O receptor ativado por protease do tipo 1 (PAR1) foi o primeiro membro clonado da família de receptores acoplados à proteína G. Sua ativação tem sido associada ao reparo tecidual e cicatrização óssea. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da ativação do PAR1 nas atividades osteogênica e cementogênica de células mesenquimais do ligamento periodontal (CMLP). CMLP obtidas de 3 indivíduos foram cultivadas e tratadas com meio clonogênico (MC) ou meio osteogênico (MO) por 2, 7 e 14 dias. Depósitos de cálcio, concentração de cálcio (sobrenadante), atividade de fosfatase alcalina (ALP), proliferação celular, expressão gênica (qPCR) e níveis proteicos (ELISA) de fatores osteogênicos e cementogênicos foram avaliados na presença de trombina, agonista do PAR1 ou antagonista do PAR1. A ativação do PAR1 levou ao aumento da formação de depósitos de cálcio (p<0,05), o que foi associado ao aumento da concentração de cálcio (p<0,05), atividade da ALP (p<0,05) e proliferação celular (p<0,05). Além disso, os ensaios qPCR e ELISA mostraram que a ativação do PAR1 pode aumentar a expressão gênica de Runx2, OPG e CEMP1 (p<0,05) e níveis proteicos de Runx2 e OPG (p<0,05). Em conclusão, nossos resultados demonstram que a ativação de PAR1 aumenta as atividades osteogênica e cementogênica de CMLP. / Protease activated receptor 1 (PAR1) was the first cloned member of the G protein-coupled receptor family. Its activation has been associated to tissue repair and bone healing. The aim of the present study was to evaluate the effect of PAR1 activation on the osteogenic and cementogenic activities of human periodontal ligament stem cells (HPLSC). HPLSC obtained from 3 subjects and treated with a control medium or with an osteogenic medium for 2, 7 and 14 days. Calcium deposits, calcium concentration (supernatant), alkaline phosphatase activity (ALP), cell proliferation and gene (qPCR) and protein expression (ELISA assay) of osteogenic and cementogenic factors were assessed in the presence of thrombin, PAR1 specific agonist peptide or PAR1 antagonist peptide. The activation of PAR1 led to increased formation of calcium deposits (p<0.05), which was associated to increased calcium concentration (p<0.05), ALP activity (p<0.05) and cell proliferation (p<0.05). Further, qPCR and ELISA assay showed that activation of PAR1 may increase gene expression of Runx2, OPG and CEMP1 (p<0.05) and protein levels of Runx2 and OPG (p<0.05). In conclusion, our results demonstrate that PAR1 activation increases osteogenic and cementogenic activities of HPLSC.

O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença ou não de partículas de vidro bioativo. Fibroblastos derivados do ligamento periodontal humano (hPDLF) e células osteogênicas da calvária de rato recém-nascidos foram plaqueadas em superfícies bidimensionais - lamínulas de plástico ThermanoxTM (controle); superfícies colágenas bidimensionais - ThermanoxTM revestidas por colágeno I sem partículas de vidro bioativo (2D) e com partículas de vidro bioativo (2D+VB); e em gel colágeno tridimensional sem vidro bioativo (3D) e com partículas (3D+VB). Foram avaliados: Viabilidade celular (MTT) nos tempos 3, 7 e 10 dias; Atividade de fosfatase alcalina (ALP) normalizada pelo conteúdo de proteína total em 7 e 14 dias; Immunolocalização de proteínas da matriz não-colágena (ALP e OPN em células hPDLF aos 7 e 14 dias e OPN e BSP em células osteogênicas aos 7 dias) por imunofluorescência indireta; Expressão quantitativa (PCR em tempo real) dos genes Periostina (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) e Fibromodulina (FBM), marcadores do fenótipo fibroblástico, em células hPDLF e Fosfatase Alcalina (ALP), Osteopontina (OPN), Sialoproteína Óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Colágeno I (COL I) e Runx2, marcadores osteoblásticos, em ambos os tipos celulares; e Mineralização (coloração por vermelho de Alizarina). Os resultados obtidos nas culturas de hPDLF mostraram que aos 3 dias a viabilidade celular em 2D+VB foi maior que no controle (p<0,05) e nenhuma diferença significante entre os grupos foi observada aos 7 e 10 dias. O conteúdo de proteína total aos 7 e 14 dias foi maior nas culturas 3D e 3D+VB, sendo aos 7 dias significantemente diferente de 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05) e aos 14 dias observou-se diferença significativa entre 3D e 2D. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior nos grupos 2D e 2D+VB comparados com 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05); e em 3D+VB menor que no controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias 3D e 3D+VB apresentaram maior atividade de ALP que o controle (p<0,05). Imunomarcações para OPN e ALP foram observadas nas células em 3D em ambos os períodos avaliados, e em 2D, 2D+VB, e controle apenas aos 14 dias. A expressão de RNAm para PRT aos 7 dias apresentou um perfil upregulated em 3D e 3D+VB comparados ao controle (p<0,05); para FBM a expressão gênica foi maior em 3D e 2D que em 3D+VB (p<0,05), e menor em 3D+VB comparado ao controle (p<0,05). As células em 2D exibiram maiores níveis de expressão de RNAm para S100A4 que as cultivadas em 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05). Os níveis de RNAm para COL I e ALP em 2D+VB e 3D, para RUNX2 e OPN em 3D e 2D, e para OC em 2D apresentaram-se upregulated em relação ao controle (p<0,05). Em 2D o nível de expressão de OC foi maior que em 2D+VB (p<0,05). Aos 14 dias houve uma diminuição da expressão de todos os genes analisados em relação às análises de 7 dias. Células em 3D+VB expressaram menores níveis de PRT que em 2D+VB (p<0,05). A expressão de RNAm para FBM foi maior em 2D e 2D+VB e para S100A4 maior em 2D comparado com 3D (p<0,05), nos quais os níveis de S100A4 ficaram downregulated com relação ao controle. COL I e ALP apresentaram-se downregulated em 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05) em relação ao controle. Entre 2D+VB e 3D+VB também foi observada diferença significativa para ALP. A expressão de RUNX2 foi maior em 3D que em 3D+VB (p<0,05) e de OC maior no controle. Nos grupos com VB foi observada maior formação de matriz calcificada aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias não foram observadas áreas coradas por Alizarina através da microscopia, mas a quantidade de mineralização em 2D+VB e 3D+VB foi significativamente maior que no controle (p<0,05), 2D (p<0,05) e 3D (p<0,05). Aos 14 dias marcações mais extensas foram observadas nas culturas com VB, porém os nódulos mineralizados apresentavam-se independentes das partículas. 2D+VB e 3D+VB foram significativamente diferentes do controle (p<0,05) e 2D (p<0,05). As culturas de células osteogênicas mostraram que aos 7 dias as células crescidas sobre os arcabouços 3D+VB e 3D exibiram menores índices de viabilidade. Diferenças significativas foram observadas quando 3D+VB foi comparado aos grupos 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05); e entre 2D e 3D (p<0,05). Aos 3 e 10 dias não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos. O conteúdo de proteína total foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05) e no controle (p<0,05) aos 7 e 14 dias. Diferenças significantes também foram observadas entre 3D e 2D (p<0,05) aos 14 dias. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior em 2D+VB e 3D+VB. Diferenças significantes foram encontradas entre 2D e 2D+VB (p<0,05), 3D e 3D+VB (p<0,05) e entre 3D e controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias, 3D e 3D+VB apresentaram os menores valores de atividade de ALP, sendo a significantemente diferentes de 2D (p<0,05) e 2D+VB (p<0,05). Imunomarcações para OPN e BSP foram observadas aos 7 dias em 2D, 2D+VB, 3D e controle. Aos 7 dias os níveis expressão do RNAm para ALP, COL I e RUNX2 foram maiores em 3D e 3D+VB. Os genes OPN, OC e BSP exibiram níveis de expressão mais altos em 2D+VB. A expressão de COL I foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05). As células em 2D+VB apresentaram maiores níveis de expressão de OPN e OC que em 2D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05), nos quais a expressão desses genes e de BSP estavam downregulated em relação ao grupo controle. Aos 10 e 14 dias áreas coradas por vermelho de Alizarina foram observadas em todos os grupos, sendo mais extensas nos grupos que continham VB. Aos 10 dias a quantidade de cálcio em 3D+VB foi maior que no controle (p<0,05); e maior em 2D+VB comparado com 2D (p<0,05) e controle (p<0,05). Aos 14 dias 2D+VB e 3D+VB apresentaram uma quantidade de cálcio significativamente maior que no controle (p<0,05) e em 2D (p<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou que os arcabouços tridimensionais colágenos são capazes de suportar a viabilidade, proliferação e diferenciação celular se in vitro de hPDLF e células osteogênicas derivadas de calvária de rato recém-nascidos e de favorecerem a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em hPDLF. As partículas de VB em ambos os tipos celulares também contribuiram para viabilidade, diferenciação, formação de matriz mineralizada e expressão fenotípica. / The aim of this study was to analyze the fibroblastic and osteoblastic phenotypes expression on three-dimensional cultures in the presence or not of bioactive glass particles. Fibroblasts derived from human periodontal ligament (hPDLF) and osteogenic cells from newborn rat calvaria were cultured on bi-dimensional surfaces - plastic coverslips ThermanoxTM (control), bi-dimensional collagen surfaces - ThermanoxTM coated with collagen I without bioactive glass particles (2D) and with bioactive glass particles (2D+BG), on three-dimensional collagen gel without bioactive glass (3D) and with particles (3D+BG). Were evaluated: Cell viability (MTT) in 3 days, 7 and 10 days; Phosphatase alkaline activity (ALP) normalized by total protein content at 7 and 14 days; Immunolocalization of non-matrix proteins collagen (ALP and OPN in hPDLF at 7 and 14 days, OPN and BSP in osteogenic cells at 7 days) by indirect immunofluorescence; Genes expression (real-time PCR) for Periostin (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) and Fibromodulin (FBM): fibroblastic markers in hPDLF, and Alkaline phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Collagen I (COL I) and RUNX2: osteoblastic markers in both cell types; and Mineralization (staining with Alizarin red). The results obtained on hPDLF cultures showed that cell viability on 2D+BG was higher than on control at 3 days (p<0.05), and no significant difference between groups was observed at 7 and 10 days. The total protein content at 7 and 14 days was higher on 3D and 3D+BG cultures compared those on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) at 7 days. Significant difference was also observed between 3D and 2D at 14 days. The ALP activity at 7 days was higher on 2D and 2D+BG compared with 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), it was also lower on 3D+BG than on control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG showed higher ALP activity than control (p<0.05). Immunolabeling for OPN and ALP were observed in cells on 3D at both periods and on 2D, 2D+ BG and control only at 14 days. At 7 days, the expression of mRNA for PRT was upregulated on 3D and 3D+BG compared with control (p<0.05), for the FBM it was higher on 3D and 2D than on 3D+BG (p<0,05), but it was lower on 3D+BG than on control (p<0.05). Cells on 2D exhibited higher levels of S100A4 mRNA expression than those grown on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05). The mRNA levels expression for COL I and ALP on 2D+BG and 3D, and for RUNX2 and OPN on 3D and 2D, and for OC on 2D presented upregulated compared with control (p<0.05). Also, cells on 2D showed the level expression of OC higher than those on and 2D+BG (p<0.05). At 14 days, there was a decrease in all evaluated genes expression compared with 7 days analyses. Cells on 2D+BG expressed higher levels of PRT than on 3D+BG (p<0.05). 2D and 2D+BG showed the highest levels of mRNA expression for FBM. Gene expression of S100A4 on 2D was higher than on 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which the levels of S100A4 were downregulated compared to control. COL I and ALP were downregulated on 3D (p<0.05) and on 3D+BG (p<0.05) compared with control. There was also a significant difference between 2D+BG and 3D+BG for mRNA ALP expression. RUNX2 expression was higher on 3D than on 3D+BG (p<0.05), and OC expression was higher on control. Calcified matrix formation was observed on BG cultures at 10 and 14 days. At 10 days, areas stained by Alizarin were no observed by microscopy, but the amount of mineralization on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than on control (p<0.05), 2D (p<0.05) and 3D (p<0.05). At 14 days, more extensive staining was observed on cultures with BG, but the mineralized nodules formation was independent of the particles. Calcium content on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). Osteogenic cell cultures showed that cells grown on 3D and 3D+BG surfaces exhibited the lowest levels of cell viability. Significant differences were observed when 3D+BG was compared with 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) and also between 2D and 3D (p<0.05). At 3 and 10 days, there were no significant differences for cell viabililty between the cultures. The total protein content was higher on 3D+BG than on the control (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05) at 7 and 14 days. Significant differences were also observed between 3D and 2D (p<0.05) at 14 days. ALP activity at 7 days was higher on 2D+BG and 3D+BG. Significant differences were found between 2D and 2D+BG (p<0.05), 3D and 3D+BG (p<0.05), and between 3D and control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG had the lowest levels of ALP activity, significantly different from 2D (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05). Immunolabeling for OPN and BSP were observed at 7 days on 2D, 2D+BG, 3D and control. At 7 days, the expression levels of mRNA for ALP, COL I and RUNX2 were higher on 3D and 3D+BG. OPN, BSP and OC exhibited higher expression levels on 2D+BG. COL I expression was higher on 3D+BG than on 2D+BG (p<0.05). Cells on 2D+BG showed higher expression levels of OPN and OC than those on 2D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which both of these genes and BSP expression were downregulated compared with control. At 10 and 14 days areas stained with Alizarin red were observed all evaluated groups, especially on BG cultures. At 10 days the amount of calcium on 3D+BG was higher than on control (p<0.05), and it was also higher on 2D+BG compared with 2D (p<0.05) and control (p<0.05). At 14 days, 2D+BG and 3D+BG showed greater calcium amount than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). In conclusion, this study demonstrated that in vitro 3D cultures of hPDLF and osteogenic cells from newborn rats calvaria were able of support cell viability, differentiation, and to contribute to expression of fibroblastic and osteoblastic phenotype in hPDLF. The BG particles also favored the viability, differentiation, mineralized matrix formation and phenotypic expression in both cell types.

A Pseudoartrose Congênita da Tíbia (PCT) é uma das doenças mais desafiantes da ortopedia pediátrica pela dificuldade em obter a união óssea e, quando esta ocorre, em mantê-la. É uma doença muito rara, difícil de tratar devido à sua falta de conhecimento sobre a patogênese. As Células estromais mesenquimais multipotentes (CMM) podem desempenhar um papel na patogênese do PCT, possivelmente devido à falha da diferenciação osteogênica. O estudo das CMM pode ajudar a compreender a patogênese da doença e desenvolver novas estratégias terapêuticas baseados no uso desta célula no futuro próximo. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivo a análise das características biológicas das CMM isoladas de diferentes regiões anatômicas de medula óssea de pacientes com PCT. Para isto, amostras de medula óssea foram coletas a partir de locais afetados e não afetadas pela doença: Crista ilíaca do membro não afetada (CINA), crista ilíaca do membro afetada (CIA), tíbia não afetada (TNA), e tíbia afetada (TA). O numero de pacientes incluídos no estudo foi três: PCT1, PCT2 e PCT3. Os resultados mostraram que todas as células isoladas de pacientes com PCT apresentavam características compatíveis com as CMM. A taxa de formação de unidades formadoras de colônias das células da TA tanto no PCT2 quanto no PCT3 foi significativamente menor em relação às células da TNA e CINA respectivamente (p<0.05). A quantidade de células positivas para o marcador CD146 foi menor nas células da TA do PCT1 e PCT2, A análise estatística mostrou que não há uma diferença significativa. Este marcador esta relacionado com a capacidade multipotente e formação óssea in vivo. No PCT1 observou-se que formação de matriz mineralizada das CMM isoladas da CIA foi significativamente maior em relação a TA. Além disso, as células da TA do PCT1 observou-se um uma secreção significativa de alguns citocinas envolvidas no processo de formação óssea, como CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alfa, PDGF-BB, e GM-CSF. A alteração destas citocinas pode levar a situações complicadas como o caso de não consolidação óssea. Com os resultados obtidos, se há demonstrado que as CMM da tíbia afetada tenta formar osso, mas no local da lesão é insuficiente, por tal motivo é preciso realizar estudos focados no mecanismo molecular. / Congenital pseudoarthrosis of the tibia (CPT) is one of the most challenging orthopedic diseases because of the difficulty in obtaining bone union and, when it happens, in maintaining it. It is a rare disease, difficult-to-treat due to the lack of knowledge about to pathogenesis. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) may play a role in the pathogenesis of PCT, possibly due to a failure in the osteogenic differentiation. Studying these cells can help to better understand the pathogenesis of the disease and develop new therapeutic strategies based on the use of MSC in the near future. In view of the above, this work had the objective of analyzing the biological characteristics of CMM isolated from different anatomic regions of bone marrow of patients with PCT. For this, bone marrow samples were collected from sites affected and unaffected by the disease: unaffected limb iliac crest (CINA), affected limb iliac crest (CIA), unaffected tibia (TNA), and affected tibia (TA). The number of patients included in the study was three: PCT1, PCT2 and PCT3. The results showed that all cells isolated from PCT patients had characteristics compatible with CMM. The rate of formation of colonyforming units of TA cells in both PCT2 and PCT3 was significantly lower in TNA and CINA cells respectively (p <0.05). The amount of cells positive for the CD146 marker was lower in the TA cells of PCT1 and PCT2. Statistical analysis showed no significant difference. This marker is related to the multipotent capacity and bone formation in vivo. In PCT1 it was observed that the formation of mineralized matrix of CMCs isolated from CIA was significantly higher in relation to AT. In addition, PCT1 TA cells showed a significant secretion of some cytokines involved in the bone formation process, such as CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alpha, PDGF-BB, and GM-CSF. The alteration of these cytokines can lead to complicated situations such as the case of non-consolidation of bone. With the results obtained, if the CMM of the affected tibia has been shown to try to form bone, but at the site of the lesion is insufficient, it is necessary to carry out studies focused on the molecular mechanism.

A Pseudoartrose Congênita da Tíbia (PCT) é uma das doenças mais desafiantes da ortopedia pediátrica pela dificuldade em obter a união óssea e, quando esta ocorre, em mantê-la. É uma doença muito rara, difícil de tratar devido à sua falta de conhecimento sobre a patogênese. As Células estromais mesenquimais multipotentes (CMM) podem desempenhar um papel na patogênese do PCT, possivelmente devido à falha da diferenciação osteogênica. O estudo das CMM pode ajudar a compreender a patogênese da doença e desenvolver novas estratégias terapêuticas baseados no uso desta célula no futuro próximo. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivo a análise das características biológicas das CMM isoladas de diferentes regiões anatômicas de medula óssea de pacientes com PCT. Para isto, amostras de medula óssea foram coletas a partir de locais afetados e não afetadas pela doença: Crista ilíaca do membro não afetada (CINA), crista ilíaca do membro afetada (CIA), tíbia não afetada (TNA), e tíbia afetada (TA). O numero de pacientes incluídos no estudo foi três: PCT1, PCT2 e PCT3. Os resultados mostraram que todas as células isoladas de pacientes com PCT apresentavam características compatíveis com as CMM. A taxa de formação de unidades formadoras de colônias das células da TA tanto no PCT2 quanto no PCT3 foi significativamente menor em relação às células da TNA e CINA respectivamente (p<0.05). A quantidade de células positivas para o marcador CD146 foi menor nas células da TA do PCT1 e PCT2, A análise estatística mostrou que não há uma diferença significativa. Este marcador esta relacionado com a capacidade multipotente e formação óssea in vivo. No PCT1 observou-se que formação de matriz mineralizada das CMM isoladas da CIA foi significativamente maior em relação a TA. Além disso, as células da TA do PCT1 observou-se um uma secreção significativa de alguns citocinas envolvidas no processo de formação óssea, como CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alfa, PDGF-BB, e GM-CSF. A alteração destas citocinas pode levar a situações complicadas como o caso de não consolidação óssea. Com os resultados obtidos, se há demonstrado que as CMM da tíbia afetada tenta formar osso, mas no local da lesão é insuficiente, por tal motivo é preciso realizar estudos focados no mecanismo molecular. / Congenital pseudoarthrosis of the tibia (CPT) is one of the most challenging orthopedic diseases because of the difficulty in obtaining bone union and, when it happens, in maintaining it. It is a rare disease, difficult-to-treat due to the lack of knowledge about to pathogenesis. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) may play a role in the pathogenesis of PCT, possibly due to a failure in the osteogenic differentiation. Studying these cells can help to better understand the pathogenesis of the disease and develop new therapeutic strategies based on the use of MSC in the near future. In view of the above, this work had the objective of analyzing the biological characteristics of CMM isolated from different anatomic regions of bone marrow of patients with PCT. For this, bone marrow samples were collected from sites affected and unaffected by the disease: unaffected limb iliac crest (CINA), affected limb iliac crest (CIA), unaffected tibia (TNA), and affected tibia (TA). The number of patients included in the study was three: PCT1, PCT2 and PCT3. The results showed that all cells isolated from PCT patients had characteristics compatible with CMM. The rate of formation of colonyforming units of TA cells in both PCT2 and PCT3 was significantly lower in TNA and CINA cells respectively (p <0.05). The amount of cells positive for the CD146 marker was lower in the TA cells of PCT1 and PCT2. Statistical analysis showed no significant difference. This marker is related to the multipotent capacity and bone formation in vivo. In PCT1 it was observed that the formation of mineralized matrix of CMCs isolated from CIA was significantly higher in relation to AT. In addition, PCT1 TA cells showed a significant secretion of some cytokines involved in the bone formation process, such as CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alpha, PDGF-BB, and GM-CSF. The alteration of these cytokines can lead to complicated situations such as the case of non-consolidation of bone. With the results obtained, if the CMM of the affected tibia has been shown to try to form bone, but at the site of the lesion is insufficient, it is necessary to carry out studies focused on the molecular mechanism.

Fraturas cominutivas com grandes perdas ósseas são comuns em animais silvestres, sendo de maior prevalência em aves, devido a traumas, com a crescente urbanização e desmatamento. Um dos problemas para o tratamento dessas fraturas nesses animais é a dificuldade do uso de enxertia autógena, devido os locais de coleta não oferecerem material suficiente e pela alta taxa de morbidade. Assim, a engenharia de biomateriais vem desenvolvendo diversos dispositivos com a intenção de auxiliar nesse tratamento. O uso de cimento ósseo é crescente nesse meio, e tem como objetivo a recuperação e reintrodução do animal a seu habitat. O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso do cimento ósseo de hidroxiapatita deficiente em cálcio (HAD) associado ou não a proteína morfogenética óssea (BMP), para o tratamento do defeito crítico (DC) diafisário em ulna de galinhas domésticas. Foram utilizadas 32 aves, separadas em 4 grupos de 8 animais, sendo: controle negativo (GCN), controle positivo (GCP), cimento de HAD (GHAD) e cimento HAD associado a BMP (GHAD+BMP). Todos os animais passaram pelos procedimentos de ostectomia e a fixação dos fragmentos por meio da colocação de um pino intramedular de 1,5mm de forma retrógada, e acompanhados por período de 60 dias. Foram realizados exames radiográficos, análise histopatológica e biomecânica das ulnas. O presente trabalho demonstrou que não houve diferença significativa de consolidação entre os grupos com e sem BMP, porém o HAD+BMP apresentou-se mais eficiente para DC em galinhas na avaliação histopatológica, levando a resposta osteoindutora, por parte do cimento, e osteogênica, pela proteína. / Comminuted fractures with great bone loss are common in wild animals, being more present in birds due to trauma related to growing urbanization and deforestation. One of the problems of the treatment of these kinds of fractures in these animals is the difficulty of using autogenous grafting because collection places do not offer enough material and also because of the high morbidity rate. Therefore, biomaterials engineering has been developing several devices intending to help on this treatment. Therewith, the use of bone cement is increasing in this environment, and has as its goal the recovery and reintroduction of the animal to its habitat. The objective of this work was to evaluate the use of calcium deficient hydroxyapatite bone cement (HAD) for the treatment of diaphysialcritical defect (DC) in ulna of domestic hens. Thirty-two birds were used, divided in four groups of eight animals, being: negative control (GCN), positive control (GCP), HAD cement (GHAD) and HAD cement associated with bone morphogenetic protein (GHAD + BMP). All animals went through the procedure of ostectomy and fixation of the fragments by placing a 1.5mm intramedullary pin in a retrograde way, and assisted for a period of 60 postoperative days. Radiographic examinations, histopathological and biomechanical analysis of the ulna were performed.The present paper demonstrated that there was not a significant consolidation measure between the groups with no BMP, however HAD + BMP presented more efficient results for DC in hens in the histopathological evaluation, leading to an osteoinductive response by cement and osteogenic by the protein.

Fraturas cominutivas com grandes perdas ósseas são comuns em animais silvestres, sendo de maior prevalência em aves, devido a traumas, com a crescente urbanização e desmatamento. Um dos problemas para o tratamento dessas fraturas nesses animais é a dificuldade do uso de enxertia autógena, devido os locais de coleta não oferecerem material suficiente e pela alta taxa de morbidade. Assim, a engenharia de biomateriais vem desenvolvendo diversos dispositivos com a intenção de auxiliar nesse tratamento. O uso de cimento ósseo é crescente nesse meio, e tem como objetivo a recuperação e reintrodução do animal a seu habitat. O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso do cimento ósseo de hidroxiapatita deficiente em cálcio (HAD) associado ou não a proteína morfogenética óssea (BMP), para o tratamento do defeito crítico (DC) diafisário em ulna de galinhas domésticas. Foram utilizadas 32 aves, separadas em 4 grupos de 8 animais, sendo: controle negativo (GCN), controle positivo (GCP), cimento de HAD (GHAD) e cimento HAD associado a BMP (GHAD+BMP). Todos os animais passaram pelos procedimentos de ostectomia e a fixação dos fragmentos por meio da colocação de um pino intramedular de 1,5mm de forma retrógada, e acompanhados por período de 60 dias. Foram realizados exames radiográficos, análise histopatológica e biomecânica das ulnas. O presente trabalho demonstrou que não houve diferença significativa de consolidação entre os grupos com e sem BMP, porém o HAD+BMP apresentou-se mais eficiente para DC em galinhas na avaliação histopatológica, levando a resposta osteoindutora, por parte do cimento, e osteogênica, pela proteína. / Comminuted fractures with great bone loss are common in wild animals, being more present in birds due to trauma related to growing urbanization and deforestation. One of the problems of the treatment of these kinds of fractures in these animals is the difficulty of using autogenous grafting because collection places do not offer enough material and also because of the high morbidity rate. Therefore, biomaterials engineering has been developing several devices intending to help on this treatment. Therewith, the use of bone cement is increasing in this environment, and has as its goal the recovery and reintroduction of the animal to its habitat. The objective of this work was to evaluate the use of calcium deficient hydroxyapatite bone cement (HAD) for the treatment of diaphysialcritical defect (DC) in ulna of domestic hens. Thirty-two birds were used, divided in four groups of eight animals, being: negative control (GCN), positive control (GCP), HAD cement (GHAD) and HAD cement associated with bone morphogenetic protein (GHAD + BMP). All animals went through the procedure of ostectomy and fixation of the fragments by placing a 1.5mm intramedullary pin in a retrograde way, and assisted for a period of 60 postoperative days. Radiographic examinations, histopathological and biomechanical analysis of the ulna were performed.The present paper demonstrated that there was not a significant consolidation measure between the groups with no BMP, however HAD + BMP presented more efficient results for DC in hens in the histopathological evaluation, leading to an osteoinductive response by cement and osteogenic by the protein.

Submitted by LARISSA MENDES DE LÁZARI null (la_mendes@hotmail.com) on 2016-04-15T18:28:04Z No. of bitstreams: 1 TeseDoutorado_LarissaMendes_2016_Biotecnologia.pdf: 8907863 bytes, checksum: 3f7981847cc9e559ac7b11f4d8bfd245 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-04-18T19:50:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lazari_lm_dr_araiq_par.pdf: 1543856 bytes, checksum: 1cc6d6cd934ed8b9a35d1931133a26cd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T19:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lazari_lm_dr_araiq_par.pdf: 1543856 bytes, checksum: 1cc6d6cd934ed8b9a35d1931133a26cd (MD5) Previous issue date: 2016-03-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O desenvolvimento de biomateriais que promovam a reparação de tecidos lesionados tem sido objeto de intensa investigação. Em relação à reparação do tecido ósseo, as cerâmicas são materiais muito pesquisados em função de sua ampla possibilidade de uso, inclusive na confecção de pastas cimentícias moldáveis. A sílica mesoporosa apresenta elevada área de superfície específica (~1000 m2.g-1) e tamanho de poros usualmente em torno de 2-30 nm, atraindo atenção para aplicações como importantes carreadores de fármacos e proteínas. O peptídeo de crescimento osteogênico (OGP) é um tetradecapeptídeo endógeno, cuja forma ativa atua como agente anabólico e estimulador hematopoiético, promovendo a diferenciação osteoblástica. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um cimento ósseo injetável, reabsorvível e bioativo, com sílica mesoporosa e peptídeo de crescimento osteogênico. O peptídeo foi sintetizado pelo método em fase sólida, purificado por Cromatografia Líquida (HPLC) e caracterizado por Espectrometria de Massas. O material mesoporoso foi sintetizado pela metodologia sol-gel e sua porosidade confirmada por Adsorção-dessorção de N2, Espalhamento de Raios X à Baixo Ângulo e Microscopia Eletrônica de Transmissão. Os cimentos foram preparados a partir de sulfato de cálcio (CaS), fosfato de cálcio (CaP) e aluminato de cálcio (CaAl), sem e com sílica mesoporosa, e analisados quanto suas características físico-químicas. Os experimentos in vitro foram realizados para avaliar o potencial citotóxico e genotóxico dos cimentos em cultura de células de ovário (CHO-K1) e análise da viabilidade celular e formação da matriz mineralizada em células pré-osteosblásticas (MC3T3-E1). O estudo in vivo foi realizado em defeitos ósseos críticos em calvária de ratos e analisado quanto à formação de tecido ósseo, por histomorfometria, e densidade do tecido neoformado, por imagens de raios X. As análises dos cimentos demostraram que a presença de partículas de sílica mesoporosa promoveu diferentes comportamentos físico-químicos quando comparados aos cimentos sem sílica, como maior razão líquido/pó e, consequentemente, maior porosidade e menor resistência mecânica à compressão. Os cimentos CaP e CaAl, sem e com sílica, mostraram bioatividade in vitro quando imersos em solução que simula o fluido corpóreo (Simulated Body Fluid - SBF). No estudo de liberação do peptídeo OGP, incorporado nas partículas de sílica mesoporosa pré-misturada aos cimentos, o cimento CaS apresentou maior velocidade de liberação em relação aos cimentos estudados, com 80% do conteúdo peptídico liberado em 24 horas. Em relação à viabilidade celular, os cimentos CaS, com e sem sílica, não foram citotóxicos, mas os cimentos CaP e CaAl, apresentaram citotoxicidade; todavia esse comportamento não comprometeu a proliferação celular e nos ensaios de avaliação da mutagenicidade, os cimentos não promoveram dano celular significante. Os testes envolvendo células MC3T3-E1 mostraram que a viabilidade celular e a capacidade de formação da matriz mineralizada foram independentes da presença do peptídeo OGP, sendo mais sensível à presença de sílica e ao tempo de tratamento com os meios condicionados. Os resultados do teste in vivo, com os cimentos CaP, com e sem sílica mesoporosa e peptídeo OGP, demostraram que esses se degradaram e promoveram maior formação óssea durante os primeiros 15 dias pós-cirúrgico, com aproximadamente 30% do defeito preenchido por tecido neoformado, assim como maior densidade nas margens dos defeitos quando comparados com o controle. No entanto, a presença do peptídeo OGP foi significante somente nos primeiros 30 dias pós-cirúrgico de análise e não houve diferença estatística com o cimento com sílica e sem peptídeo. Além do mais, não houve diferença entre os grupos experimentais e o controle nos períodos mais tardios de análise. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que, dentre os cimentos estudados, aqueles com partículas de sílica mesoporosa e peptídeo OGP são os mais promissores para o reparo do tecido ósseo, principalmente nos períodos iniciais de cicatrização, devido ao seu potencial osteogênico. / The development of biomaterials that promote repair of injured tissues has been the subject of intense research. Regarding the bone tissue repair, ceramics are one of the most researched biomaterials groups due to its wide possibility of use, including cement pastes with good moldability. The mesoporous silica has high specific surface area (~1000 m2.g-1) and pore size usually around 2-30 nm attracting attention for its applications as drugs and proteins carriers. The osteogenic growth peptide (OGP) is an endogenous tetradecapeptide, whose active form acts as an anabolic agent and hematopoietic stimulator, promoting osteoblast differentiation. Thus, the aim of this study was to develop an injectable bone cement, resorbable and bioactive, mesoporous silica and osteogenic growth peptide. The peptide was synthesized by the solid phase method, purified by High Performande Liquid Chromatography (HPLC) and characterized by Mass Spectrometry. The mesoporous materials were synthesized by sol-gel method and its porosity confirmed by Adsorption-desorption of N2, Small-angle X-ray Scattering and Transmission Electronic Microscopy. Cements were prepared from calcium sulfate (CaS), calcium phosphate (CaP) and calcium aluminate (CaAl), without and with mesoporous silica, and analyzed for its physicochemical characteristics. In vitro experiments were carried out to evaluate the cements cytotoxic and genotoxic potential in CHO-K1 hamster ovary cell line and analysis of the mineralized matrix formation in MC3T3-E1 osteosblastics cell line. The in vivo study was performed in critical defects in rat calvaria, and it has analized as formation of bone tissue by histomorphometry and density of newly formed tissue by X-ray images. The cements analysis have shown that the presence of mesoporous silica particles promoted different physico-chemical behavior when compared to those without silica, such as higher ratio Liquid/Powder, higher porosity and, hence, decreases the mechanical resistance. CaP and CaAl cements showed bioactivity in vitro when immersed in Simulated Body Fluid solution. Concerning OGP liberation, the CaS cement showed the fastest release in the OGP-mesoporous silica-loaded cement release studies, releasing 80% peptide loaded in 24 hours. Regarding cell viability, CaS cements with and without silica, were not cytotoxic, but the CaP and CaAl cement showed cytotoxicity; however this behavior did not affect cell proliferation. And in mutagenicity tests, the cements did not promote significant cell damage. The tests involving MC3T3-E1 cells showed that cell viability and mineralized matrix formation capacity is independent of the OGP peptide presence and it is more sensitive to the presence of silica and the treatment time with the conditioned culture media. The test in vivo, with CaP cements, with and without mesoporous silica and OGP, demonstrated that these cements have degraded and promoted increased bone formation during the first 15 postoperative days, with approximately 30% of the defect filled by newly formed tissue as well as higher density on the defects borders when compared to the control. However, the presence of OGP peptide was significant only during the first 30 days postoperative, but there was no statistical difference with silica cement and without this peptide. Furthermore, there was no difference between experimental groups and the control in the later study periods. According to the results, it is concluded that, among the cements studied, those with mesoporous silica particles and OGP peptide are the most promising for bone tissue repair, especially in the initial stages of healing due to its osteogenic potential. / FAPESP: 2012/21735-6 / CAPES: 0224-13-8

Fraturas cominutivas com grandes perdas ósseas são comuns em animais silvestres, sendo de maior prevalência em aves, devido a traumas, com a crescente urbanização e desmatamento. Um dos problemas para o tratamento dessas fraturas nesses animais é a dificuldade do uso de enxertia autógena, devido os locais de coleta não oferecerem material suficiente e pela alta taxa de morbidade. Assim, a engenharia de biomateriais vem desenvolvendo diversos dispositivos com a intenção de auxiliar nesse tratamento. O uso de cimento ósseo é crescente nesse meio, e tem como objetivo a recuperação e reintrodução do animal a seu habitat. O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso do cimento ósseo de hidroxiapatita deficiente em cálcio (HAD) associado ou não a proteína morfogenética óssea (BMP), para o tratamento do defeito crítico (DC) diafisário em ulna de galinhas domésticas. Foram utilizadas 32 aves, separadas em 4 grupos de 8 animais, sendo: controle negativo (GCN), controle positivo (GCP), cimento de HAD (GHAD) e cimento HAD associado a BMP (GHAD+BMP). Todos os animais passaram pelos procedimentos de ostectomia e a fixação dos fragmentos por meio da colocação de um pino intramedular de 1,5mm de forma retrógada, e acompanhados por período de 60 dias. Foram realizados exames radiográficos, análise histopatológica e biomecânica das ulnas. O presente trabalho demonstrou que não houve diferença significativa de consolidação entre os grupos com e sem BMP, porém o HAD+BMP apresentou-se mais eficiente para DC em galinhas na avaliação histopatológica, levando a resposta osteoindutora, por parte do cimento, e osteogênica, pela proteína. / Comminuted fractures with great bone loss are common in wild animals, being more present in birds due to trauma related to growing urbanization and deforestation. One of the problems of the treatment of these kinds of fractures in these animals is the difficulty of using autogenous grafting because collection places do not offer enough material and also because of the high morbidity rate. Therefore, biomaterials engineering has been developing several devices intending to help on this treatment. Therewith, the use of bone cement is increasing in this environment, and has as its goal the recovery and reintroduction of the animal to its habitat. The objective of this work was to evaluate the use of calcium deficient hydroxyapatite bone cement (HAD) for the treatment of diaphysialcritical defect (DC) in ulna of domestic hens. Thirty-two birds were used, divided in four groups of eight animals, being: negative control (GCN), positive control (GCP), HAD cement (GHAD) and HAD cement associated with bone morphogenetic protein (GHAD + BMP). All animals went through the procedure of ostectomy and fixation of the fragments by placing a 1.5mm intramedullary pin in a retrograde way, and assisted for a period of 60 postoperative days. Radiographic examinations, histopathological and biomechanical analysis of the ulna were performed.The present paper demonstrated that there was not a significant consolidation measure between the groups with no BMP, however HAD + BMP presented more efficient results for DC in hens in the histopathological evaluation, leading to an osteoinductive response by cement and osteogenic by the protein.

O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença ou não de partículas de vidro bioativo. Fibroblastos derivados do ligamento periodontal humano (hPDLF) e células osteogênicas da calvária de rato recém-nascidos foram plaqueadas em superfícies bidimensionais - lamínulas de plástico ThermanoxTM (controle); superfícies colágenas bidimensionais - ThermanoxTM revestidas por colágeno I sem partículas de vidro bioativo (2D) e com partículas de vidro bioativo (2D+VB); e em gel colágeno tridimensional sem vidro bioativo (3D) e com partículas (3D+VB). Foram avaliados: Viabilidade celular (MTT) nos tempos 3, 7 e 10 dias; Atividade de fosfatase alcalina (ALP) normalizada pelo conteúdo de proteína total em 7 e 14 dias; Immunolocalização de proteínas da matriz não-colágena (ALP e OPN em células hPDLF aos 7 e 14 dias e OPN e BSP em células osteogênicas aos 7 dias) por imunofluorescência indireta; Expressão quantitativa (PCR em tempo real) dos genes Periostina (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) e Fibromodulina (FBM), marcadores do fenótipo fibroblástico, em células hPDLF e Fosfatase Alcalina (ALP), Osteopontina (OPN), Sialoproteína Óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Colágeno I (COL I) e Runx2, marcadores osteoblásticos, em ambos os tipos celulares; e Mineralização (coloração por vermelho de Alizarina). Os resultados obtidos nas culturas de hPDLF mostraram que aos 3 dias a viabilidade celular em 2D+VB foi maior que no controle (p<0,05) e nenhuma diferença significante entre os grupos foi observada aos 7 e 10 dias. O conteúdo de proteína total aos 7 e 14 dias foi maior nas culturas 3D e 3D+VB, sendo aos 7 dias significantemente diferente de 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05) e aos 14 dias observou-se diferença significativa entre 3D e 2D. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior nos grupos 2D e 2D+VB comparados com 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05); e em 3D+VB menor que no controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias 3D e 3D+VB apresentaram maior atividade de ALP que o controle (p<0,05). Imunomarcações para OPN e ALP foram observadas nas células em 3D em ambos os períodos avaliados, e em 2D, 2D+VB, e controle apenas aos 14 dias. A expressão de RNAm para PRT aos 7 dias apresentou um perfil upregulated em 3D e 3D+VB comparados ao controle (p<0,05); para FBM a expressão gênica foi maior em 3D e 2D que em 3D+VB (p<0,05), e menor em 3D+VB comparado ao controle (p<0,05). As células em 2D exibiram maiores níveis de expressão de RNAm para S100A4 que as cultivadas em 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05). Os níveis de RNAm para COL I e ALP em 2D+VB e 3D, para RUNX2 e OPN em 3D e 2D, e para OC em 2D apresentaram-se upregulated em relação ao controle (p<0,05). Em 2D o nível de expressão de OC foi maior que em 2D+VB (p<0,05). Aos 14 dias houve uma diminuição da expressão de todos os genes analisados em relação às análises de 7 dias. Células em 3D+VB expressaram menores níveis de PRT que em 2D+VB (p<0,05). A expressão de RNAm para FBM foi maior em 2D e 2D+VB e para S100A4 maior em 2D comparado com 3D (p<0,05), nos quais os níveis de S100A4 ficaram downregulated com relação ao controle. COL I e ALP apresentaram-se downregulated em 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05) em relação ao controle. Entre 2D+VB e 3D+VB também foi observada diferença significativa para ALP. A expressão de RUNX2 foi maior em 3D que em 3D+VB (p<0,05) e de OC maior no controle. Nos grupos com VB foi observada maior formação de matriz calcificada aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias não foram observadas áreas coradas por Alizarina através da microscopia, mas a quantidade de mineralização em 2D+VB e 3D+VB foi significativamente maior que no controle (p<0,05), 2D (p<0,05) e 3D (p<0,05). Aos 14 dias marcações mais extensas foram observadas nas culturas com VB, porém os nódulos mineralizados apresentavam-se independentes das partículas. 2D+VB e 3D+VB foram significativamente diferentes do controle (p<0,05) e 2D (p<0,05). As culturas de células osteogênicas mostraram que aos 7 dias as células crescidas sobre os arcabouços 3D+VB e 3D exibiram menores índices de viabilidade. Diferenças significativas foram observadas quando 3D+VB foi comparado aos grupos 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05); e entre 2D e 3D (p<0,05). Aos 3 e 10 dias não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos. O conteúdo de proteína total foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05) e no controle (p<0,05) aos 7 e 14 dias. Diferenças significantes também foram observadas entre 3D e 2D (p<0,05) aos 14 dias. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior em 2D+VB e 3D+VB. Diferenças significantes foram encontradas entre 2D e 2D+VB (p<0,05), 3D e 3D+VB (p<0,05) e entre 3D e controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias, 3D e 3D+VB apresentaram os menores valores de atividade de ALP, sendo a significantemente diferentes de 2D (p<0,05) e 2D+VB (p<0,05). Imunomarcações para OPN e BSP foram observadas aos 7 dias em 2D, 2D+VB, 3D e controle. Aos 7 dias os níveis expressão do RNAm para ALP, COL I e RUNX2 foram maiores em 3D e 3D+VB. Os genes OPN, OC e BSP exibiram níveis de expressão mais altos em 2D+VB. A expressão de COL I foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05). As células em 2D+VB apresentaram maiores níveis de expressão de OPN e OC que em 2D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05), nos quais a expressão desses genes e de BSP estavam downregulated em relação ao grupo controle. Aos 10 e 14 dias áreas coradas por vermelho de Alizarina foram observadas em todos os grupos, sendo mais extensas nos grupos que continham VB. Aos 10 dias a quantidade de cálcio em 3D+VB foi maior que no controle (p<0,05); e maior em 2D+VB comparado com 2D (p<0,05) e controle (p<0,05). Aos 14 dias 2D+VB e 3D+VB apresentaram uma quantidade de cálcio significativamente maior que no controle (p<0,05) e em 2D (p<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou que os arcabouços tridimensionais colágenos são capazes de suportar a viabilidade, proliferação e diferenciação celular se in vitro de hPDLF e células osteogênicas derivadas de calvária de rato recém-nascidos e de favorecerem a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em hPDLF. As partículas de VB em ambos os tipos celulares também contribuiram para viabilidade, diferenciação, formação de matriz mineralizada e expressão fenotípica. / The aim of this study was to analyze the fibroblastic and osteoblastic phenotypes expression on three-dimensional cultures in the presence or not of bioactive glass particles. Fibroblasts derived from human periodontal ligament (hPDLF) and osteogenic cells from newborn rat calvaria were cultured on bi-dimensional surfaces - plastic coverslips ThermanoxTM (control), bi-dimensional collagen surfaces - ThermanoxTM coated with collagen I without bioactive glass particles (2D) and with bioactive glass particles (2D+BG), on three-dimensional collagen gel without bioactive glass (3D) and with particles (3D+BG). Were evaluated: Cell viability (MTT) in 3 days, 7 and 10 days; Phosphatase alkaline activity (ALP) normalized by total protein content at 7 and 14 days; Immunolocalization of non-matrix proteins collagen (ALP and OPN in hPDLF at 7 and 14 days, OPN and BSP in osteogenic cells at 7 days) by indirect immunofluorescence; Genes expression (real-time PCR) for Periostin (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) and Fibromodulin (FBM): fibroblastic markers in hPDLF, and Alkaline phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Collagen I (COL I) and RUNX2: osteoblastic markers in both cell types; and Mineralization (staining with Alizarin red). The results obtained on hPDLF cultures showed that cell viability on 2D+BG was higher than on control at 3 days (p<0.05), and no significant difference between groups was observed at 7 and 10 days. The total protein content at 7 and 14 days was higher on 3D and 3D+BG cultures compared those on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) at 7 days. Significant difference was also observed between 3D and 2D at 14 days. The ALP activity at 7 days was higher on 2D and 2D+BG compared with 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), it was also lower on 3D+BG than on control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG showed higher ALP activity than control (p<0.05). Immunolabeling for OPN and ALP were observed in cells on 3D at both periods and on 2D, 2D+ BG and control only at 14 days. At 7 days, the expression of mRNA for PRT was upregulated on 3D and 3D+BG compared with control (p<0.05), for the FBM it was higher on 3D and 2D than on 3D+BG (p<0,05), but it was lower on 3D+BG than on control (p<0.05). Cells on 2D exhibited higher levels of S100A4 mRNA expression than those grown on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05). The mRNA levels expression for COL I and ALP on 2D+BG and 3D, and for RUNX2 and OPN on 3D and 2D, and for OC on 2D presented upregulated compared with control (p<0.05). Also, cells on 2D showed the level expression of OC higher than those on and 2D+BG (p<0.05). At 14 days, there was a decrease in all evaluated genes expression compared with 7 days analyses. Cells on 2D+BG expressed higher levels of PRT than on 3D+BG (p<0.05). 2D and 2D+BG showed the highest levels of mRNA expression for FBM. Gene expression of S100A4 on 2D was higher than on 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which the levels of S100A4 were downregulated compared to control. COL I and ALP were downregulated on 3D (p<0.05) and on 3D+BG (p<0.05) compared with control. There was also a significant difference between 2D+BG and 3D+BG for mRNA ALP expression. RUNX2 expression was higher on 3D than on 3D+BG (p<0.05), and OC expression was higher on control. Calcified matrix formation was observed on BG cultures at 10 and 14 days. At 10 days, areas stained by Alizarin were no observed by microscopy, but the amount of mineralization on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than on control (p<0.05), 2D (p<0.05) and 3D (p<0.05). At 14 days, more extensive staining was observed on cultures with BG, but the mineralized nodules formation was independent of the particles. Calcium content on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). Osteogenic cell cultures showed that cells grown on 3D and 3D+BG surfaces exhibited the lowest levels of cell viability. Significant differences were observed when 3D+BG was compared with 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) and also between 2D and 3D (p<0.05). At 3 and 10 days, there were no significant differences for cell viabililty between the cultures. The total protein content was higher on 3D+BG than on the control (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05) at 7 and 14 days. Significant differences were also observed between 3D and 2D (p<0.05) at 14 days. ALP activity at 7 days was higher on 2D+BG and 3D+BG. Significant differences were found between 2D and 2D+BG (p<0.05), 3D and 3D+BG (p<0.05), and between 3D and control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG had the lowest levels of ALP activity, significantly different from 2D (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05). Immunolabeling for OPN and BSP were observed at 7 days on 2D, 2D+BG, 3D and control. At 7 days, the expression levels of mRNA for ALP, COL I and RUNX2 were higher on 3D and 3D+BG. OPN, BSP and OC exhibited higher expression levels on 2D+BG. COL I expression was higher on 3D+BG than on 2D+BG (p<0.05). Cells on 2D+BG showed higher expression levels of OPN and OC than those on 2D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which both of these genes and BSP expression were downregulated compared with control. At 10 and 14 days areas stained with Alizarin red were observed all evaluated groups, especially on BG cultures. At 10 days the amount of calcium on 3D+BG was higher than on control (p<0.05), and it was also higher on 2D+BG compared with 2D (p<0.05) and control (p<0.05). At 14 days, 2D+BG and 3D+BG showed greater calcium amount than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). In conclusion, this study demonstrated that in vitro 3D cultures of hPDLF and osteogenic cells from newborn rats calvaria were able of support cell viability, differentiation, and to contribute to expression of fibroblastic and osteoblastic phenotype in hPDLF. The BG particles also favored the viability, differentiation, mineralized matrix formation and phenotypic expression in both cell types.

Bone transplantation is regarded as the preferred therapy to treat a variety of bone defects. Autologous bone tissue is often lacking at the source, and the mesenchymal stem cells (MSCs) responsible for bone repair mechanisms are extracted by invasive procedures. This study explores the potential of autologous mesenchymal stem cells derived from the hair follicle outer root sheath (MSCORS). We demonstrated that MSCORS have a remarkable capacity to differentiate in vitro towards the osteogenic lineage. Indeed, when combined with a novel gelatin-based hydrogel called Osteogel, they provided additional osteoinductive cues in vitro that may pave the way for future application in bone regeneration. MSCORS were also compared to MSCs from adipose tissue (ADMSC) and bone marrow (BMMSC) in a 3D Osteogel model. We analyzed gel plasticity, cell phenotype, cell viability, and differentiation capacity towards the osteogenic lineage by measuring alkaline phosphatase (ALP) activity, calcium deposition, and specific gene expression. The novel injectable hydrogel filled an irregularly shaped lesion in a porcine wound model displaying high plasticity. MSCORS in Osteogel showed a higher osteo-commitment in terms of calcium deposition and expression dynamics of OCN, BMP2, and PPARG when compared to ADMSC and BMMSC, whilst displaying comparable cell viability and ALP activity. In conclusion, autologous MSCORS combined with our novel gelatin-based hydrogel displayed a high capacity for differentiation towards the osteogenic lineage and are acquired by non-invasive procedures, therefore qualifying as a suitable and expandable novel approach in the field of bone regeneration therapy