and automation of movements, in the modulation of reflexes and in some cognitive functions. To do this, it will collect motor and sensory information from both the cerebral cortex and the rest of the body. These information are relayed to the cortex and cerebellar nuclei via climbing fibers and mossy fibers. Climbing fibers, the projections from the inferior olive to the cerebellar cortex, carry sensorimotor error and clock signals that trigger motor learning by controlling cerebellar Purkinje cell synaptic plasticity and discharge. Purkinje cells target the deep cerebellar nuclei, which are the output of the cerebellum and include an inhibitory GABAergic projection to the inferior olive. This pathway identifies a potential closed loop in the olivo-cortico-nuclear network. Therefore, sets of Purkinje cells may phasically control their own climbing fiber afferents. Here, using in vitro and in vivo recordings, we describe a genetically modified mouse model that allows the specific optogenetic control of Purkinje cell discharge. Tetrode recordings in the cerebellar nuclei demonstrate that focal stimulations of Purkinje cells strongly inhibit spatially restricted sets of cerebellar nuclear neurons. Strikingly, such stimulations trigger delayed climbing-fiber input signals in the stimulated Purkinje cells. Therefore, our results demonstrate that Purkinje cells phasically control the discharge of their own olivary afferents and thus might participate in the regulation of cerebellar motor learning.

L’activité électrique du cerveau lors de l’éveil est traditionnellement décrite comme rapide, microvoltée, et « désynchronisée ». De récents travaux chez les rongeurs ont montré que l’activité de l’éveil est plus complexe et varie notamment avec les contraintes comportementales. Chez la souris, il est possible d’enregistrer localement dans le cortex somatosensoriel primaire (S1) deux types d’activités associées aux comportements d’éveil calme et d’éveil « actif », lors de l’exploration de l’environnement par les moustaches. La première étude de cette thèse a permis de montrer que les activités corticales dans S1 lors des éveils calme et actif sont sous le contrôle principal du thalamus et, dans une moindre mesure, du système cholinergique. Pour ce faire, nous avons utilisé différentes méthodes : des enregistrements électrophysiologiques du thalamus et du cortex, l’activation optogénétique ou l’inactivation pharmacologique du thalamus. Au cours de la seconde étude, nous avons voulu savoir si le changement d’état d’éveil dans S1 s’observait dans d’autres structures. En réalisant des enregistrements multisites, nous montrons qu’il est possible d’observer ce changement d’état cortical suivant l’activité motrice de la souris en particulier dans les cortex sensori-moteurs (S1, sensoriel secondaire S2, moteur primaire M1), et de manière moins présente dans d’autres modalités sensorielles (auditif primaire Au1, visuel primaire V1), le pariétal associatif (PtA) ou l’hippocampe (dCA1). L’étude d’enregistrements multisites montre une hétérogénéité des activités corticales de l’éveil liée d’une part au comportement de l’animal, et d’autre part aux régions corticales considérées / The activity in the brain during wakefulness has been typically described as rapid, low amplitude and desynchronized. However, recent data on rodents support evidence for a more complex panel of activities depending on the behaviour. For instance, it has been shown in mice a state change in primary somatosensory cortex (S1) from quiet to active wakefulness while the animal is scanning the environment with its whiskers. In the first study, we show that this state change in S1 is under thalamic control and to a smaller extent a regulation by the cholinergic system. In order to study the underlying mechanism of the state change, we have recorded in S1 and the thalamus, and we have activated (optogenetic tools) or inactivated (with pharmacology) the thalamus. In the second part of this thesis work, we asked if the state change related to the behaviour was restricted to S1, or if it was also observed in other areas. We have done multiple recordings in several areas, and we show that it is possible to observe a state change related to muscular activity in sensori-motor areas (in S1, but also secondary sensory S2, and primary motor M1 cortex), and in a much less prominent extent in other sensory modalities (primary auditive Au1 and primary visual V1 cortex), in parietal associative cortex (PtA) and in hippocampus (dCA1). Thus, the multiple recordings in the secondary study show heterogeneity of cortical activities during wakefulness according to the behaviour and the cortical area recorded

La morphogenèse des tissus dans les organismes multicellulaires est très importante pour le développement et certaines pathologies. La morphogenèse tissulaire est dirigée par des forces bio-mécaniques générées par des moteurs moléculaires tels que la myosine et transmis via le cytosquelette et les structures d'adhésion à l'intérieur et entre les cellules. La contractilité de la myosine, souvent en mode oscillatoire, a été étudiée principalement au niveau du domaine apical des cellules épithéliales au cours du développement mais très peu au niveau de leur domaine basal. L'oscillation de la myosine basale est importante pour le contrôle de l'élongation du tissu durant l'oogenèse chez la Drosophile. Bien que la voie Rho1-ROCK-myosin-MBS soit connue pour contrôler l'activité de la myosine, le mécanisme précis de ce contrôle n'a pas été élucidé. Le but de mon projet de thèse est de répondre à deux questions : Quels sont les facteurs en amont de cette voie ? Comment cette voie de signalisation crée et maintient l'oscillation de la myosine ? 1) Contrairement à ce qui est déjà connu, Je me suis intéressé à l'effet des adhésions cellule-cellule et cellule-matrice dans le contrôle des voies de signalisation gouvernant l'oscillation de la myosine basale. Les adhésions cellule-matrice, mais pas les adhésions cellule-cellule, sont positivement corrélées avec l'intensité et la polarité dorso-ventrale de la myosine, indiquant que les adhésions cellule-matrice pourraient être les facteurs en amont de la voie Rho1-myosine. Les adhésions cellule-matrice régulent positivement l'activité de Rho1 près des jonctions et gouvernent les flux de ROCK et myosine à l'intérieur du domaine median, contrôlant ainsi l'élongation du tissu. D'une autre manière, les adhésions cellule-cellule affectent indirectement les flux de ROCK and myosine en contrôlant la distribution subcellulaire de ROCK et du réseau d'actomyosine. L'inhibition des adhésions cellule-cellule, qui a un effet mineur sur l'élongation du tissu, provoque la redistribution des adhésions cellule-matrice et des filaments F-actin entrainant le chargement de la myosine à différentes positions. 2) J'ai montré que l'oscillation de la myosine basale dépend peu de la tension corticale de l'actomyosine : l'inhibition du chargement de la myosine sur les filaments d'actine n'affecte pas le flux de myosine alors qu'il bloque fortement le cycle périodique des contractions/relaxations de la cellule indiquant que l'oscillation est principalement due à une réaction biochimique plutôt qu'à une tension corticale. Au cours de l'oscillation de la myosine, les protéines Rho1 et leur activité sont principalement distribuées et enrichies au niveau et près des jonctions basales, et le contrôle majeur de cette oscillation est le flux des signaux ROCK qui diffusent des jonctions basales au cortex medio-basal. Ce mouvement de ROCK est initié grâce à une interaction transitoire entre ROCK et Rho1 actif au niveau et près des jonctions basales, conduisant ainsi à l'ouverture et activation de la kinase ROCK. Au cours de ce mouvement, l'activation de ROCK permet l'accumulation et l'amplification des signaux ROCK; Cette amplification entraîne la phosphorylation de la myosine, qui ensuite génère la redistribution dynamique de la phosphatase MBS. Enfin, l'enrichissement des signaux MBS arrête les signaux ROCK et myosine. Dans ces deux études, nous avons construit un outil optogénétique confirmant les différentes étapes de l'oscillation de la myosine basale. L'ensemble de ces résultats démontrent que le mécanisme contrôlant l'oscillation de la myosine basale nécessite une réaction biochimique, et met en évidence deux contrôles diffèrent de cette oscillation par les adhésions cellule-cellule et les adhésions cellule-matrice. / Tissue morphogenesis in multicellular organisms is very important in both development and human disease. Tissue morphogenesis is driven by bio-mechanic force that is normally generated by molecular motors such as myosin and transmitted via cytoskeleton and adhesion structures within and between cells. Myosin contractility, often as an oscillatory pattern, has been studied mainly in apical but less in basal domains of epithelial cells during development. Basal myosin oscillation is important in control of tissue elongation during Drosophila oogenesis. Although a signal cascade (Rho1-ROCK-myosin-MBS) has been known to regulate myosin activity, the detailed controlling mechanism is unclear. My project is aimed to address two questions: first, what is the upstream factor of this signal cascade? Second, how does this signal cascade create and maintain basal myosin oscillation? For this first question, I am interested in the effect of cell-cell and cell-matrix adhesion in control of this signal cascade governing basal myosin oscillation. Cell-matrix adhesion (Integrin and Talin), but not cell-cell adhesion (E-cadherin), is positively correlated with the intensity and Dorsal-ventral (DV) axis polarity of basal myosin oscillation, indicating that cell-matrix adhesion might be the upstream control of Rho1-myosin signal cascade. Cell-matrix adhesion positively regulates the Rho1 activity near junction and governs the pulsed ROCK and myosin signals within basal-medial domain, thus strongly controlling tissue elongation. Differently, cell-cell adhesion indirectly affects the ROCK and myosin pulses through controlling the subcellular distribution of ROCK and actomyosin network. Inhibition of cell-cell adhesion results in the redistribution of cell-matrix adhesion and F-actin filaments leading to different position of myosin loading, which plays minor effect on tissue elongation. For the second question, I unraveled that basal myosin oscillation is barely dependent on actomyosin cortical tension: inhibition of myosin loading to F-actin filament seems not to affect basal pulsatile myosin flows, while it strongly blocks the periodic cycle of cell contraction and relaxation at basal surface, thus indicating that oscillation is mainly from biochemical reaction rather than cortical tension. This observation highlighted that biochemical reaction is the main control of oscillation occurrence. During basal myosin oscillation, Rho1 proteins and Rho1 activity are mainly distributed and enriched at and near basal junction and the major control of basal myosin oscillation is the flow movement of oscillatory ROCK signals from basal junction to medio-basal cortex. This ROCK flow movement is initiated from the transient interaction of ROCK with active Rho1 at and near basal junction, thus leading to the opening and activation of ROCK kinase capability. During the membrane-medial flow movement, ROCK kinase activity mediates the accumulation and thus the amplification of ROCK signals; this positive signal amplification turns on the phosphorylation of myosin regulatory light chain (MRLC), which governs the dynamic redistribution of MBS. Finally, enriched MBS signals shut off both ROCK and myosin signals. In both study, an optogenetic tool named as LARIAT was built up in vivo to confirm the various status of basal myosin oscillation. Altogether, these results demonstrated two different controls of basal actomyosin signals by cell-matrix adhesion and cell-cell adhesion, and further demonstrated the underlying mechanism of basal myosin oscillation at the biochemical levels.