Made available in DSpace on 2014-06-12T18:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8091_1.pdf: 1744575 bytes, checksum: 7a2b6fdff1816c5aee4d1fc22f03208f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A leishmaniose visceral americana (LVA) é uma protozoose sistêmica que acomete pessoas de ambos os sexos e predomina em menores de 15 anos de idade. O diagnóstico fundamentase nos dados clínicos, na epidemiologia, na visualização microscópica do parasito em aspirados teciduais (com sensibilidade variável), nos testes sorológicos (que apresentam limitações) e, mais recentemente, na reação em cadeia da polimerase (PCR). Com o objetivo de testar a validade da PCR no diagnóstico da LVA, 162 indivíduos admitidos no hospital Hospital Escola Dr. Hélvio Auto (HEHA) em Maceió-Alagoas, com hipótese de diagnóstico de LVA foram incluídos no estudo 56,2% do sexo masculino e 43,8% do sexo feminino, com idades entre quatro meses a 66 anos, (média de 13 e mediana de 8,5 anos); 65,4% de procedência rural e 34,6% urbana. A doença foi confirmada em 104 casos (64,4%), dos quais 55,8% eram do sexo masculino e 44,2% feminino, com idades variando entre 7 meses e 66 anos, (média de 12,9 e mediana de 9,5 anos). O aspirado medular, obtido em 99 dos 104 casos, foi submetido à microscopia óptica. Amastigotas de Leishmania foram identificadas em 86 (87%) dos pacientes. Em 13 (13%) pacientes, nos quais não foram encontrados parasitos no aspirado medular, pela microscopia óptica, e em cinco que não fizeram esse exame, o diagnóstico fundamentou-se no quadro clínico e na resposta favorável ao tratamento. A maioria, 89,4% foi tratada com N-metilglucamina; 2,8% receberam apenas anfotericina B e 7,7% iniciaram o tratamento com antimonial, sendo substituído, posteriormente, por anfotericina B. Durante o estudo, quatro pacientes faleceram: dois em decorrência da própria doença e os demais por falta de resposta ao tratamento com glucantime e a anfotericina B. A PCR foi processada em amostras de sangue medular e periférico em pacientes com e sem LVA, avaliando, assim, a sensibilidade e especificidade do teste e sua concordância com a microscopia óptica. A PCR foi positiva em sangue medular de 100% dos pacientes com parasitos à microscopia óptica e em 61,5% dos que não foram observados parasitos. A concordância entre a visualização ou não do parasito no aspirado medular e a PCR ser positiva foi considerada sofrível (Kappa=0,41). Comparando-se os resultados da PCR obtidos nos aspirados da medula com os do sangue periférico, a concordância foi considerada ótima (Kappa=0,88). Indivíduos doentes e não-doentes de LVA tiveram o sangue aspirado da medula e o sangue periférico processado pela PCR. O teste foi positivo em todos os aspirados medulares dos doentes e em 58,5% dos que não tinham a doença, ficando a especificidade em 41,5%. No sangue periférico, o teste foi positivo em 96,7% dos doentes e em 59,2% dos não doentes. Para avaliar a utilidade da PCR como critério de cura, 30 pacientes tiveram o sangue periférico processado pela PCR, antes e ao término da medicação; somente 10% tornaram-se negativos ao fim do tratamento. Esses pacientes foram tratados com N-metilglucamina, exceto um, que teve o antimonial substituído por anfotericina B. O fígado e o baço foram medidos na admissão e ao término do tratamento; ocorrendo redução com significância estatística (pfígado e pbaço = 0,000) quando submetido ao teste T pareado. Por sua elevada sensibilidade, tanto no sangue medular como periférico, sugere-se que a PCR poderá ser usada como teste diagnóstico auxiliar, nos casos suspeitos de LVA, nos quais a microscopia seja negativa. Nesse estudo a PCR não se mostrou útil como critério de cura na avaliação dos pacientes

Submitted by Nathália Neves (nathalia.neves@ufpe.br) on 2015-03-05T18:54:49Z No. of bitstreams: 2 Nelson_Mestrado_Biblioteca.pdf: 2006130 bytes, checksum: b672ac0459557046842a79f276aa4414 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T18:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Nelson_Mestrado_Biblioteca.pdf: 2006130 bytes, checksum: b672ac0459557046842a79f276aa4414 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / CNPq / Ganoderma abrange 80 espécies de grande importância econômica e ecológica, caracterizando-se por possuir basidiosporos de parede dupla e ornamentada de ápice truncado. Sua taxonomia é baseada em caracteres morfológicos, porém a pluralidade de termos e critérios por taxonomistas fazem a identificação desse grupo ser caótica. Nessa perspectiva, as regiões ITS e LSU (rDNA) são as mais utilizadas para diferenciação de táxons morfologicamente semelhantes. No presente estudo, foram utilizados tanto exemplares de Ganoderma frescos quanto amostras herborizadas para extração de DNA genômico, amplificação das regiões ITS e LSU, e posterior sequenciamento. Desse modo, foram sequenciados 27 espécimes de Ganodermataceae para as regiões ITS e LSU, sendo duas pertencentes à Tomophagus colossus e 25 exemplares pertencentes ao gênero Ganoderma (14 do subg. Ganoderma e 11 do subg. Elfvingia), representando seis espécies para este último gênero. Todas as reconstruções filogenéticas realizadas demonstraram que Ganoderma trata-se de um grupo monofilético, distinto de Tomophagus, porém pertencentes à mesma família. Para o subgênero Ganoderma baseada em exemplares brasileiros, observou-se a delimitação filogenética das cinco espécies estudadas (G. chalceum, G. multiplicatum, G. orbiforme, G. parvulum e G. resinaceum), todas distintas em relação a G. lucidum. No subgênero Elfvingia, os representantes brasileiros momentaneamente identificados como G. tornatum, alocaram-se em subclados distintos de acordo com a distribuição geográfica (Mata Atlântica e Floresta Amazônica). De modo geral, para Ganoderma observa-se uma forte correlação entre os agrupamentos formados e a distribuição geográfica. Esses resultados demonstram a utilidade das regiões do rDNA, associadas aos métodos tradicionais, nos estudos taxonômicos e sua importância para uma identificação mais confiável das espécies.

Puesta a punto PCR Multiplex para el diagnóstico de 14 virus respiratorios

A Thesis submitted to The University of Arizona College of Medicine - Phoenix in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Doctor of Medicine.

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Les bactériophages ARN F-spécifiques sont des virus qui infectent Escherichia coli et possèdent une structure et une taille comparables à celles des principaux virus entériques pathogènes. Ils sont proposés comme indicateurs de pollution fécale du milieu hydrique, comme modèles du comportement des virus pathogènes dans l’environnement et comme outil de discrimination de l’origine de la pollution fécale. En effet, dans les eaux usées, il a été rapporté que les génogroupes II et III avaient principalement une origine humaine alors que les génogroupes I et IV avaient, quant à eux, plutôt une origine animale. Paradoxalement, peu de données existent quant à la répartition des différents génogroupes dans les eaux naturelles. L’objectif de ce travail a, par conséquent, été de préciser les relations existantes entre les différents génogroupes des phages ARN F-spécifiques et la pollution fécale et virale des eaux naturelles. Tout d’abord, nous avons développé les premiers systèmes de RT-PCR en temps réel capables d’identifier les quatre génogroupes dans les eaux environnementales. La sensibilité, la spécificité et la rapidité de détection constituent les avantages majeurs de cette approche. Par rapport aux outils existants, cette méthode permet de s’affranchir de l’étape de culture et donc de minimiser les problèmes engendrés par des taux d’inactivation importants des particules virales infectieuses, en réponse aux stress environnementaux. En effet, les études de persistance, réalisées aussi bien dans l’eau usée que dans l’eau souterraine, démontrent que, selon les conditions expérimentales, le génome phagique est de 3 à 20 fois plus résistant que les phages infectieux. Dans un second temps, l’analyse d’échantillons d’eaux usées urbaines nous a permis de vérifier que, malgré le changement de référentiel de mesure (génome versus particule infectieuse) inhérent à notre méthode de détection, les bactériophages ARN F-spécifiques pouvaient donner des informations intéressantes quant à la caractérisation de la pollution fécale. Dans ce type de milieu, les génogroupes II et III sont majoritairement retrouvés à des concentrations relativement stables au cours du temps. De manière ponctuelle, la présence du génogroupe I a pu, à la fois, être mise en relation avec les précipitations et avec la présence de pathogènes à caractère zoonotique (Cryptosporidium et Giardia), suggérant un apport de pollution animale par des phénomènes de ruissellement. Ceci a conforté l’idée que le génotypage pourrait constituer un outil intéressant de discrimination de l’origine de la pollution fécale. En revanche, la comparaison des résultats de génotypage aux concentrations en virus pathogènes montre que ces phages ne sont pas adaptés à la prédiction de la présence de norovirus et d’entérovirus, en raison d’un caractère saisonnier de ces derniers. Les deux études de cas consacrées aux eaux naturelles constituent l’étape majeure de notre étude. Dans un contexte de pollution principalement anthropique, il est démontré qu’au niveau de l’eau de rivière, le génogroupe II est très majoritairement observé. Les variations de concentration de ce génogroupe ont pu être corrélées positivement avec les indicateurs bactériens (E. coli, entérocoques) et avec les adénovirus humains attestant de son origine fécale humaine. Le génogroupe I est également très souvent représenté mais avec de plus amples variations de concentration. Ce génogroupe n’a été corrélé ni aux indicateurs bactériens, ni au génogroupe II, ni aux adénovirus humains, étayant l’hypothèse d’une autre origine de ce génogroupe. La corrélation positive avec les valeurs de turbidité de l’eau laisse supposer un apport de ces phages suite à des événements de ruissellement. Ainsi, dans l’eau de rivière, les génogroupes I et II semblent apporter des informations intéressantes quant à l’origine de la pollution fécale. Dans ce cadre, nous proposons l’utilisation d’un ratio de concentrations des génogroupes I et II pour caractériser la pollution fécale. A titre d’exemple, pour une concentration en E. coli de 3,6 log10 NPP/100mL, la valeur du log10 (GGII/GGI) peut être aussi bien de 3,8 que de -1,7. Avec la turbidité de l’eau, ce ratio a été le seul paramètre permettant de distinguer une modification dans la nature de la pollution fécale. Le génome des phages ARN F-spécifiques n’a pas été mis en évidence dans les prélèvements d’eaux souterraines protégées de la pollution fécale. Par contre, du génome d’adénovirus humains a été identifié dans 7 échantillons sur 60. Ainsi, des marqueurs plus persistants que le génome des phages ARN F-spécifiques peuvent être détectés. Au cours de l’étude de persistance menée dans ce milieu, aucune dégradation de l’ADN n’a été observée sur les 200 jours de l’expérience, supportant l’idée que l’ADN est un marqueur de pollution fécale extrêmement conservateur. Finalement, les méthodes nouvellement développées au cours de cette thèse ont abouti à une meilleure connaissance de la distribution des différents génogroupes au sein des eaux naturelles. Le génotypage des phages ARN F-spécifiques apporte des informations originales par rapport aux indicateurs bactériens, mais ne constitue pas, à lui seul, l’indicateur universel de pollution fécale ou virale des eaux. / F-specific RNA phages, which are non pathogenic viruses with similar size and structure to human enteric viruses, have been proposed like faecal pollution indicators, like models for pathogenic viruses in environment and like tools for microbial source tracking. The key trait on which the F-specific RNA phage approach of source tracking is based is that genogroups I and IV are predominantly isolated from non human faeces, while genogroups II and III are predominantly isolated from human faeces and sewage. Paradoxically, few data are available as for the genogroups distribution in environmental waters. So, the topic of this study was to provide additional information about the relationships between the genogroups of F-specific RNA phages and the level of faecal and viral pollution to environmental waters. First, the methodological work undertaken at the beginning of this project made it possible to develop the first real-time RT-PCR assays able to typing the F-specific RNA phages. The major advantages of this approach are a good sensitivity, a quick detection and a great specificity. Compared with the current tools, this method allows to avoid the phage cultivation and thus to play down the biases associated with the survival characteristics of infectious F-specific RNA phages in the environmental waters. Indeed, survival studies, realized in urban wastewater and also in ground water, have shown that the inactivation rates of infectious particles are always more important that this of viral RNA, whatever the experimental design was. Secondly, the analysis of urban wastewater samples enabled to check that F-specific RNA phages could give interesting information as for the characterization of faecal pollution in spite of the change of reference frame of measurement inherent in our detection method (genome versus infectious particle). In these kinds of samples, the majority of phages isolated belonged to the genogroups II and III, and they exhibited steady concentrations. In several particular samples, the high concentration of genogroup I phages has been associated with rainfall events and with the presence of zoonotic pathogens (Cryptosporidium and Giardia). This observation suggests the presence of an animal pollution after streaming phenomena. All the results obtained with urban wastewaters strengthen the use of F-specific RNA phages like reliable source identification tool. On the other hand, the comparison between the pathogenic virus concentrations and the results of genotyping has shown that phage genogroups are not relevant indicators for the presence of enteric viruses. For instance, norovirus and enterovirus concentrations in wastewater displayed a seasonal distribution while human genogroups exhibited steady concentrations over the time. Thirdly, two particular case studies devoted to natural waters constitute the major aspect of our work. In river water principally influenced by human wastes, genotyping results show that genogroup II is very largely isolated. For the first time, positive correlations between the concentrations of genogroup II phages, bacterial indicators (E. coli, enterococci) and human adenoviruses was observed, which attests the human faecal origin of this genogroup. Genogroup I was also often isolated but it appeared irregularly distributed. The correlation analysis has shown that genogroup I was linked neither with the concentration of genogroup II nor with that of bacterial or viral faecal indicators. The absence of a link between the concentrations of these two genogroups supports the assumption of another faecal origin. Conversely, a relationship was shown between genogroup I and the water turbidity observed at the sampling. This suggests that the origin of this genogroup could be related to streaming phenomena following precipitations. Thus, in river water the genogroup I and II would be the two most interesting genogroups in order to characterize faecal pollution. As a consequence, genogroup II/genogroup I ratio may be an interesting tool for faecal source tracking. Indeed, depending on the sign of the ratio, it seems possible to determine the main source of pollution at a given point. For example, for an E. coli concentration of 3.6log10 MPN/100mL, log-ratio values could as well be 3.8 as -1.7. With the water turbidity, this log-ratio was the only parameter enabled to highlight a change of faecal pollution nature. In ground waters protected from faecal pollution, genome of F-specific RNA phages was not observed while genome of adenoviruses was isolated in 7 samples on the 60 analyzed. This observation suggests that more persistent markers than RNA of phages could be detected in ground waters. More over, in persistence study, no degradation of adenoviral DNA was observed during all the time (200 days) of the experiment. Finally, the typing method newly developed during this study led to a better knowledge of the distribution of different the genogroups within environmental waters. F-specific RNA phage typing provides original information compared to the bacterial indicators, but does not constitute alone the universal indicator of faecal or viral pollution of waters.

Este estudo teve como objetivo detectar a presença do vírus da raiva em diferentes órgãos de morcegos do gênero Artibeus empregando as técnicas moleculares como RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR. De aproximadamente 4000 espécimes de morcegos recebidas no Instituto Pasteur para o diagnóstico da raiva, foram selecionados 30 morcegos do gênero Artibeus, com resultados positivos para raiva pelas técnicas tradicionais de IFD e inoculação em células N2A utilizando suspensões feitas a partir do SNC. Para as técnicas moleculares, foram retirados glândulas salivares, bexigas urinárias, rins, pulmões e conteúdos fecais e ainda foram lavadas as calotas cranianas dos espécimes. Os órgãos e conteúdos fecais foram diluídos a 1:10 (P/V) e as bexigas urinárias a 1:20 (P/V). As suspensões foram inoculadas em células N2A para o isolamento viral. Foi realizada a extração do RNA total usando o TRIzol®, foram realizadas a transcrição reversa seguida da PCR e hnRT-PCR com utilização de primers específicos para o gene codificante da proteína N. A partir do produto da transcrição reversa foi realizada a técnica de Real Time RT-PCR, utilizando primers e sonda específicos para variante antigênica 3. Das 30 suspensões de lavado cerebral, 28 (93,33%) resultaram positivos, na inoculação em cultura de células, seguido de glândulas salivares (36,67%), bexigas (16,67%) e conteúdos fecais (3,33%). Os resultados encontrados da sensibilidade nas técnicas de RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 56,25%, 82,57% e 82,19% quando avaliadas as 180 amostras analisadas. A comparação das técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR feita pelo teste exato de Fisher quanto a proporção de positivos detectados mostrou que para o lavado cerebral, órgãos e conteúdos fecais a proporção foi igual (P>0,05). Em relação à positividade os resultados encontrados nas técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 100% em lavado cerebral; 90% e 93,33% em glândulas salivares; 83,33% e 90% em bexigas; 80% e 93,33% em rins; 76,67% e 50% em pulmões e 43,33% em ambas as técnicas em conteúdos fecais. Esses resultados sugerem que tanto as técnicas de hnRT-PCR como Real Time RT-PCR podem ser utilizadas como métodos complementares para o diagnóstico da raiva e são sensíveis o bastante para o uso em estudos de patogênese. A técnica de Real Time RT-PCR realizada neste estudo se mostrou eficiente em detectar o RABV em diferentes órgãos e tecidos extraneurais com a vantagem de ser uma técnica mais rápida e sensível. / This study was aimed to detect the presence of rabies virus in different organs of the genus Artibeus bats using molecular techniques such as RT-PCR, hnRT-PCR, and the Real Time RT-PCR. From about 4,000 specimens of bats received for rabies diagnosis at the Pasteur Institute, 30 bats of the genus Artibeus were then selected. The selected bats presented positive results by the traditional DFA and N2A-cells inoculation test using brain tissue suspensions. Samples of salivary glands, urinary bladders, kidneys, lungs, and fecal contents and washings of the skulls were collected for the molecular techniques testing. The organs and the fecal contents were diluted at 1:10 (w/v) and the urinary bladder, at 1:20 (w/v) and these suspensions were inoculated into N2A cells for viral isolation. The extraction of the total RNA was performed by using TRIzol® and followed by the reverse transcription and the PCR and the hnRT-PCR were performed by using specific primers for the gene encoding the protein N. The product obtained by the reverse transcription technique was submitted to the Real Time RT-PCR technique, using primers and probe specific for antigenic variant 3 of the rabies virus. Of the 30 suspensions of the brain washings, 28 (93.33%) were positive in N2A cell culture inoculation, followed by the suspensions of the salivary glands (36.67%), bladders (16.67%) and fecal contents (3.33%). For the 180 samples evaluated, the results of sensitivity found for the RT-PCR, hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques were 56.25%, 82.57%, and 82.19%, respectively. A comparison of hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques performed by Fisher\'s exact test showed that the proportion of positives detected by the brain washings, organs and of the fecal content was non-significant (P> 0.05). Regarding the results found in hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques, 100% positives were in brain washing, 90% and 93.33% in salivary glands, 83.33% and 90% in bladders, 80% and 93.33% in kidneys, 76.67% and 50% in lungs and 43.33% for both techniques on fecal contents. These results suggest that both hnRT-PCR and Real-Time PCR techniques can be used as complementary methods for the diagnosis of rabies and are sensitive enough for use in pathogenesis studies. The Real Time RT-PCR technique performed in this study proved to be faster and more sensitive and effective in detecting RABV in different organs and extra neural tissues of bats.

Submitted by Lara Oliveira (lara@ufersa.edu.br) on 2017-05-19T20:57:26Z No. of bitstreams: 1 Ismênia_DISSERT.pdf: 2286785 bytes, checksum: fe512f9cb09ab8ccaeca35cce30794cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T20:57:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ismênia_DISSERT.pdf: 2286785 bytes, checksum: fe512f9cb09ab8ccaeca35cce30794cc (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae and persists as a serious public health problem in Brazil. The fact that this microorganism is inculcable makes it difficult to diagnose and elucidate details of its transmissive chain. Aiming to clarify the role of house dust in the disease transmission route, this case-control study carried out in the Barrocas, Mossoró, RN, Brazil, the largest cluster in the state, compared clinical, epidemiological, slit skin smear and serological results of 22 newly diagnosed patients of the cluster, with molecular results of detection of the specific RLEP and 16S rRNA genomic regions of this bacillus in the nasal swab samples, saliva and house dust of these individuals and of the controls (44 household contacts and 44 endemic contacts) between november 2015 to november 2016. There was greater detection in women and school-age youth, with degree of disability, with predominance of paucibacillary forms. There was no statistical difference between the number of BCG vaccine scars from patients and endemic contacts, and 31.8% of the patients had no vaccine scar. The two rapid serological tests evaluated, ML-flow and OrangeLife® presented similar results, with a higher positivity among paucibacillary patients through the latter (54.5%). Both were superior to slit skin smear (9.1%). Regarding molecular research, the positivity in nasal swab and saliva of multibacillary patients with primer RLEP was 16.7% and 33.3%, respectively. There was no detection of bacterial DNA in domestic dust or between paucibacillary. Regarding the DNA analysis in saliva of endemic multibacillary contacts, there was 27.2% positivity. Associating molecular and serological results, it was possible to identify 4.5% of subclinicity between home contacts and 15% of asymptomatic carrier status. Regarding the risk variables, residing in dwellings with up to two windows offered 3.79 times more chance of progressing to this outcome, having a history of cases of leprosy in the family increased 2.89 times the risk of presenting seropositivity by the OrangeLife® serological test In this community and being over 60 years of age gave 3.6 times more chances of having positive serological reaction for leprosy with the test evaluated, which denotes prolonged exposure to the bacillus. Although not statistically significant, it was noted that the pattern of low schooling, low income, environmental insalubrity, population agglomeration and inadequate living habits made up a sociodemographic and epidemiological profile that attests to the context of social vulnerability of the affected population, requiring integrated actions of rehabilitation that go beyond the physical aspect of their dwellings, since they need to contemplate the human and social development of these people in the broad sense / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae e persiste como grave problema de saúde pública no Brasil. O fato deste micro-organismo ser incultivável dificulta o diagnóstico e elucidação de detalhes da sua cadeia transmissiva. Objetivando analisar a dinâmica de transmissão ambiental da hanseníase, este estudo caso-controle realizado no Bairro Barrocas, Mossoró/RN, maior cluster do estado, confrontou resultados de avaliação clínica, epidemiológica, baciloscópica e sorológica de 22 doentes recém-diagnosticados nas Barrocas, com resultados moleculares de detecção das regiões genômicas específicas RLEP e 16S rRNA deste bacilo nas amostras de swab nasal, saliva e poeira domiciliar destes indivíduos e dos seus controles (44 contactantes domiciliares e 44 contactantes endêmicos), entre novembro de 2015 a novembro de 2016. Os indivíduos foram diagnosticados através de busca ativa nos domicílios, nas escolas e na sede da unidade básica de saúde local. Houve maior detecção da doença em mulheres, nos menores de 15 anos, com grau 0 de incapacidade e predominância de formas paucibacilares. Não houve diferença estatística entre o número de cicatrizes vacinais de BCG de doentes e de contatos endêmicos, e 31,8% dos hansenianos não apresentaram cicatriz vacinal. Os dois testes rápidos sorológicos avaliados, ML-flow (IgM ND-O-BSA) e OrangeLife® (IgM e IgG anti NDO-LID 1) apresentaram resultados semelhantes, com maior positividade entre os paucibacilares através deste último (54,5%). Ambos foram superiores à baciloscopia (9,1%). Quanto à pesquisa molecular, a positividade em swab nasal e saliva de doentes multibacilares com primer RLEP foi de 16,7% e 33,3%, respectivamente. Não houve detecção de DNA bacteriano na poeira doméstica nem entre os paucibacilares. Já em relação à pesquisa de DNA em saliva de contatos endêmicos de multibacilares, houve 27,2% de positividade. Associando-se resultados moleculares e sorológicos, foi possível identificar 4,5% de subclinicidade e 15% de status portador assintomático entre contatos domiciliares. Em relação às variáveis de risco de soropositivar com o teste OrangeLife®, este estudo revelou que residir em moradias com até duas janelas ofereceu 3,79 vezes mais chance de evoluir para este desfecho, ter histórico de casos de hanseníase na família aumentou 2,89 vezes o risco e ter mais de 60 anos de idade conferiu 3,6 vezes mais chances, o que denota exposição prolongada destes indivíduos ao bacilo. Embora sem significância estatística, fez-se notório que o padrão de baixa escolaridade, baixa renda, insalubridade ambiental, aglomeração populacional e hábitos de vida inadequados compuseram um perfil sociodemográfico e epidemiológico que atestou o contexto de vulnerabilidade social da população afetada, exigindo ações integradas de reabilitação que vão além do aspecto físico de suas moradias, pois necessitam contemplar o desenvolvimento humano e social dessas pessoas no seu sentido amplo / 2017-05-18

Este estudo teve como objetivo detectar a presença do vírus da raiva em diferentes órgãos de morcegos do gênero Artibeus empregando as técnicas moleculares como RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR. De aproximadamente 4000 espécimes de morcegos recebidas no Instituto Pasteur para o diagnóstico da raiva, foram selecionados 30 morcegos do gênero Artibeus, com resultados positivos para raiva pelas técnicas tradicionais de IFD e inoculação em células N2A utilizando suspensões feitas a partir do SNC. Para as técnicas moleculares, foram retirados glândulas salivares, bexigas urinárias, rins, pulmões e conteúdos fecais e ainda foram lavadas as calotas cranianas dos espécimes. Os órgãos e conteúdos fecais foram diluídos a 1:10 (P/V) e as bexigas urinárias a 1:20 (P/V). As suspensões foram inoculadas em células N2A para o isolamento viral. Foi realizada a extração do RNA total usando o TRIzol®, foram realizadas a transcrição reversa seguida da PCR e hnRT-PCR com utilização de primers específicos para o gene codificante da proteína N. A partir do produto da transcrição reversa foi realizada a técnica de Real Time RT-PCR, utilizando primers e sonda específicos para variante antigênica 3. Das 30 suspensões de lavado cerebral, 28 (93,33%) resultaram positivos, na inoculação em cultura de células, seguido de glândulas salivares (36,67%), bexigas (16,67%) e conteúdos fecais (3,33%). Os resultados encontrados da sensibilidade nas técnicas de RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 56,25%, 82,57% e 82,19% quando avaliadas as 180 amostras analisadas. A comparação das técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR feita pelo teste exato de Fisher quanto a proporção de positivos detectados mostrou que para o lavado cerebral, órgãos e conteúdos fecais a proporção foi igual (P>0,05). Em relação à positividade os resultados encontrados nas técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 100% em lavado cerebral; 90% e 93,33% em glândulas salivares; 83,33% e 90% em bexigas; 80% e 93,33% em rins; 76,67% e 50% em pulmões e 43,33% em ambas as técnicas em conteúdos fecais. Esses resultados sugerem que tanto as técnicas de hnRT-PCR como Real Time RT-PCR podem ser utilizadas como métodos complementares para o diagnóstico da raiva e são sensíveis o bastante para o uso em estudos de patogênese. A técnica de Real Time RT-PCR realizada neste estudo se mostrou eficiente em detectar o RABV em diferentes órgãos e tecidos extraneurais com a vantagem de ser uma técnica mais rápida e sensível. / This study was aimed to detect the presence of rabies virus in different organs of the genus Artibeus bats using molecular techniques such as RT-PCR, hnRT-PCR, and the Real Time RT-PCR. From about 4,000 specimens of bats received for rabies diagnosis at the Pasteur Institute, 30 bats of the genus Artibeus were then selected. The selected bats presented positive results by the traditional DFA and N2A-cells inoculation test using brain tissue suspensions. Samples of salivary glands, urinary bladders, kidneys, lungs, and fecal contents and washings of the skulls were collected for the molecular techniques testing. The organs and the fecal contents were diluted at 1:10 (w/v) and the urinary bladder, at 1:20 (w/v) and these suspensions were inoculated into N2A cells for viral isolation. The extraction of the total RNA was performed by using TRIzol® and followed by the reverse transcription and the PCR and the hnRT-PCR were performed by using specific primers for the gene encoding the protein N. The product obtained by the reverse transcription technique was submitted to the Real Time RT-PCR technique, using primers and probe specific for antigenic variant 3 of the rabies virus. Of the 30 suspensions of the brain washings, 28 (93.33%) were positive in N2A cell culture inoculation, followed by the suspensions of the salivary glands (36.67%), bladders (16.67%) and fecal contents (3.33%). For the 180 samples evaluated, the results of sensitivity found for the RT-PCR, hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques were 56.25%, 82.57%, and 82.19%, respectively. A comparison of hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques performed by Fisher\'s exact test showed that the proportion of positives detected by the brain washings, organs and of the fecal content was non-significant (P> 0.05). Regarding the results found in hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques, 100% positives were in brain washing, 90% and 93.33% in salivary glands, 83.33% and 90% in bladders, 80% and 93.33% in kidneys, 76.67% and 50% in lungs and 43.33% for both techniques on fecal contents. These results suggest that both hnRT-PCR and Real-Time PCR techniques can be used as complementary methods for the diagnosis of rabies and are sensitive enough for use in pathogenesis studies. The Real Time RT-PCR technique performed in this study proved to be faster and more sensitive and effective in detecting RABV in different organs and extra neural tissues of bats.

A computer numerical control (CNC) apparatus was used to perform droplet centrifugation, droplet DNA extraction, and rapid droplet thermocycling on a single superhydrophobic surface and a multi-chambered PCB heater. Droplets were manipulated using "wire-guided" method (a pipette tip was used in this study). This methodology can be easily adapted to existing commercial robotic pipetting system, while demonstrated added capabilities such as vibrational mixing, high-speed centrifuging of droplets, simple DNA extraction utilizing the hydrophobicity difference between the tip and the superhydrophobic surface, and rapid thermocycling with a moving droplet, all with wire-guided droplet manipulations on a superhydrophobic surface and a multi-chambered PCB heater (i.e., not on a 96-well plate). Serial dilutions were demonstrated for diluting sample matrix. Centrifuging was demonstrated by rotating a 10 muL droplet at 2300 round per minute, concentrating E. coli by more than 3-fold within 3min. DNA extraction was demonstrated from E. coli sample utilizing the disposable pipette tip to cleverly attract the extracted DNA from the droplet residing on a superhydrophobic surface, which took less than 10min. Following extraction, the 1500bp sequence of Peptidase D from E. coli was amplified using rapid droplet thermocycling, which took 10min for 30cycles. The total assay time was 23min, including droplet centrifugation, droplet DNA extraction and rapid droplet thermocycling. Evaporation from of 10 muL droplets was not significant during these procedures, since the longest time exposure to air and the vibrations was less than 5min (during DNA extraction). The results of these sequentially executed processes were analyzed using gel electrophoresis. Thus, this work demonstrates the adaptability of the system to replace many common laboratory tasks on a single platform (through re-programmability), in rapid succession (using droplets), and with a high level of accuracy and automation.