Phosphorylierung und Dephosphorylierung gehören zu den zentralen Regulationsmechanismen jeder Zelle. Während einer der bekanntesten Signalwege, der Mitogen-aktivierte Protein-Kinase(MAPK)-Signalweg bereits intensiv untersucht wurde, ist über die MAPK-Phosphatasen als wesentliche Inaktivatoren dieser Signalwegfamilie bisher nur wenig bekannt. Die MAPK-Signalwege sind in Tumoren häufig aktiv. Dies ließe sich durch aktivierende Mutationen der Kinasen oder ihrer übergeordneten Rezeptoren erklären. Ein anderer Ansatz geht von der stromalen Entzündungsreaktion aus, die viele solide Tumoren begleitet. Zytokine, die durch die Entzündungszellen gebildet werden, sind physiologische Aktivatoren der MAPK und eine fehlende Gegenregulation durch inaktivierende Phosphatasen würde ebenso zu hoher Aktivität der MAPK führen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein solches Entzündungsgeschehen in Ovarialkarzinomzellinien simuliert und die Reaktion der Phosphatasen MKP-1 und MKP-3 auf proinflammatorische Zytokine untersucht. MKP-1 und MKP-3 reagierten mit erheblichen Unterschieden auf die Zugabe proinflammatorischer Zytokine, das Reaktionsmuster reichte von starker Aktivierung (MKP-1 in SKOV-3 und OVCAR-3) bis hin zu verringerter Aktivität der Phosphatasen (MKP-1 in OAW42 und CAOV-3). Zur Ergänzung der Zellkulturstudien wurde die Expression der Phosphatase MKP-1 in primären Ovarialkarzinomen, Zystadenomen sowie gesunden Ovarien immunhistochemisch untersucht. Der Proteinnachweis in insgesamt 101 Gewebeproben ergab eine signifikant geringere Expression der Phosphatase MKP-1 in Karzinomen im Vergleich zu normalem Ovarialepithel oder Zystadenomen. Innerhalb der Gruppe der Karzinome zeigte die MKP-1-Expression dennoch eine hohe Varianz, hierbei waren Malignome mit deutlicher MKP-1-Expression mit einer wesentlich schlechteren Prognose der Erkrankung verbunden. Die Phosphatase war in der multivariaten Analyse des rezidivfreien Überlebens ein unabhängiger Prognoseparameter (RR=4,03; 95%CI=1,72-9,48; p=0,001). Ein kürzeres rezidivfreies Überleben ist häufig mit der frühen Entwicklung von Chemoresistenzen verbunden. Ein möglicher Zusammenhang zwischen der Phosphatase MKP-1 und Chemoresistenz wurde in Zellkulturversuchen unter Verwendung von Cisplatin, einem wesentlichen Bestandteil der Standardchemotherapie bei Ovarialkarzinomen, untersucht. Die Expression der MKP-1 konnte durch Zugabe von Cisplatin deutlich induziert werden. Bemerkenswerterweise zeigten resistente Zellinien dabei eine frühe Reaktion, sensible Zellen reagierten deutlich verzögert. Diese frühe Induktion der MKP-1 könnte die therapeutisch induzierte Apoptose blockieren. Weitere Erkenntnisse über die daran beteiligten Signalwege sowie pharmakologische Inhibitoren der Phosphatasen sind daher vielversprechende Ansätze zur Optimierung der Chemotherapie. / Protein phosphorylation and dephosphorylation is a central regulatory system of cells. The mitogen-activated-protein-kinase(MAPK)-pathway as a typical example is one of the most investigated signalling pathways in cancers. In contrast, much less is known about MAPK-phosphatases, their physiological inactivators. MAPK pathways are frequently up-regulated in cancers. This might be explained by activating mutations of kinases or of up-stream receptors. Another view is based on the inflammatory stroma infiltrate that accompanies most solid carcinomas. Cytokines produced by inflammatory cells are physiological activators of MAPK pathways and missing balance of inactivating phosphatases would also result in up-regulated MAPK pathways. In this study, such an inflammatory situation was simulated in cell culture models and expression patterns of MAPK-phosphatases MKP-1 and MKP-3 were investigated after addition of proinflammatory cytokines. The expression of MKP-1 and MKP-3 after cytokine addition differed widely between the ovarian cancer cell lines investigated, ranging from strong induction in SKOV-3 and OVCAR-3 to down-regulation of phosphatases in OAW42 and CAOV-3. In addition to cell culture experiments, expression of MKP-1 was examined immunohistochemically in primary ovarian cancers, adenomas and normal ovaries (total of 101 samples). There was a lower expression of phosphatase MKP-1 in ovarian cancers compared to surface epithelium of normal ovaries and cystadenomas. However, MKP-1 expression in the group of carcinomas showed a high variation, including also a number of negative cases. Among all investigated cancer samples, those with a higher expression of MKP-1 were associated with poorer prognosis. Multivariate survival analysis revealed this phosphatase as an independant prognostic factor for progression-free survival (RR=4,03; 95%CI=1,72-9,48; p=0,001). Short progression-free survival is usually associated with early development of chemoresistance. Consequently, poor prognosis might result from different efficiencies of initial adjuvant chemotherapeutical treatments. Based on this presumption, the effects of cisplatin, a typically used drug against ovarian cancer, were investigated in cell culture. The phosphatase MKP-1 was highly inducable by cisplatin, remarkably as early reaction in cisplatin-resistant cell lines and with distinct delay in sensitive cells. This early induction of MKP-1 in resistant cells might block drug-induced apoptosis. Further studies about influencing pathways and pharmacological inhibitors of phosphatase MKP-1 might be promising efforts to optimize chemotherapy.

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Das Ovarialkarzinom ist eines der tödlichsten Malignome in der Gynäkologie und birgt eine große therapeutische Herausforderung. Trotz Platin und Taxan haltiger Chemotherapie liegt die Rezidivrate des Ovarialkarzinoms bei 70%. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) gilt aufgrund seiner Eigenschaft spezifisch in Krebszellen Apoptose zu induzieren ohne normalen Körperzellen zu schaden in der Krebsforschung als vielversprechendes Therapeutikum. Seit einiger Zeit ist jedoch ersichtlich, dass 50% der Zelllinien und die Mehrheit aller primären humanen Krebszellen resistent für TRAIL induzierte Apoptose sind (Koschny, Walczak et al. 2007) und zunächst sensitiviert werden müssen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass primäre Ovarialkarzinomzellen die mit Hilfe von EpCAM Dynabeads aus der Aszites von Krebspatientinnen isoliert wurden, sowohl mit Bortezomib (Proteasominhibitor) als auch mit PIK75 (PI3K- Inhibitor)spezifisch für TRAIL induzierte Apoptose sensitiviert werden konnten. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass diese Kombinationstherapie normale hämatopoietische Zellen nicht beschädigt. Dies bekräftigt vor allem die Eigenschaft von TRAIL, krebszellspezifisch Apoptose zu induzieren. Wichtig ist vor allem, dass diese Kombinationstherapie sogar Chemotherapie resistente primäre Ovarialkarzinomzellen in Apoptose führen konnte.

Mehrere Studien haben gezeigt, daß die Cyclooxygenase-2 (COX-2) eine bedeutende Rolle sowohl bei Entstehung als auch Progression maligner Tumoren spielt. COX-2-Inhibitoren werden bereits in klinischen Studien zur Krebstherapie getestet. COX-2 ist die induzierbare Isoform der Cyclooxygenase - dem Schlüsselenzym der Synthese von Prostaglandinen und anderen Eicosanoiden. Im Tier- und Zellkulturmodell konnten COX-Hemmer anti-Tumor-Effekte hervorrufen. Es ist jedoch unklar, ob diese Effekte durch Hemmung des COX-Enzyms oder durch COX-unabhängige Mechanismen vermittelt werden. Wir untersuchten daher die Auswirkung der COX-Inhibition zum einen durch den selektiven COX-2-Hemmer NS-398 sowie zum anderen durch COX-Isoform-spezifische RNA-Interferenz (RNAi) in zwei humanen Ovarialkarzinomzellinien (OVCAR-3 und SKOV-3). OVCAR-3 zeigte eine konstitutive COX-1-Expression und eine durch IL-1beta induzierbare COX-2-Expression. SKOV-3 war COX-1- und COX-2-negativ. IL-1beta führte bei OVCAR-3 zu einer vermehrten Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2), die durch eine gegen die COX-2 gerichtete siRNA gehemmt werden konnte, wohingegen COX-1-siRNA keinen Effekt hatte. Das deutet darauf hin, daß die COX-2 die Hauptquelle von PGE2 in OVCAR-3 ist. 1mikroM NS-398 waren ausreichend, um die PGE2-Produktion und somit auch die COX-2 in OVCAR-3 zu inhibieren. Höhere Konzentrationen NS-398 (>10mikroM) hatten einen antiproliferativen Effekt. Auch in der COX-2-negativen Zellinie SKOV-3 trat diese Wachstumshemmung auf; sie war nicht durch exogene Zufuhr von PGE2 (10mikroM) reversibel. Durchflußzytometrische Zellzyklusanalyse ergab, daß der Wachstumshemmung in beiden Zellinien ein G0/G1-Zellzyklusarrest zugrunde liegt. Dagegen führten weder COX-1- noch COX-2-Ausschaltung durch RNAi zu ähnlichen Auswirkungen auf Proliferation bzw. Zellzyklus. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein COX-2-unabhängiger Mechanismus für den durch NS-398 induzierten G0/G1-Arrest verantwortlich ist. / Several studies have provided evidence that the enzyme Cyclooxygenase-2 (COX-2) plays an important role in tumor development and progression. COX-2-inhibitors are already evaluated in clinical trials as cancer therapeutics. COX-2 is the inducible isoform of cyclooxygenase - the rate-limiting enzyme in the synthesis of prostaglandins and other eicosanoids. COX-inhibitors cause antitumor effects in animal models and in cell culture experiments. However, it is not clear, whether these effects are due to inhibition of the COX-enzyme or mediated via a COX-independent mechanism. We therefore investigated the effects of COX inhibition by the selective COX-2-inhibitor NS-398, as well as by COX-isoform specific RNA interference (RNAi) in the human ovarian carcinoma cell lines OVCAR-3 and SKOV-3. OVCAR-3 cells showed a constitutive expression of COX-1, and an inducible COX-2 expression. COX-2 was induced through stimulation with Interleukin-1beta, leading to production of high levels of Prostaglandin E2 (PGE2). SKOV-3 cells were negative for both COX isoforms. Selective COX-2-suppression by RNAi reduced PGE2 production in OVCAR-3, whereas COX-1-siRNA had no effect on PGE2 synthesis. Thus, COX-2 is the main source of PGE2 in OVCAR-3 cells. In these cells, 1microM NS-398 was sufficient to completely inhibit PGE2-synthesis - and thus the activity of the COX-2 enzyme. Increasing amounts of NS-398 (>10microM) had an antiproliferative effect. This growth inhibition was also observed in the COX-negative cell line SKOV-3, it could not be reverted by exogenous addition of PGE2 (10microM). Flowcytometric analysis of the cell cycle revealed that this growth inhibition was based on a G0/G1-cell-cycle-arrest. In contrast, suppression of COX-1 or COX-2 by RNAi had no effect on proliferation or cell cycle progression. These results suggest that a COX-independent mechanism is responsible for the G0/G1-arrest induced by NS-398.

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