Le noyau des cellules est une structure très organisée, dont l'organisation joue un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes. La compréhension des mécanismes à l'origine de cette organisation est donc essentielle à la compréhension du fonctionnement des génomes. De nombreuses expériences conduites chez la souris ont montré que les régions centromériques (RC) des chromosomes jouent un rôle dans l'organisation du noyau. L'organisation spatiale des RCs humaines est beaucoup moins étudiée, principalement à cause de la complexité des séquences qui les composent, qui rend plus difficile leur détection. Nous avons développé des outils de traitement et d'analyse quantitative d'image, qui, combinés à des nouveaux marqueurs des RCs humaines, nous ont permis de mieux décrire deux aspects de leur organisation spatiale. D'une part nous avons montré qu'elles se positionnent préférentiellement en périphérie du noyau ou aux bords des nucléoles, avec des fréquences qui dépendent des chromosomes. D'autre part nous avons montré qu'elles s'agrègent dans le noyau pour former un compartiment d'hétérochromatine, qui présente des caractéristiques similaires à celui observé dans d'autres espèces telles que la souris. Ces deux aspects sont tous deux inter-dépendants et varient au cours du cycle cellulaire. Cette description nouvelle met sur la piste de mécanismes responsables de l'organisation particulière des RCs, qui pourront être étudiés grâce à la méthode d'analyse et aux observables que nous avons développées. L'étude de ces mécanismes permettra de mieux comprendre la fonction des RCs humaines dans l'organisation du noyau. / The cell nucleus is a highly organized structure, playing an important role in gene regulation. Understanding the underlying mechanisms is therefore essential for understanding genome function. Numerous studies conducted in mouse cells have shown that centromeric regions (RC) of chromosomes play a role in nuclear organization. The spatial organization of human RCs is less studied, mainly because of the complexity of the underlying DNA sequences that make them hard to detect. We have developed image processing and analysis tools, that, combined with new markers for human RCs, have allowed us to draw a better description of two features of their spatial organization. On the one hand, we have shown that they are preferentially located close to the nuclear periphery or nucleoli borders, with chromosome-dependent frequencies. On the other hand, we have shown that they cluster to form a heterochromatic compartment that displays similar properties as the one observed in other species such as mouse. Both features are inter-dependent, and vary throughout the cell-cycle. This new description puts on the track of mechanisms responsible for the peculiar organization of RCs. Those mechanisms could be studied using the methodology and the observables we have developed. The study of those mechanisms will provide a better understanding of human RC function in nuclear organization.

Chez la levure à bourgeon, l’établissement de domaines silencieux pour la transcription nécessite la formation d’une structure, de type hétérochromatine, formée par le complexe SIR (Silencing Information Regulator). Les gènes soumis à la répression transcriptionnelle par ce complexe se trouvent aux sites cryptiques de détermination du type sexuel (HM) et dans les régions subtélomériques localisées à la périphérie nucléaire. Le recrutement des protéines Sir à ces sites nécessite la présence de séquences en cis comme les silencers ou les répétitions télomériques. Mon travail de thèse s’est attaché à l’étude d’une nouvelle voie d’établissement de la répression transcriptionnelle des gènes. En effet, nous avons démontré que la répétition en tandem de protéines fortement liées à l’ADN constitue un stress pour la fibre de chromatine. Ce stress induit le recrutement du complexe SIR favorisant ainsi la formation d’hétérochromatine et la mise en silence des gènes dans des régions normalement actives du génome. De plus, nous avons observé qu’en absence de l’ADN hélicase Rrm3, dont la fonction est de faciliter la progression de la fourche de réplication le long de la fibre de chromatine, la répression induite par ces complexes est exacerbée. Ce lien entre stress réplicatif et établissement de la répression transcriptionnelle a été observé, dans un premier temps, grâce à l’utilisation de systèmes artificiels (systèmes d’étiquetage des gènes : lacO/LacI et tetO/TetR). En outre, nous avons montré qu’un site naturel de pause de la réplication, tel qu’un gène codant un ARN de transfert, peut également favoriser la répression par les protéines Sir. De manière intéressante, à l’échelle du génome, nous avons pu observer le recrutement des protéines Sir dans des régions où la progression de la fourche de réplication est ralentie. Ainsi, nos données révèlent une nouvelle voie de mise en silence des gènes liant stress réplicatif et répression transcriptionnelle. / In budding yeast, the heterochromatin-like structure formed by the SIR complex (Silencing Information Complex) represses transcription. SIR mediated repression occurs at the cryptic mating type loci (HM) and subtelomeric regions localized at the nuclear periphery. The recruitment of the Sir proteins is induced by the presence of cis-acting elements as silencers or telomeric repeats.My doctorate work was focused on the characterization of a novel pathway of silencing establishment. Indeed, we have shown that arrays of tight DNA-proteins complexes lead to a chromatin stress. This stress induces the recruitment of the SIR complex and the establishment of stable heterochromatin-like domain at ectopic sites in the budding yeast genome. Moreover, this heterochromatinization is enhanced in cells mutated for Rrm3, a specialized DNA helicase acting ahead the fork to remove replication-impeding structures. Thus, we first observed a link between replication stress and silencing establishment by using artificial systems (gene tagging systems: lacO/LacI and tetO/TetR). Further, we have shown that tRNA genes, which are known to act as replication pause sites, can favor SIR-mediated repression. Interestingly, we found that Sir proteins are recruited where the replication fork progression is impeded at the genome wide scale. All together, these data reveal a novel mechanism for heterochromatin formation linking replication stress with gene repression.

La réplication de l’ADN est un processus essentiel qui doit avoir lieu une seule fois par cycle cellulaire. Ce processus hautement régulé et très conservé chez les eucaryotes, assure une complète duplication et donc une totale transmission de l’information génétique. Des changements dans le programme de réplication, qui est définit par le moment d’activation et la fréquence d’utilisation de l’ensemble des origines, ont été observés lors du développement, après induction de la différenciation chez des cellules souches embryonnaires de souris, ainsi que dans un grand nombre de cancers. La régulation de la réplication de l’ADN est donc un processus essentiel pour le maintien de l’intégrité du génome et le programme de réplication pourrait y contribuer de manière importante. Cependant, en dépit d’un grand nombre de travaux sur les différentes protéines et modifications impliquées dans la sélection des origines, les principaux déterminants ainsi que leur interdépendance restent étonnement méconnus. Mon projet de thèse se focalise sur l’identification des paramètres clés qui régulent le programme de réplication, en utilisant comme modèle la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe. Premièrement, je me suis intéressé au rôle de la dynamique de l’activité des CDKs lors de la phase G1 ainsi que de leur niveau d’activité à la frontière G1/S dans la sélection des origines. J’ai démontré que changer la longueur de la phase G1 à travers la modulation de l’activité des CDKs se traduit par une modification du profil de réplication tout au long du génome. Plus précisément, les origines inefficaces sont utilisées plus fréquemment alors que les origines efficaces ont une activité réduite. D’un autre coté, nous avons également montré que le nombre d’origines actives pour une phase S donnée, dépend du niveau d’activité des CDKs lors de l’entrée en phase S, suggérant ainsi que cette activité est un facteur limitant dans la régulation de l’initiation de la réplication. Dans un second temps, j’ai utilisé une approche dans laquelle les cellules établissent un programme de réplication de novo après la sortie de quiescence, afin d’étudier les premières étapes de la sélection des origines de réplication, en se focalisant sur l’importance du recrutement de ORC (Origin Recognition Complex) aux origines. L’analyse du profil de liaison de ORC révèle une forte corrélation entre le niveau de liaison de ORC aux origines et l’efficacité de ces dernières, démontrant pour la première fois que ORC n’est pas simplement un marqueur des sites d’initiation potentiels mais plutôt un déterminant crucial dans l’établissement du programme de réplication. Finalement, j’ai observé que les origines efficaces ont tendance à être organisées en groupes tout au long du génome, suggérant que l’organisation chromosomique pourrait être importante dans la sélection des origines de réplication. Afin d’étudier cela, j’ai généré des souches contenant différents réarrangements chromosomiques. Nos résultats indiquent que la position relative d’une origines par rapport à son contexte chromosomique, joue un rôle important dans la régulation de son efficacité et que des régions distinctes peuvent avoir des effets opposés sur la sélection des origines en étant soit activatrices ou inhibitrices. / DNA replication is an essential process that occurs only once in a cell cycle before cell division. Replication is highly regulated through conserved mechanisms to ensure the faithful duplication and transmission of genetic information. Interestingly, changes in the replication program, defined by the temporal and spatial pattern of replication origin activation, have been observed during development in distinct cell types, after induction of differentiation in mouse embryonic stem cells, and in various cancers. The regulation of DNA replication is therefore essential for ensuring the integrity of the genome, and the program of origin activation may be an important contributor to this process. However, despite a large body of work on the many enzymes and modifications involved in origin selection, the critical determinants as well as their interdependence remain surprisingly unknown. My thesis project focuses on identifying the key parameters that regulate the replication program, taking advantage of unique approaches using the fission yeast Schizosaccharomyces pombe as a model system. First, we investigated the qualitative and quantitative aspects of the role of CDK activity in determining the program of DNA replication. We demonstrated that changing the length of G1 phase through modulation of CDK activity has an impact on the profile of replication initiation along the chromosome. More specifically, inefficient origins show increases in their usage, while efficient origins have reduced activities. Moreover, we have shown that cells are highly sensitive to differences in CDK activity levels at the G1/S transition, which result in genome-wide changes in replication initiation across the entire spectrum of efficiencies. This suggests that CDK activity is a dose-dependent, limiting factor in the regulation of origin usage. Thus, our study establishes the integration of both temporal and quantitative regulation of CDK activity as a key determinant in defining the program of genome duplication. Second, using an approach in which cells establish a replication program de novo after exit from quiescence, we investigated the critical first steps of origin selection. We focused on the importance of the essential Origin Recognition Complex, whose recruitment to origins is required for the subsequent assembly of replication complexes. Our analysis reveals a strong correspondence between the level of ORC binding at origins and the efficiency of these origins in both cells exiting quiescence as well as those in vegetative growth conditions. Therefore, we demonstrate for the first time that ORC is not simply a marker of potential initiation sites but rather a crucial determinant in the program of origin usage.Finally, our observation that efficient origins are organized in distinct clusters in the de novo replication program suggested that chromosomal organization may be important for origin selection. To address this question, we have generated strains containing a series of distinct chromosomal rearrangements and assessed their origin efficiency profiles. Our findings indicate that the localization of an origin with respect to its chromosomal context plays an important role in regulating its efficiency. Moreover, distinct regions may have different effects on origin selection by being permissive or inhibitory for origin activity. Those observations could indicate a role for the spatial organization of the genome in origin selection and thus led us to study chromosome and nuclear organization in conditions where the replication program is different.

La transition florale résulte d’un jeu complexe d’interactions entre des signaux endogènes et environnementaux. Les feuilles jouent un rôle crucial dans ce processus en percevant les changements associés à la lumière et en produisant les photosynthétats qui participant à la signalisation de la floraison. Toutefois, notre connaissance des changements se produisant dans les feuilles lors de la transition florale reste limitée. Nous avons caractérisé les événements morphologiques, moléculaires et transcriptionnels en relation avec la floraison florale dans les feuilles matures chez Arabidopsis, en exploitant un système de transfert de conditions en jours courts vers des jours longs, transfert qui permet d’induire et synchroniser la floraison. Nous avons identifié la fenêtre temporelle de la transition florale, mesuré la croissance foliaire, et observé un accroissement de la ploïdie au cours du processus. Par une approche de RNA-seq, nous avons étudié la dynamique transcriptionnelle des réseaux de gènes dans la feuille, et comparé avec des données dans la racine et le méristème pour avoir une vue plus intégrée de la floraison dans la plante. De plus, nous avons analysé le mode d’action de LHP1 (LIKE HETEROPROTEIN 1), une sous unité du complexe PRC1, en exploitant des lignées transgéniques avec des modifications conditionnelles du dosage de LHP1 et en analysant les effets sur la chromatine et la transcription des gènes impliqués dans la floraison. Une modulation courte du dosage en LHP1 modifie le dépôt des marques H3K27me3 et H3K4me3, démontrant une interaction fonctionnelle entre LHP1 et le complexe PRC2, et suggérant aussi un nouveau rôle dans la formation de régions chromatiniennes de type bivalent. Enfin, étant donné le rôle clé de l’organisation nucléaire dans la régulation génique, nous avons recherché et identifié des déterminants de l’architecture nucléaire en utilisant de nouveaux outils de statistiques spatiales. / The transition to flowering results from a complex interplay between endogenous and environmental cues. The leaves play a key role in this process, by perceiving the light changes and producing photosynthates, which participate to the floral signalling. However, our knowledge on the changes occurring in leaves during floral transition is still limited. We characterised the morphological, molecular and transcriptional events related to floral transition in mature leaves in Arabidopsis, using a short-day to long-day shift to induce a synchronized flowering. We identified the temporal window of the floral transition, monitored the leaf growth and observed an increase in their ploidy level during the process. By RNA-seq we studied the transcriptional dynamics of the leaf gene network, and compared with events occurring in roots and meristems to get an integrated view of floral transition in the whole plant. Furthermore, we investigated the mode of action of LIKE HETEROPROTEIN 1 (LHP1), a PRC1 subunit, by exploiting transgenic lines with conditional alterations of LHP1 dosage and analysing the effects on chromatin and transcription of flowering genes. A short-term modulation of LHP1 dosage altered the deposition of H3K27me3 and H3K4me3, showing a functional interaction between LHP1 and PRC2, and also suggesting a new role in the formation of bivalent chromatin regions. Finally, since nuclear organisation plays a key role in gene regulation, we searched and identified determinants of the nuclear architecture by using innovative spatial statistical tools.

L’organisation non-aléatoire du noyau des cellules eucaryotes et la compaction de l’ADN en chromatine plus ou dense peuvent influencer de nombreuses fonctions liées au métabolisme de l’ADN, y compris la stabilité du génome. Les cassures double-brin sont les dommages à l’ADN les plus néfastes pour la cellule. Pour préserver l’intégrité de leur génome, les cellules eucaryotes ont développé des mécanismes de réparation des cassures double-brin qui sont conservés de la levure à l’homme. Parmi ceux-ci, la recombinaison homologue utilise une séquence homologue intacte présente ailleurs dans le génome et peut se diviser en deux sous voies de réparation. La conversion génique transfère l’information génétique d’une molécule à son homologue, tandis que le Break Induced Replication (BIR) établit une fourche de réplication qui peut procéder jusqu’à la fin du chromosome.Mon travail de thèse s’est attaché à caractériser la contribution du statut chromatinien et de l’organisation tridimensionnelle du génome à la réparation des cassures double-brin. L’organisation du noyau de la levure S. cerevisiae ainsi que la propagation de l’hétérochromatine au niveau des régions subtélomériques peuvent être modifiées via la surexpression des protéines Sir3 et sir3A2Q. Nous avons montré que le groupement des télomères accroit la conversion génique entre deux séquences subtélomériques, soulignant le rôle clé de la proximité spatiale et de la recherche d’homologie. Nous avons également constaté que la présence d’hétérochromatine au niveau du site de cassure limite la résection, ce qui permet une disparition plus lente des extrémités, qui resteraient disponibles plus longtemps pour réaliser la recherche d’homologie et achever la réparation. Enfin, nous avons observé que la présence d’hétérochromatine au site donneur diminue l’efficacité de recombinaison et qu’elle doit moduler une étape commune aux deux voies de réparation, à savoir l’invasion de brin. Ces travaux nous ont permis de décrire de nouvelles voies de régulation de la réparation de l’ADN. / The non-random organization of the eukaryotic cell nucleus and the folding of genome in chromatin more or less condensed can influence many functions related to DNA metabolism, including genome stability. Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA damages for the cells. To preserve genome integrity, eukaryotic cells thus developed DSB repair mechanisms conserved from yeast to human, among which homologous recombination (HR) that uses an intact homologous sequence to repair a broken chromosome. HR can be separated in two sub-pathways: Gene Conversion (GC) transfers genetic information from one molecule to its homologous and Break Induced Replication (BIR) establishes a replication fork than can proceed until the chromosome end.My doctorate work was focused on the contribution of the chromatin context and 3D genome organization on DSB repair. In S. cerevisiae, nuclear organization and heterochromatin spreading at subtelomeres can be modified through the overexpression of the Sir3 or sir3A2Q mutant proteins. We demonstrated that reducing the physical distance between homologous sequences increased GC rates, reinforcing the notion that homology search is a limiting step for recombination. We also showed that heterochromatinization of DSB site fine-tunes DSB resection, limiting the loss of the DSB ends required to perform homology search and complete HR. Finally, we noticed that the presence of heterochromatin at the donor locus decreased both GC and BIR efficiencies, probably by affecting strand invasion. This work highlights new regulatory pathways of DNA repair.

Le noyau des cellules est une structure très organisée, dont l'organisation joue un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes. La compréhension des mécanismes à l'origine de cette organisation est donc essentielle à la compréhension du fonctionnement des génomes. De nombreuses expériences conduites chez la souris ont montré que les régions centromériques (RC) des chromosomes jouent un rôle dans l'organisation du noyau. L'organisation spatiale des RCs humaines est beaucoup moins étudiée, principalement à cause de la complexité des séquences qui les composent, qui rend plus difficile leur détection. Nous avons développé des outils de traitement et d'analyse quantitative d'image, qui, combinés à des nouveaux marqueurs des RCs humaines, nous ont permis de mieux décrire deux aspects de leur organisation spatiale. D'une part nous avons montré qu'elles se positionnent préférentiellement en périphérie du noyau ou aux bords des nucléoles, avec des fréquences qui dépendent des chromosomes. D'autre part nous avons montré qu'elles s'agrègent dans le noyau pour former un compartiment d'hétérochromatine, qui présente des caractéristiques similaires à celui observé dans d'autres espèces telles que la souris. Ces deux aspects sont tous deux inter-dépendants et varient au cours du cycle cellulaire. Cette description nouvelle met sur la piste de mécanismes responsables de l'organisation particulière des RCs, qui pourront être étudiés grâce à la méthode d'analyse et aux observables que nous avons développées. L'étude de ces mécanismes permettra de mieux comprendre la fonction des RCs humaines dans l'organisation du noyau.

Le noyau est une innovation évolutive majeure caractéristique des organismes eucaryotes. Ces dernières années de nombreux travaux se sont intéressés à l’organisation de la chromatine dans l’espace nucléaire lors de l’interphase. Les protéines associées à la périphérie nucléaire ou ancrées dans la membrane nucléaire interne ont suscité un intérêt majeur due à leur contribution dans l’organisation spatiale de la chromatine. Chez les animaux, les lamines qui forment des filaments à la périphérie nucléaire et le complexe LINC, un complexe protéique reliant la membrane externe et interne du noyau sont connues pour interagir avec la chromatine, influencer l’organisation de cette dernière et moduler la régulation transcriptionnelle. Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana utilisée dans ce travail, le complexe LINC est conservé, par contre les lamines ne le sont pas et seraient remplacées par d’autres acteurs spécifiques du règne végétal. Le travail détaillé dans ce manuscrit porte sur la mise en évidence d’un nouveau réseau d’interaction protéique localisé à la périphérie nucléaire et sur l’impact de ces protéines dans la morphologie du noyau et l’organisation de la chromatine. Mes travaux se sont concentrés sur les protéines à domaine SUN, l’une des composantes du complexe LINC et sur les protéines CRWN et KAKU4 présentes à la périphérie du noyau. Des cribles double hybride chez la levure m’ont permis d’identifier 24 partenaires protéiques potentiels dont plus d’un tiers sont des facteurs de transcription L’étude plus précise du facteur de transcription MaMYB pour lequel nous avons créé un allèle nul par la méthode CRISPR montre qu’il joue un rôle plus spécifique dans la formation des racines. L’étude de mutants combinatoires pour les gènes SUN, CRWN et KAKU4 montre des anomalies développementales notamment des tissus reproductifs. Enfin, une étude plus détaillée de la protéine KAKU4 suggère sa participation au maintien de la morphologie du noyau et au rapprochement de l’hétérochromatine vers la périphérie nucléaire. En résumé, mes travaux ont mis en évidence l’existence d’un réseau de facteurs de transcription recrutés à la périphérie nucléaire par les protéines SUN, CRWN et KAKU4. Ce réseau d’interaction protéine-protéine participerait à un mécanisme de séquestration de certains facteurs de transcription et/ou d'un rapprochement à la périphérie nucléaire de certains domaines de chromatine afin d’activer ou de réprimer leur transcription. / The nucleus is a major evolutionary innovation characteristic of eukaryotic organisms. In recent years, numerous studies have focused on the organization of chromatin in nuclear space during interphase. Proteins associated with the nuclear periphery or anchored in the inner nuclear membrane have been particularly studied for their contribution to the spatial organization of chromatin. In animals, the lamina that forms filaments at the nuclear periphery and the LINC complex, a protein complex linking the outer and inner membrane of the nucleus, are known to interact with chromatin, to influence its organization and to modulate transcriptional regulation. In the model plant Arabidopsis thaliana used in this work, the LINC complex is conserved, but not the lamina constituents, which are replaced by other specific actors of the plant kingdom. The work detailed in this manuscript identified a new protein interaction network located on the nuclear periphery and studied the impact of these proteins on nuclear morphology and chromatin organization. My work focused on SUN-domain proteins, one of the components of the LINC complex, and on the CRWN and KAKU4 proteins at the periphery of the nucleus. Double hybrid screens in yeast allowed me to identify 24 potential protein partners, more than a third of which are transcription factors. The more precise study of the transcription factor MaMYB for which we created a null allele using the CRISPR method, shows that it plays a more specific role in root formation. The study of mutant combinations for SUN, CRWN and KAKU4 genes reveals developmental abnormalities, particularly in reproductive tissue. Finally, a more detailed study of the role of the KAKU4 protein suggests that it contributes to the morphology of the nucleus in maintaining heterochromatin at the nuclear periphery. In summary, we propose the existence of a transcription factor network recruited to the nuclear periphery by SUN, CRWN and KAKU4 proteins. This protein-protein interaction network would participate in the sequestration of certain transcription factors and/or the localization of certain chromatin domains to the nuclear periphery in order to activate or suppress their transcription.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'ADN chromosomique des cellules eucaryotes est fortement condensé au sein d'un complexe nucléoprotéïque, la chromatine. Aussi bien l'organisation spatiale que la composition biochimique (état “épigénomique”) de la chromatine jouent un rôle fondamental dans la régulation des gènes. Grâce aux récents développements des techniques de séquençage à haut-débit, il est possible de déterminer l'état épigénomique local de la chromatine ainsi que la probabilité de contact entre deux sites génomiques (technique dite de “Hi-C”). Ces deux techniques ont permis de mettre en évidence l’existence de domaines d’interaction dont les positions corrèlent fortement avec la segmentation épigénomique de la chromatine. Cependant, les mécanismes responsables de ce couplage sont encore mal compris. L’objectif de cette thèse est de bâtir des modèles physiques permettant de valider l’hypothèse que l’épigénome est un acteur majeur dans le repliement 3D de la chromatine. Pour cela, nous avons tout d’abord développé “IC-Finder”, un algorithme permettant de segmenter les cartes Hi-C en domaines d’interaction. Nous avons alors pu quantifier précisément l’association entre épigénome et organisation de la chromatine. Les corrélations trouvées justifient l’idée de modéliser la chromatine par un copolymère par bloc dont les monomères ont chacun un état épigénomique. Dans ce cadre, nous avons développé une méthode d’inférence des potentiels d'interaction entre sites génomiques à partir des cartes Hi-C expérimentales. Ce travail permettra à plus long terme de prévoir l’organisation de la chromatine sous différentes conditions, ce qui permettra d’étudier en particulier les changements de structure résultant de l’altération de l’épigénome. / DNA of eukaryotes is highly condensed in a nucleoprotein complex called chromatin. Both the spatial organization and the biochemical composition (“epigenomic” state) of the chromatin are fundamental for gene regulation. Remarkably, recent studies indicate that1D epigenomic domains tend to fold into 3D topologically associated domains (TADs) forming specialized nuclear chromatin compartments. In this thesis, we address the question of the coupling between chromatin folding and epigenome. We first built a software called IC-finder to segment HiC maps into interacting domains. We next used it to quantify correlations between the TADs and epigenomic partitions of the genome. This led us to develop a physical model of the chromatin with the working hypothesis that chromatin organization is driven by physical interactions between epigenomic loci. We modeled chromatin as a block copolymer where each block corresponds to an epigenomic domain. With this framework, we developed a method to infer interaction parameters between chromatin loci from experimental Hi-C map. An outcome of such inference process would be a powerful tool to predict chromatin organization in various conditions, allowing investigating in silico changes in TAD formations and long-range contacts when altering the epigenome.

Enfermer le porteur de l’information génétique dans le noyau a obligée la cellule a créé un système de transport complexe, qui permet l’export d’un ARNm du noyau au cytoplasme. Le mécanisme général de l’export des ARNm est encore mal connu, même si les facteurs principaux ont été découverts il y a longtemps. De récents progrès en microscopie nous ont permis d’étudier directement le comportement des ARNm durant le processus d’export. Durant ma maitrise, nous avons été capables de localiser et suivre des ARNm en temps réel pour la première fois chez Saccharomyces cerevisiae. Nous avons créé un gène rapporteur en mettant le gène GLT1 sous le contrôle du promoteur GAL1. Nous avons aussi marqué l’ARNm de GLT1 avec plusieurs boucles PP7. L’ARNm sera visible après l’attachement de plusieurs protéines PP7-GFP aux boucles. En utilisant la technique d’imagerie en cellules vivantes, nous sommes capable de visualiser et suivre chaque ARNm, depuis son relâchement du site de transcription jusqu’à l’export. Une fois relâché du site de transcription, l’ARNm diffuse librement dans le nucléoplasme, mais une fois à la périphérie nucléaire, il commence à « scanner » l’enveloppe nucléaire avant d’être exporté. Nous avons trouvé que le « scanning » dépend de la présence des Myosin Like Proteins (Mlp1p et Mlp2p), protéines qui forment le panier nucléaire, car suite à la délétion de MLP1 et MLP2, les ARNm n’étaient plus capable de « scanner ». Nous avons également trouvé que la partie C-terminale de Mlp1p était nécessaire au « scanning ». De plus, suite à la délétion du gène TOM1, gène codant pour une ubiquitine ligase, les ARNm ont un comportement similaire aux ARNm d’une souche ∆mlp1/mlp2, suggérant que le « scanning » permet à Tom1p d’ubiquitiner Yra1p, ce qui causera son relâchement de l’ARNm. Également, nous avons montré que les ARNm endogènes MDN1 et CBL2 scannent aussi la périphérie nucléaire. Ensemble, nos résultats suggèrent que le scanning est un processus par lequel passent tout les ARNm nucléaire lorsqu’ils se retrouvent à la périphérie du noyau, pour initier plusieurs étapes de réarrangements nécessaires à leurs export. De plus, nous avons examiné le rôle de Yhr127p, une protéine nouvellement identifiée qui se lie à l’ARN. Après avoir marqué cette protéine avec la GFP, nous avons montré qu’elle forme des foci dans le noyau et que ces derniers vont disparaitre suite à l’arrêt de la transcription. La délétion de YHR127 à conduit à une augmentation de la transcription de quelques gènes spécifiques, mais n’affecte pas la capacité de la cellule à exporter les ARNm. Nos résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle dans la régulation de la transcription et/ou dans la stabilité de l’ARNm. / In eukaryotic cells, the processes of RNA and protein synthesis are spatially separated into two distinct compartments. With this division, a complex pathway of nucleocytoplasmic RNA export has evolved, which to date remains poorly understood. Recent advances in single-molecule microscopy have enabled direct studies focused on investigating the dynamics and kinetics of RNA export. In this Master thesis, we present the first real time visualization of mRNA export in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We first generated a GLT1 reporter under the control of the inducible GAL1 promoter, in which the GLT1 mRNA was tagged with an array of PP7 repeats and detected by exogenous PP7-GFP binding protein. Using a single-molecule live cell imaging approach, we were able to visualize and track the behavior of individual mRNAs from the site of transcription to the point of export. Interestingly, we found that once released from the transcription site, single mRNAs diffuse freely in the nucleoplasm, but once they reach the nuclear periphery, they scan the periphery before being exported to the cytoplasm. This scanning behavior was dependent on Myosin Like Proteins (Mlp1p and Mlp2p), which form the basket of the Nuclear Pore Complex (NPC), as mRNAs were not retained at the periphery and were rapidly released into the nucleoplasm in mlp1p/mlp2p double mutant cells. Specifically, we found that the C-terminal part of Mlp1p was important for scanning. Furthermore, mRNAs from cells depleted of the E3 ubiquitin ligase TOM1 had a similar phenotype to mRNAs in mlp1p/mlp2p double mutant cells, suggesting a role for scanning in the Tom1p-mediated release of Yra1p from the RNA. Lastly, we confirmed that endogenous MDN1 and CBL2 mRNAs also exhibit scanning behaviour. Taken together, our results suggest that mRNAs scanning the nuclear periphery is a general behaviour for all mRNAs to initiate the mRNA export process, allowing mRNP arrangement required for export to occur at the nuclear periphery. In addition, we investigated the role of YHR127, a newly identified RNA binding protein, in RNA biogenesis. Notably, we show that GFP-tagged YHR127p formed distinct foci in the nucleus, which were lost upon transcription arrest. Deletion of YHR127 led to an increase in transcript levels of specific genes, but not to a global accumulation of mRNAs in the nucleus, suggesting a role for this protein in regulating transcription and/or mRNA stability.