Thesis (Ph. D.)--School of Pharmacy and Dept. of Chemistry. University of Missouri--Kansas City, 2004. / "A dissertation in pharmaceutical sciences and chemistry." Advisor: Ashim K. Mitra. Typescript. Vita. Description based on contents viewed Feb. 23, 2006; title from "catalog record" of the print edition. Includes bibliographical references (leaves 142-169). Online version of the print edition.

Thesis (Ph. D.)--School of Pharmacy and Dept. of Chemistry. University of Missouri--Kansas City, 2004. / "A dissertation in pharmaceutical science and chemistry." Advisor: Ashim K. Mitra. Typescript. Vita. Description based on contents viewed Feb. 27, 2006; title from "catalog record" of the print edition. Includes bibliographical references (leaves 175-199). Online version of the print edition.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 177-200).

A P-glicoproteína (P-gp) é uma transportadora transmembrana de múltiplos fármacos, produto do gene MDR1 (ABCB1). A P-gp contribui para a função de barreira de vários tecidos e órgãos, funcionando como uma bomba de efluxo para muitos substratos. Diminuição na expressão desta proteína é associada à sensibilidade a fármacos. Cães da linhagem dos Collies possuem uma alta incidência de uma mutação no gene MDR1, denominada nt230(del4). Animais homozigotos para a mutação apresentam a supressão total de uma P-gp funcional e um animal heterozigoto apresenta uma maior sensibilidade para substratos da P-gp, devido a uma diminuição na expressão da mesma. Alguns fármacos opioides, como a morfina e a metadona, foram identificados como substratos da P-gp. O tramadol é um dos analgésicos opioides mais utilizados em cães. No presente trabalho, a mutação MDR1 nt230(del4) foi analisada em vinte cães Collie, utilizando reação em cadeia de polimerase (PCR). A identificação foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução, sendo o resultado confirmado por análise de sequênciamento de DNA. Como resultado, seis cães apresentaram normalidade nos dois alelos e 14 apresentaram heterozigose para a mutação. Estes animais foram submetidos à segunda fase do experimento, quando se administrou uma dose única de 100 mg de tramadol oral de liberação prolongada (SR), objetivando investigar o tramadol como sendo substrato da P-gp. Outro objetivo foi avaliar a farmacocinética deste tipo de formulação, pois ainda não foi estabelecida para cães. A análise farmacocinética do tramadol foi realizada utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por espectrometria de massas para a determinação e quantificação de tramadol no soro canino. O analito e o padrão interno foram extraídos do soro por método líquido-líquido. A separação cromatográfica foi obtida a partir de uma coluna analítica C18, mantida a 30°C, sob condições isocráticas de uma fase móvel constituída por uma mistura de acetonitrila e ácido fórmico a 0,1% (80:20). A concentração de tramadol no soro foi maior do que o limite de quantificação (LOQ), em 17 cães. Os cães foram divididos em dois grupos, cães normais (MDR1 +/+) e heterozigotos (MDR1 +/-). Os cálculos farmacocinéticos para o tramadol oral SR obtiveram valores médios de concentração máxima no soro (Cmax) de 63,12 ng/mL ± 33,35 para o grupo normal e 58,00 ng/mL ± 27,29 para o grupo heterozigoto. Tmax (tempo de concentração plasmática maxima) foi de 4 h para ambos os grupos e t ½ (meia-vida) foram 2,85 h ± 1,61 e 2,81 ± 1,46 h para os cães normais e heterozigotos, respectivamente. A área sob a curva (AUC) média para o tramadol oral SR para o grupo normal e heterozigoto foram 350,20 ± 216,61 e 312,15 ± 155,43 ng.h/mL, respectivamente. A biodisponibilidade foi de 22% e 23% para os cães normais e heterozigotos, respectivamente. Não houve diferença estatística entre os grupos em todos os parâmetros farmacocinéticos. Os resultados sugerem que o tramadol não é um substrato da Pgp. A quantidade de dados farmacocinéticos do tramadol oral na formulação de liberação prolongada (SR) em cães é escassa, sendo necessários mais estudos farmacocinéticos e farmacodinâmicos para o tramadol oral de liberação prolongada em cães para estabelecer adequada dose e frequência de administração em cães. / The P-glycoprotein (P-gp) is a transmembrane multidrug transporter, product of the MDR1 (ABCB1) gene. P-gp contributes to the barrier function of several tissues and organs, acting as an efflux pump for many substrates. Decreased expression of this protein is associated with sensitivity to drugs. Collie dogs have a high incidence of a mutation in MDR1 gene, denominated MDR1 nt230 (del4). In homozygosis, this mutation results in the total absence of a functional P-gp and a heterozygote animal presents a greater sensibility to P-gp substrates, probably due to a decrease in the expression thereof. Some opioid drugs such as morphine and methadone were identified as P-gp substrates. Tramadol is one of the most commonly opioid used in dogs. In the present work MDR1nt230 (del4) mutation was analyzed in 20 healthy Collie dogs using allele-specific polymerase chain reaction (PCR) method. Thereby, 6 homozygous intact and 14 heterozygous mutated MDR1 genotypes can be differentiated by high resolution polyacrylamide gel electrophoresis, confirmed by DNA sequence analysis. These animals underwent the second phase of the experiment, when a single oral administration of 100 mg of sustained release (SR) tramadol was administrated to investigate the tramadol as P-gp substrate. In addition, another aim was evaluate the pharmacokinetics of sustained release formulation, which has not been established for dogs. Pharmacokinetic analysis of tramadol was evaluated using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometry for determination and quantification of tramadol in canine serum. The analyte and internal standard (IS) were extracted from serum using liquid-liquid method. Chromatographic separation was achieved on a C18 analytical column, kept at 30°C, under isocratic conditions of a mobile phase consisted by a mixture of acetonitrile and water contained 0,1% formic acid (80:20). Serum tramadol concentration was greater than the limit of quantification (LOQ) in 17 dogs. The dogs were divided into two groups, normal dogs (MDR1 +/+) and heterozygous (MDR1 +/-) according to the MDR1 genotype. The median values of maximum serum concentration (Cmax) were 63.13 ng/mL ± 33.35 for the normal group and 58.01 ng/mL ± 27.29 for the heterozygous group. Tmax (time to maximum serum concentration) was 4 h for both groups and t ½ (half-life) were 2,85h ± 1,61 e 2,81h ± 1,46 for normal and heterozygous dogs, respectively. The mean area-under-the-curve (AUC) values for the sustained release tramadol compounds for the normal and heterozygous group were 350,20 ±216,61 and 312,15 ± 155,43 ng.h/mL, respectively. The bioavailability was 22% and 23% for normal and heterozygous dogs respectively. There was no statistic difference between groups in all pharmacokinetics parameters. The findings suggest that tramadol is not a P-gp substrate. The amount of pharmacokinetics data of SR formulation of tramadol in dogs is sparse. Therefore, more studies of oral SR tramadol in dogs are needed to establish appropriate dose and frequency of administration in dogs.

A P-glicoproteína (P-gp) é uma transportadora transmembrana de múltiplos fármacos, produto do gene MDR1 (ABCB1). A P-gp contribui para a função de barreira de vários tecidos e órgãos, funcionando como uma bomba de efluxo para muitos substratos. Diminuição na expressão desta proteína é associada à sensibilidade a fármacos. Cães da linhagem dos Collies possuem uma alta incidência de uma mutação no gene MDR1, denominada nt230(del4). Animais homozigotos para a mutação apresentam a supressão total de uma P-gp funcional e um animal heterozigoto apresenta uma maior sensibilidade para substratos da P-gp, devido a uma diminuição na expressão da mesma. Alguns fármacos opioides, como a morfina e a metadona, foram identificados como substratos da P-gp. O tramadol é um dos analgésicos opioides mais utilizados em cães. No presente trabalho, a mutação MDR1 nt230(del4) foi analisada em vinte cães Collie, utilizando reação em cadeia de polimerase (PCR). A identificação foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução, sendo o resultado confirmado por análise de sequênciamento de DNA. Como resultado, seis cães apresentaram normalidade nos dois alelos e 14 apresentaram heterozigose para a mutação. Estes animais foram submetidos à segunda fase do experimento, quando se administrou uma dose única de 100 mg de tramadol oral de liberação prolongada (SR), objetivando investigar o tramadol como sendo substrato da P-gp. Outro objetivo foi avaliar a farmacocinética deste tipo de formulação, pois ainda não foi estabelecida para cães. A análise farmacocinética do tramadol foi realizada utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por espectrometria de massas para a determinação e quantificação de tramadol no soro canino. O analito e o padrão interno foram extraídos do soro por método líquido-líquido. A separação cromatográfica foi obtida a partir de uma coluna analítica C18, mantida a 30°C, sob condições isocráticas de uma fase móvel constituída por uma mistura de acetonitrila e ácido fórmico a 0,1% (80:20). A concentração de tramadol no soro foi maior do que o limite de quantificação (LOQ), em 17 cães. Os cães foram divididos em dois grupos, cães normais (MDR1 +/+) e heterozigotos (MDR1 +/-). Os cálculos farmacocinéticos para o tramadol oral SR obtiveram valores médios de concentração máxima no soro (Cmax) de 63,12 ng/mL ± 33,35 para o grupo normal e 58,00 ng/mL ± 27,29 para o grupo heterozigoto. Tmax (tempo de concentração plasmática maxima) foi de 4 h para ambos os grupos e t ½ (meia-vida) foram 2,85 h ± 1,61 e 2,81 ± 1,46 h para os cães normais e heterozigotos, respectivamente. A área sob a curva (AUC) média para o tramadol oral SR para o grupo normal e heterozigoto foram 350,20 ± 216,61 e 312,15 ± 155,43 ng.h/mL, respectivamente. A biodisponibilidade foi de 22% e 23% para os cães normais e heterozigotos, respectivamente. Não houve diferença estatística entre os grupos em todos os parâmetros farmacocinéticos. Os resultados sugerem que o tramadol não é um substrato da Pgp. A quantidade de dados farmacocinéticos do tramadol oral na formulação de liberação prolongada (SR) em cães é escassa, sendo necessários mais estudos farmacocinéticos e farmacodinâmicos para o tramadol oral de liberação prolongada em cães para estabelecer adequada dose e frequência de administração em cães. / The P-glycoprotein (P-gp) is a transmembrane multidrug transporter, product of the MDR1 (ABCB1) gene. P-gp contributes to the barrier function of several tissues and organs, acting as an efflux pump for many substrates. Decreased expression of this protein is associated with sensitivity to drugs. Collie dogs have a high incidence of a mutation in MDR1 gene, denominated MDR1 nt230 (del4). In homozygosis, this mutation results in the total absence of a functional P-gp and a heterozygote animal presents a greater sensibility to P-gp substrates, probably due to a decrease in the expression thereof. Some opioid drugs such as morphine and methadone were identified as P-gp substrates. Tramadol is one of the most commonly opioid used in dogs. In the present work MDR1nt230 (del4) mutation was analyzed in 20 healthy Collie dogs using allele-specific polymerase chain reaction (PCR) method. Thereby, 6 homozygous intact and 14 heterozygous mutated MDR1 genotypes can be differentiated by high resolution polyacrylamide gel electrophoresis, confirmed by DNA sequence analysis. These animals underwent the second phase of the experiment, when a single oral administration of 100 mg of sustained release (SR) tramadol was administrated to investigate the tramadol as P-gp substrate. In addition, another aim was evaluate the pharmacokinetics of sustained release formulation, which has not been established for dogs. Pharmacokinetic analysis of tramadol was evaluated using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometry for determination and quantification of tramadol in canine serum. The analyte and internal standard (IS) were extracted from serum using liquid-liquid method. Chromatographic separation was achieved on a C18 analytical column, kept at 30°C, under isocratic conditions of a mobile phase consisted by a mixture of acetonitrile and water contained 0,1% formic acid (80:20). Serum tramadol concentration was greater than the limit of quantification (LOQ) in 17 dogs. The dogs were divided into two groups, normal dogs (MDR1 +/+) and heterozygous (MDR1 +/-) according to the MDR1 genotype. The median values of maximum serum concentration (Cmax) were 63.13 ng/mL ± 33.35 for the normal group and 58.01 ng/mL ± 27.29 for the heterozygous group. Tmax (time to maximum serum concentration) was 4 h for both groups and t ½ (half-life) were 2,85h ± 1,61 e 2,81h ± 1,46 for normal and heterozygous dogs, respectively. The mean area-under-the-curve (AUC) values for the sustained release tramadol compounds for the normal and heterozygous group were 350,20 ±216,61 and 312,15 ± 155,43 ng.h/mL, respectively. The bioavailability was 22% and 23% for normal and heterozygous dogs respectively. There was no statistic difference between groups in all pharmacokinetics parameters. The findings suggest that tramadol is not a P-gp substrate. The amount of pharmacokinetics data of SR formulation of tramadol in dogs is sparse. Therefore, more studies of oral SR tramadol in dogs are needed to establish appropriate dose and frequency of administration in dogs.

A P-glicoproteína (P-gp) é uma transportadora transmembrana de múltiplos fármacos, produto do gene MDR1 (ABCB1). A P-gp contribui para a função de barreira de vários tecidos e órgãos, funcionando como uma bomba de efluxo para muitos substratos. Diminuição na expressão desta proteína é associada à sensibilidade a fármacos. Cães da linhagem dos Collies possuem uma alta incidência de uma mutação no gene MDR1, denominada nt230(del4). Animais homozigotos para a mutação apresentam a supressão total de uma P-gp funcional e um animal heterozigoto apresenta uma maior sensibilidade para substratos da P-gp, devido a uma diminuição na expressão da mesma. Alguns fármacos opioides, como a morfina e a metadona, foram identificados como substratos da P-gp. O tramadol é um dos analgésicos opioides mais utilizados em cães. No presente trabalho, a mutação MDR1 nt230(del4) foi analisada em vinte cães Collie, utilizando reação em cadeia de polimerase (PCR). A identificação foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução, sendo o resultado confirmado por análise de sequênciamento de DNA. Como resultado, seis cães apresentaram normalidade nos dois alelos e 14 apresentaram heterozigose para a mutação. Estes animais foram submetidos à segunda fase do experimento, quando se administrou uma dose única de 100 mg de tramadol oral de liberação prolongada (SR), objetivando investigar o tramadol como sendo substrato da P-gp. Outro objetivo foi avaliar a farmacocinética deste tipo de formulação, pois ainda não foi estabelecida para cães. A análise farmacocinética do tramadol foi realizada utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por espectrometria de massas para a determinação e quantificação de tramadol no soro canino. O analito e o padrão interno foram extraídos do soro por método líquido-líquido. A separação cromatográfica foi obtida a partir de uma coluna analítica C18, mantida a 30°C, sob condições isocráticas de uma fase móvel constituída por uma mistura de acetonitrila e ácido fórmico a 0,1% (80:20). A concentração de tramadol no soro foi maior do que o limite de quantificação (LOQ), em 17 cães. Os cães foram divididos em dois grupos, cães normais (MDR1 +/+) e heterozigotos (MDR1 +/-). Os cálculos farmacocinéticos para o tramadol oral SR obtiveram valores médios de concentração máxima no soro (Cmax) de 63,12 ng/mL ± 33,35 para o grupo normal e 58,00 ng/mL ± 27,29 para o grupo heterozigoto. Tmax (tempo de concentração plasmática maxima) foi de 4 h para ambos os grupos e t ½ (meia-vida) foram 2,85 h ± 1,61 e 2,81 ± 1,46 h para os cães normais e heterozigotos, respectivamente. A área sob a curva (AUC) média para o tramadol oral SR para o grupo normal e heterozigoto foram 350,20 ± 216,61 e 312,15 ± 155,43 ng.h/mL, respectivamente. A biodisponibilidade foi de 22% e 23% para os cães normais e heterozigotos, respectivamente. Não houve diferença estatística entre os grupos em todos os parâmetros farmacocinéticos. Os resultados sugerem que o tramadol não é um substrato da Pgp. A quantidade de dados farmacocinéticos do tramadol oral na formulação de liberação prolongada (SR) em cães é escassa, sendo necessários mais estudos farmacocinéticos e farmacodinâmicos para o tramadol oral de liberação prolongada em cães para estabelecer adequada dose e frequência de administração em cães. / The P-glycoprotein (P-gp) is a transmembrane multidrug transporter, product of the MDR1 (ABCB1) gene. P-gp contributes to the barrier function of several tissues and organs, acting as an efflux pump for many substrates. Decreased expression of this protein is associated with sensitivity to drugs. Collie dogs have a high incidence of a mutation in MDR1 gene, denominated MDR1 nt230 (del4). In homozygosis, this mutation results in the total absence of a functional P-gp and a heterozygote animal presents a greater sensibility to P-gp substrates, probably due to a decrease in the expression thereof. Some opioid drugs such as morphine and methadone were identified as P-gp substrates. Tramadol is one of the most commonly opioid used in dogs. In the present work MDR1nt230 (del4) mutation was analyzed in 20 healthy Collie dogs using allele-specific polymerase chain reaction (PCR) method. Thereby, 6 homozygous intact and 14 heterozygous mutated MDR1 genotypes can be differentiated by high resolution polyacrylamide gel electrophoresis, confirmed by DNA sequence analysis. These animals underwent the second phase of the experiment, when a single oral administration of 100 mg of sustained release (SR) tramadol was administrated to investigate the tramadol as P-gp substrate. In addition, another aim was evaluate the pharmacokinetics of sustained release formulation, which has not been established for dogs. Pharmacokinetic analysis of tramadol was evaluated using high performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometry for determination and quantification of tramadol in canine serum. The analyte and internal standard (IS) were extracted from serum using liquid-liquid method. Chromatographic separation was achieved on a C18 analytical column, kept at 30°C, under isocratic conditions of a mobile phase consisted by a mixture of acetonitrile and water contained 0,1% formic acid (80:20). Serum tramadol concentration was greater than the limit of quantification (LOQ) in 17 dogs. The dogs were divided into two groups, normal dogs (MDR1 +/+) and heterozygous (MDR1 +/-) according to the MDR1 genotype. The median values of maximum serum concentration (Cmax) were 63.13 ng/mL ± 33.35 for the normal group and 58.01 ng/mL ± 27.29 for the heterozygous group. Tmax (time to maximum serum concentration) was 4 h for both groups and t ½ (half-life) were 2,85h ± 1,61 e 2,81h ± 1,46 for normal and heterozygous dogs, respectively. The mean area-under-the-curve (AUC) values for the sustained release tramadol compounds for the normal and heterozygous group were 350,20 ±216,61 and 312,15 ± 155,43 ng.h/mL, respectively. The bioavailability was 22% and 23% for normal and heterozygous dogs respectively. There was no statistic difference between groups in all pharmacokinetics parameters. The findings suggest that tramadol is not a P-gp substrate. The amount of pharmacokinetics data of SR formulation of tramadol in dogs is sparse. Therefore, more studies of oral SR tramadol in dogs are needed to establish appropriate dose and frequency of administration in dogs.

Orientadores: Luiz Carlos Teixeira, Marcelo Alvarenga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T06:39:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_GraceImaculadaPereira_M.pdf: 240494 bytes, checksum: cd5e0f3dc3493ba406e12d65609a451f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Objetivo: Avaliar a expressão imunoistoquímica da P-glicoproteína e sua correlação com a resposta à quimioterapia com esquemas contendo antraciclina em mulheres portadoras de carcinoma de mama estádio III. Sujeitos e Métodos: Estudo de coorte retrospectivo, em que foram analisados 88 prontuários de pacientes matriculadas no período de Junho de 1996 a novembro de 2003 no Ambulatório de Oncologia Clinica do CAISM-Unicamp, e portadoras de carcinoma ductal infiltrativo localmente avançado, que receberam quimioterapia neo-adjuvante com esquemas contendo antraciclina, excluindo as portadoras de carcinoma inflamatório. O tumor foi biopsiado antes do tratamento (core biopsy ou incisional) e submetido a exame imunoistoquímico pelo sistema envision peroxidase, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-P-glicoproteína (P-gp), C494 (Signet) trans-menbrana e C219 (Signet) intra-citoplásmatico. Considerou-se positivo coloração citoplasmática ou trans-membrana em 10% ou mais das células. O controle externo positivo usado foi tecido normal de rim humano. A resposta clínica foi avaliada antes da cirurgia, após no mínimo dois ciclos de quimioterapia e os dados correlacionados com a expressão da p-glicoproteína. Empregou-se o teste exato de Fisher ou qui-quadrado para avaliar as possíveis associações. Resultados: A freqüência da positividade da P-glicoproteína na amostra foi de 23,86%. A resposta clínica objetiva à quimioterapia foi semelhante nos casos com e sem expressão da p-glicoproteína, considerando o tumor primário (57,1% vs 58,2%), axila (67,8% vs 78,8%) e resposta total (57,2% vs 65,7 %, p = 0,851). Conclusão: Não encontramos relação entre a expressão da P-glicoproteína e a resposta clínica à quimioterapia neo-adjuvante, sugerindo que este marcador não deve ser considerado como fator preditivo de resposta à quimioterapia com antraciclina / Abstract: Objective: Evaluate the immunohistochemical expression of P-glycoprotein and its correlation to the response to chemotherapy with schemes containing antraciclin in women who are carriers of stage III breast carcinoma. Subjects and Methods: In the study of retrospective cohort, 88 files of patients who are carriers of locally advanced infiltrative ductal carcinoma were analyzed, and received neoadjuvant chemotherapy containing antraciclin, excluding the inflammatory cases, from June 1996 to November 2003, in the Oncology Clinic of CAISM-Unicamp. The tumor was biopsized before treatment (core biopsy or incisional biopsy) and subjected to the immunohistochemical exam by using the envision peroxidase system and utilizing anti-P-glycoprotein monoclonal antibodies (P-gp), C494 (Signet) trans-menbrane and C219 (Signet) intra-cytoplasmatic. The cytoplasmatic coloring or trans-membrane was considered positive in a rate of 10% or more of the cells. The external positive control which was used was human kidney normal tissue. Clinical response was evaluated before surgery, after a minimum of two cycles of chemotherapy and the data was correlated to the expression of P-glycoprotein. The exact Fisher test or Qui-square test was used to evaluate any possible associations. Results: The frequency of the positivity of P-glycoprotein in the samples was 23.86%. The objective clinical response to chemotherapy was similar in the cases with and without the expression of P-glycoprotein, considering the primary tumor (57.1% vs 58.2%), arm pit (67.8% vs 78.8%) and total response (57.2% vs 65.7%, p = 0.851). Conclusion: The relation between the expression of P-glycoprotein and the clinical response to to neoadjuvant chemotherapy was not found, what suggests that this marker should not be considered as a response predictive factor to chemotherapy with anthracyclin / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Tocoginecologia

Para fármacos administrados por via oral, o controle da extensão e da velocidade de absorção depende basicamente de duas importantes etapas: solubilidade do fármaco nos líquidos fisiológicos e sua permeabilidade através das membranas biológicas. Assim, o Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) foi proposto como uma ferramenta para o desenvolvimento de novos fármacos, de novas formulações e para auxiliar nos processos de bioisenção. No entanto, outro fator relacionado à biodisponibilidade e que deve ser considerado nos estudos biofarmacêuticos é o metabolismo. Desta forma, o Sistema de Classificação Biofarmacêutica de Distribuição de Fármacos (SCBDF) foi proposto com a finalidade de classificar os fármacos de acordo com suas características de solubilidade e de metabolismo de modo que seja possível avaliar e predizer o comportamento do fármaco in vivo. O metabolismo tem sido amplamente investigado, sobretudo as enzimas do citocromo P450, as quais estão presentes também nos enterócitos. Além disso, o SCBDF oferece um suporte quanto à avaliação dos mecanismos de permeabilidade envolvidos nos processos de absorção, interações fármaco-fármaco e interações fármaco-alimento. Assim, o presente trabalho teve como objetivo elucidar os mecanismos envolvidos na permeabilidade de fármacos antirretrovirais por meio dos modelos ex vivo (câmaras de difusão vertical tipo Franz) e in vitro (PAMPA, MDCK-MDR1 e microssomas) considerando os aspectos relacionados ao metabolismo intestinal e ao efluxo destes fármacos. Dada a importância da utilização de fármacos antirretrovirais na terapia medicamentosa contra a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e que estes medicamentos são normalmente administrados cronicamente, a compreensão dos mecanismos envolvidos na permeabilidade é de suma importância, uma vez que estes não estão totalmente esclarecidos e poucas informações são encontradas na literatura. Além disso, a biodisponibilidade de fármacos como estavudina, lamivudina e zidovudina indica variação na permeabilidade, necessitando de uma investigação científica mais aprofundada dos processos absortivos. Assim, segmentos de jejuno provenientes de ratos machos Wistar foram utilizados para a avaliação da permeabilidade intestinal dos referidos antirretrovirais considerando a avaliação de efluxo pela glicoproteína-P e o metabolismo intestinal pela CYP3A. De maneira complementar, estudos in vitro com o emprego de membranas artificiais paralelas (PAMPA) e culturas celulares de MDCK-MDR1 foram realizados com a finalidade de auxiliar na elucidação dos mecanismos de permeabilidade dos fármacos antirretrovirais. Além disso, a avaliação do metabolismo dos referidos fármacos foi realizada com o emprego de microssomas a fim de verificar se tais substâncias são substratos de enzimas da família CYP3A e, assim, verificar o impacto do metabolismo intestinal na absorção. Os resultados de permeabilidade obtidos em PAMPA foram: 0,74±0,11 x 10-6 cm/s para a estavudina, 0,25±0,12 x 10-6 cm/s para a lamivudina e 1,14±0,25 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Já no modelo ex vivo com o emprego de câmaras de difusão vertical tipo Franz, os resultados foram: 1,56±0,32 x 10-5 cm/s para a estavudina, 1,26±0,27 x 10-5 cm/s para a lamivudina e 2,54±0,49 x 10-5 cm/s para a zidovudina. Portanto, com base nos resultados obtidos a partir dos dois métodos empregados, sugere-se que 30 outro mecanismo de transporte que não envolva a permeabilidade por difusão transcelular passiva possa estar relacionado à permeabilidade dos fármacos antirretrovirais. Com relação aos estudos de efluxo, os resultados obtidos a partir dos experimentos realizados em câmaras de difusão vertical tipo Franz demonstraram o aumento significativo da permeabilidade dos três antirretrovirais quando o inibidor de P-gp foi empregado, sendo: de 15,6 x 10-6 para 42,5 x 10-6 cm/s para a estavudina, de 12,6 x 10-6 para 37,5 x 10-6 cm/s para a lamivudina e de 25,4 x 10-6 para 56,6 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Em culturas celulares MDCK-MDR1, os resultados de permeabilidade foram utilizados para a obtenção das razões entre as direções B→A e A→B. Os valores de Papp na condição inibida para os fármacos estudados apresentaram razão menor do que 1. Já a razão B→A/A→B para cada fármaco nos ensaios sem inibidor apresentou-se igual ou maior que 2, evidenciando a interação fármaco-transportador. Com base nisso, o modelo ex vivo com o emprego de segmentos intestinais em câmaras de difusão vertical tipo Franz apresentou-se adequado na avaliação do mecanismo de efluxo dos fármacos antirretrovirais, o que foi confirmado com os estudos realizados em MDCK-MDR1. Assim, os fármacos antirretrovirais estudados apresentaram interação significativa com a P-gp. Em relação aos estudos de metabolismo realizados em câmaras de difusão vertical tipo Franz, os resultados demonstraram grande variação na permeabilidade dos três antirretrovirais quando o inibidor de CYP3A foi empregado, sendo: de 15,6 x 10-6 para 23,5 x 10-6 cm/s para a estavudina, de 12,6 x 10-6 para 27,3 x 10-6 cm/s para a lamivudina e de 25,4 x 10-6 para 40,5 x 10-6 cm/s para a zidovudina. Já no modelo que emprega microssomas, os resultados de metabolização na ausência e na presença de inibidor de CYP3A foram: de 16,56% para 19,79% para a estavudina, de 14,56% para 15,55% para a lamivudina e de 17,85% para 16,48% para a zidovudina. Com base nisso, sugerese o emprego de microssomas para a determinação de metabolismo, uma vez que o método ex vivo empregado demonstrou grande variação entre os valores obtidos. Desta forma, observou-se que, para cada fármaco, não houve influência significativa no metabolismo pré-sistêmico relacionado às enzimas do complexo CYP3A, o que indica que a absorção oral das referidas substâncias não é limitada por tais enzimas. Portanto, a utilização dos diferentes métodos empregados no desenvolvimento do presente trabalho permitiu compreender os mecanismos envolvidos no transporte dos fármacos antirretrovirais, o que se torna de grande relevância nas etapas de desenvolvimento farmacêutico de novas moléculas e na compreensão de eventos clínicos ainda não esclarecidos atualmente. / For orally administered drugs, control of the extent and rate of absorption depends on two important steps: solubility of the drug in physiological liquids and their permeability across biological membranes. Thus, the Biopharmaceutics Classification System (BCS) has been proposed as a tool for the development of new drugs, new formulations and aid in the biowaiver processes. However, another factor related to bioavailability that should be considered in biopharmaceutic studies is the metabolism. Thus, the Biopharmaceutics Drug Disposition Classification System (BDDCS) has been proposed for drug classification according to their solubility and metabolism characteristics, so it is possible to evaluate and predict the in vivo behavior of a compound. Metabolism has been extensively investigated, especially cytochrome P450 enzymes, which are also expressed in enterocytes. Besides, BDDCS provides support in evaluating the permeability mechanisms involved in the absorption processes, drug-drug interactions and drug-food interactions. Thus, the present study aimed to evaluate the mechanisms of permeability of antiretroviral drugs through the ex vivo (Franz cells) and in vitro (PAMPA, MDCK-MDR1 and microsomes) models considering aspects related to the intestinal metabolism and efflux of these drugs. Given the importance of the use of antiretroviral drugs in drug therapy against Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) and that these drugs are usually administered in a long-term way, understanding the mechanisms involved in the permeability is of a great importance, since they are not totally elucidated and no information is found in the literature. In addition, drugs as stavudine, lamivudine and zidovudine indicate variation in the permeability, which require further scientific investigation of absorptive processes. Thus, jejunum segments from rats were used to evaluate the intestinal permeability of these antiretroviral drugs, considering the evaluation of efflux by P-glycoprotein and intestinal metabolism by CYP3A. In a complementary manner, in vitro studies using parallel artificial membranes (PAMPA) and cell cultures MDCK-MDR1 were performed to aid in the elucidation of the permeability mechanisms of antiretroviral drugs. Also, the evaluation of the metabolism was carried out using microsomes to verify if such substances are substrates of CYP3A, and verify the impact of the intestinal metabolism in the absorption. The permeability results obtained in PAMPA were: 0.74±0.11x10-6 cm/s for stavudine, 0.25±0.12x10-6 cm/s for lamivudine and 1.14±0.25x10-6 cm/s for zidovudine. In ex vivo method using the intestinal segments in Franz cells, the results were: 1.56±0.32x10-5 cm/s for stavudine, 1.26±0.27x10-5 cm/s for lamivudine and 2.54±0.49x10-5 cm/s for zidovudine. Thus, based on the results obtained from these two methods, it is suggested that the antiretroviral drugs present other transport mechanism that is different from transcellular passive diffusion. For efflux studies, results obtained from experiments performed in Franz cells shown the increase of the permeability of the three antiretroviral drugs when the P-gp inhibitor was used: from 15.6x10-6 to 42,5x10-6 cm/s for stavudine, from 12.6x10-6 cm/s to 37.5x10-6 cm/s for lamivudine, and 25.4x10-6 to 56.6x10-6 cm/s for zidovudine. In MDCK-MDR1, the permeability results were used for obtaining ratio values between the directions B→A and A→B. The Papp values obtained with 33 inhibitor shown a ratio less than 1. For ratio B→A/A→B for each drug in experiments without inhibitor, the values obtained was equal or greater than 2, which shows the interaction between drug and transporter. Based on that, the ex vivo model using intestinal segments in Franz cells seems to be adequate for evaluation of efflux mechanism of antiretroviral drugs, which was confirmed by MDCK-MDR1 studies. Thus, the antiretroviral drugs presented interaction with P-gp. For metabolism studies in intestinal segments in Franz cells, a wide range of standard deviation was observed for the three antiretroviral drugs when the CYP3A inhibitor was used: from 15.6x10-6 cm/s to 23.5x10-6 cm/s for stavudine, from 12.6x10-6 cm/s to 27.3x10-6 cm/s for lamivudine, and from 25.4x10-6 cm/s to 40.5x10-6 cm/s for zidovudine. In experiments in microsomes, the results of metabolization in the absence and presence of CYP3A inhibitor were: from 16.56 to 19.79% for stavudine, from 14.56 to 15.55% for lamivudine and from 17.85 to 16.48% for zidovudine. Based on that, it is suggested the use of microsomes for metabolism evaluation, since the ex vivo method presented high variability between the results obtained. For each drug, no significative influence in pre-systemic metabolism related to CYP3A enzymes was observed, which indicates that the oral absorption of the drugs is not limited by these enzymes. The use of different methods in this work allowed to understand the mechanisms involved in the transport of antiretroviral drugs, which is of a great relevance in drug development and in the understanding of clinical events currently not clarified.

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In spite of recent therapeutic advances, multiple myeloma (MM) remains a malignancy with very low curability. This has been partly attributed to the existence of a drug-resistant subpopulation known as cancer stem cells (CSCs). MM-CSCs are equipped with the necessary tools that render them highly resistant to virtually all conventional therapies. In this study, the growth inhibitory effects of withanolide D (WND), a steroidal lactone isolated from Withania somnifera, on drug-sensitive tumoral plasma cells and drug-resistant MM cells have been investigated. In MTT/XTT assays, WND exhibited similar cytostatic effects between drug-resistant and drug-sensitive cell lines in the nM range. WND also induced cell death and apoptosis in MM-CSCs and RPMI 8226 cells, as examined by the calcein/ethidium homodimer and annexin V/propidium iodide stainings, respectively. To determine whether P-glycoprotein (P-gp) efflux affected the cytostatic activity of WND, P-gp was inhibited with verapamil and results indicated that the WND cytostatic effect in MM-CSCs was independent of P-gp efflux. Furthermore, WND did not increase the accumulation of the fluorescent P-gp substrate rhodamine 123 in MM-CSCs, suggesting that WND may not inhibit P-gp at the tested relevant doses. Therefore, the WND-induced cytostatic effect may be independent of P-gp efflux. These findings warrant further investigation of WND in MM-CSC animal models.