Platelet exocytosis is essential for hemostasis and for many of its sequelae. Platelets release numerous bioactive molecules stored in their granules enabling them to exert a wide range of effects on the vascular microenvironment. Are these granule cargo released thematically in a context-specific pattern or via a stochastic, kinetically-controlled process? My work describes platelet exocytosis using a systematic examination of platelet secretion kinetics. Platelets were stimulated for increasing times with different agonists (i.e. thrombin, PAR1-agonist, PAR4-agonist, and convulxin) and micro-ELISA arrays were used to quantify the release of 28 distinct α-granule cargo molecules. Agonist potency directly correlated with the speed and extent of release. PAR4-agonist induced slower release of fewer molecules while thrombin rapidly induced the greatest release. Cargo with opposing actions (e.g. pro- and anti-angiogenic) had similar release profiles, suggesting limited thematic response to specific agonists. From the release time-course data, rate constants were calculated and used to probe for underlying patterns. Probability density function and operator variance analyses were consistent with three classes of release events, differing in their rates. The distribution of cargo into these three classes was heterogeneous suggesting that platelet secretion is a stochastic process potentially controlled by several factors such as cargo solubility, granule shape, and/or granule-plasma membrane fusion routes. Sphingosine 1 phosphate (S1P) is a bioactive lipid that is stored in platelets. S1P is essential for embryonic development, vascular integrity, and inflammation. Platelets are an abundant source of S1P due to the absence of the enzymes that degrade it. Platelets release S1P upon stimulation. My work attempts to determine how this bioactive lipid is released from platelets. Washed platelets were stimulated with agonists for defined periods of time and the supernatant and pellet fractions were separated by centrifugation. Lipids were separated by liquid phase extraction and S1P was quantified with a triple quadrapole mass spectrometer. A carrier molecule (BSA) is required to detect release of S1P. Further, there is a dose-dependent increase in total S1P with increasing BSA. S1P release shows characteristics similar to other platelet granule cargo e.g. platelet factor IV (PF4). Platelets from Unc13-d Jinx mice and VAMP8-/- mice, which are secretion-deficient (dense granule, alpha granule and lysosome), were utilized to understand the process of S1P release. S1P release was more affected in Unc13-d Jinx mice mirroring their dense granule secretion defect. Fluorescence microscopy and sub-cellular fractionation were used to examine localization of S1P in platelets. S1P was observed to be enriched in a granule population. These studies indicate the existence of two pools of S1P, a readily extractable agranular pool, sensitive to BSA, and a granular pool that requires the secretion machinery for release. The secretion machinery of platelets in addition to being involved in the release of normal granule cargo is thus proved to be involved in the release of bioactive lipid molecules like S1P.

Migrena - dažnas lėtinis susirgimas, kuris daugiausiai vargina jaunus žmones. Priepuolių metu dėl skausmo ir lydinčių reiškinių yra sutrikdoma ligonių kasdienė veikla. Be to, sergantiems migrena, o ypač migrena su aura, yra 2-3 kartus padidėjusi išeminių insultų, o taip pat kitų išeminių - kraujagyslinių komplikacijų rizika. Darbo tikslas buvo laikotarpyje tarp priepuolių nustatyti moterims, sergančioms migrena su aura (MA) ir be auros (M0), ryšį su bendraisiais kardiovaskulinės rizikos veiksniais, uždegiminių žymenų specifiškumu, ląstelinės hemostazės ypatumais bei su įvairaus diametro periferinių kraujagyslių endotelio funkcijos bei standumo kitimais. Ištyrėme 60 sveikų, 30 sergančių MA ir 30 M0. M0 moterims nustatytas didesnis sistolinis ir diastolinis kraujospūdis bei hipodinamija. Neįrodytos serumo amiloido A ir C reaktyvaus baltymo sąsajos su migrenos tipais, trombocitų funkcinio aktyvumo kitimais bei su įvairaus diametro periferinių kraujagyslių standumo ar endotelio funkcijos sutrikimais. Sergančiosioms migrena buvo padidėjęs trombocitų funkcinis aktyvumas, kuris priklausė nuo migrenos formos, M0 sergančiosioms ir nuo priepuolių dažnio Migrenos grupėje endotelio funkcija buvo sutrikusi tik mikrocirkuliacijoje. MA grupėje buvo didesnė tėkmės sąlygota dilatacija nei M0. Sergančiosioms migrena nustatytas susidarančių trombocitų monocitų agregatų tiesioginis ryšys su kitimais mikrocirkuliacijoje ir atvirkštinis ryšys su endotelio funkcija smulkiosiose periferinėse... [toliau žr. visą tekstą] / Migraine is a common chronic disease that is usually suffered by young people. During the attacks due to pain and other concomitant phenomena everyday activities of the patients are interrupted. Furthermore, people with migraine, especially with migraine with aura, are subject to 2-3 bigger risk of ischaemic stroke, as well as other ischaemc-blood vessel complications. The goal of the thesis is to determine the relation between migraine with aura (MA) and without aura (M0) (in women) and common cardiovascular risk factors, particularity of inflammatory markers, particularities of cellular hemostasis, as well as changes in functionality and stiffness of endothelium of peripheral blood vessels of various diameter during period between the attacks. 60 healthy women, as well as 30 with MA and 30 with M0 participated in the research. Higher systolic and diastolic blood pressure, as well as hypodynamia was registered in the M0 group. The relation between serum amyloid A, C reactive proteine and types of migraine, changes in functional activity of platelets and changes in functionality or stiffness of endothelium of peripheral blood vessels of various diameter was not proved. Women with migraine had an increased functional activity of platelets that depended on the type of migraine, frequency of attack and was more common in women with M0. In the migraine group endothelial function was unbalanced only in microcirculation. MA group demonstrated a higher flow-induced dilation than... [to full text]

Background: Assessment of platelet vitality is important for patients presenting with inherited or acquired disorders of platelet function and for quality assessment of platelet concentrates. Methods: Herein we combined live stains with intra-vital confocal fluorescence microscopy in order to obtain an imaging method that allows fast and accurate assessment of platelet vitality. Three fluorescent dyes, FITC-coupled wheat germ agglutinin (WGA), tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate (TMRM) and acetoxymethylester (Rhod-2), were used to assess platelet morphology, mitochondrial activity and intra-platelet calcium levels. Microscopy was performed with a microlens-enhanced Nipkow spinning disk-based system allowing live confocal imaging. Results: Comparison of ten samples of donor platelets collected before apheresis and platelets collected on days 5 and 7 of storage showed an increase in the percentage of Rhod-2positive platelets from 3.6 to 47 and finally to 71%. Mitochondrial potential was demonstrated in 95.4% of donor platelets and in 92.5% of platelets stored for 7 days. Conclusion: Such fast and accurate visualization of known key parameters of platelet function could be of relevance for studies addressing the quality of platelets after storage and additional manipulation, such as pathogen inactivation, as well as for the analysis of inherited platelet function disorders. / Hintergrund: Die Vitalitätsbestimmung von Blutplättchen ist sowohl für die Analyse angeborener Plättchendefekte als auch für die Qualitätsbestimmung von Plättchenkonzentraten von zentraler Bedeutung. Methoden: In der vorliegenden Arbeit stellen wir eine Methode vor, die mittels einer Kombination von Vitalfarbstoffen und konfokaler «Real time»-Mikroskopie neue Einblicke in die Vitalitätsbestimmung lebender Plättchen ermöglicht. Mittels der Zugabe von FITC-gekoppeltem Weizenkeimlektin (WGA), Tetramethylrhodamin-Methylesterperchlorat (TMRM) und Acetoxymethylester (Rhod-2) wurde bei lebenden Blutplättchen deren Morphologie, mitochondriale Aktivität und Veränderungen im Calcium-Haushalt im Rahmen der Lagerung analysiert. Für die Mikroskopie wurde ein Nipkow-System gewählt, das eine konfokale Mikroskopie lebender Zellen ermöglicht. Ergebnisse: Der Vergleich von 10 humanen Blutplättchenproben zu Beginn bzw. nach 5 und 7 Tagen Lagerung zeigte einen Anstieg der Rhod-2-positiven Plättchen von 3,6 über 47 auf 71%. Die Anzahl der Blutplättchen mit TMRM-positiven Mitochondrien hingegen lag vor der Lagerung bei 95,4% und nach den 7 Tagen Lagerung bei 92,5%. Schlussfolgerung: Die hier vorgestellte Methodik der Bildgebung zur Bestimmung vitaler Parameter von Blutplättchen eignet sich als ergänzende Analysemodalität für eine bessere Bestimmung der Blutplättchenqualität. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Résumé confidentiel / Confidential abstract

Résumé confidentiel / Confidential abstract

Introduction: Hemostasis is a complex system in the body that maintains blood flow and prevents bleeding. Patients with platelet disorders are at the risk of mucocutaneous bleedings and at Clinical chemistry in Linköping platelet function is measured with flow cytometry. The platelet response to various agonists is measured with fluorescently labeled platelet antibodies. The aim of this study was to evaluate the stability of the frozen reagents used for platelet function testing. Further the durability of platelet antibodies after freezing and freeze-drying was tested.   Method: Platelet antibodies were prepared for freezing/freeze-drying in buffer and were analyzed at three different occasions using blood from 2 to 3 individuals with flow cytometry. Agonists and blood were added on the day of analysis. The reagent stability test was evaluated statistically using one-way ANOVA with Bonferronis post-hoc test. Results: The slight drop in percent positive platelets and median fluorescence intensity (MFI) seen over time in the reagent stability test was not statistically significant (p>0,05). All platelet antibodies could be used after freezing/freeze-drying. The results are showing a declining trend, especially for MFI values. Conclusion: The frozen reagents used for platelet function testing is stabile up to 36 months. The results from the freeze-drying/freezing indicate that all platelet antibodies keep some activity but that some are more sensitive than others. Some antibodies could not be evaluated due to concentration of agonist in the sample being too low to induce activation. Due to individual variations further studies with more participants and more agonists in their optimal concentrations are needed. / Bakgrund: Hemostas är ett komplext system i kroppen som upprätthåller blodflödet och förhindrar blödning. Mukokutana blödningar kan uppstå hos patienter som har problem i den primära hemostasen vilket kan bero på trombocydefekter. På Klinisk kemi i Linköping mäts trombocytfunktion med flödescytometri. Trombocyterna aktiveras med olika agonister och svaret på stimuli mäts genom detektion av fluoroforkonjugerade antikroppar. Syftet med denna studie var att utvärdera långtidsstabiliteten av de frysta reagens som används för trombocytfunktionsutredningen, att testa om nya trombocytantikroppar klarar att frysas och att utvärdera reagensens hållbarhet för frystorkning. Metod: Antikroppar frystorkades/frystes i buffert och analyserades vid tre tillfällen med blod från 2 till 3 personer med flödescytometri. Agonist och blod tillsattes på analysdagen. Långtidsstabilitetstestet utvärderades statistiskt med  one-way ANOVA med Bonferronis post-hoc test. Resultat: En svag nedgång över tid i procent positiva trombocyter och MFI i långtidsstabilitetstestet var inte statistiskt signifikant (p>0,05). Alla antikroppar gav signal efter frysning och frystorkning. Främst för MFI syns en nedåtgående trend över tid. Slutsats: Reagenset för trombocytfunktionsutredningen är stabilt upp till 36 månader. Resultat från frystorkningen tyder på att alla antikroppar klarar att frystorkas/frysas men vissa är känsligare än andra. Vissa antikroppar kunde inte utvärderas p.g.a. för låg agonistkoncentration för att inducera aktivering. Ytterligare försök måste göras med fler individer och fler agonister i optimal koncentration p.g.a. individuella skillnader i svar för agonister. Frystorkningsprocessen kan optimeras.

The Protein kinase C (PKC) superfamily is a key regulator in platelet activation with individual isoforms playing distinct roles. This thesis focuses on the role of the novel PKC isoforms downstream of several agonists using both pharmacological and genetic approaches and human and mouse platelets. Quantification of the protein levels of PKC isoforms identified different levels of the five major PKC isoforms expressed in human platelets and also differences between levels of the same isoform in human and mouse platelets. Use of a selection of broad spectrum and isoform-specific inhibitors, identified both positive and negative novel roles for PKC in the regulation of human and mouse platelets. A net positive role for PKC was found in GPVI, Clec-2, and PAR receptor signalling, with classical isoforms of PKC playing a major role in aggregation and dense granule secretion. A novel negative regulatory role was also identified in the regulation of ADP-induced platelet activation for PKC~, and both PKCE and PKC~ in human and mouse platelets respectively. Gene knock-out mouse models confirmed a positive regulatory role for PKCe in allb~3 outside-in signalling but identified no other regulatory role for PKCe in agonist induced platelet activation. Despite this relatively minor role, functional redundancy was identified between PKCe and PKCE isoforms in haemostasis, as tail bleeding was significantly increased in mice deficient in both novel isoforms. The work presented here identifies key roles for the PKC superfamily in the complex regulation of platelet activation, with different isoforms supporting and limiting the process of thrombus formation and haemostasis.

Le CD40 ligand (CD40L) est une molécule inflammatoire appartenant à la famille du Facteur de Nécrose Tumorale ("Tumor Necrosis Factor", TNF), originalement identifié au niveau des cellules immunitaires. L’interaction du CD40L avec son récepteur de haute affinité présent sur les cellules B, le CD40, est d’une importance cruciale à la production d’immunoglobulines lors de la réponse immunitaire. Aujourd’hui, nous savons que ces deux molécules qui constituent l’axe CD40/CD40L sont aussi exprimées au niveau des cellules du système vasculaire et occupent une place importante dans une variété de réactions inflammatoires, de sorte que le CD40L est présentement reconnu comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des évènements cardiovasculaires. Les plaquettes sont la principale source du CD40L soluble ("soluble CD40L", sCD40L) plasmatique et il fut démontré être impliqué dans l’activation plaquettaire, malgré que son impact exact sur la fonction plaquettaire et les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Ainsi, le but de ce projet était de déterminer l’impact du sCD40L sur la fonction plaquettaire et d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Les objectifs spécifiques étaient : 1) d’évaluer l’impact du sCD40L sur l’activation et l’agrégation plaquettaire in vitro; 2) de déterminer le récepteur cible (CD40 ou autre) impliqué dans ces effets; 3) de décortiquer les voies signalétiques intracellulaires et moléculaires induites par le sCD40L, impliquant la participation potentielle de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor", TRAF) et 4) d’analyser l’effet du sCD40L sur la formation du thrombus in vivo. Le sCD40L augmente fortement l’activation et l’agrégation plaquettaire induite par de faibles doses d’agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n’interagit pas avec le CD40 et les plaquettes de souris CD40 déficientes (CD40-/-) ne furent pas en mesure d’induire ces effets. De plus, nous démontrons la présence de plusieurs membres de la famille des TRAFs dans les plaquettes, parmi lesquels seulement TRAF-2 interagit avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Le sCD40L agit sur les plaquettes au repos par l’entremise de la protéine Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase activatrice du mitogène p38 ("Mitogen Activating Protein Kinase", MAPK). Ceci mène ultimement au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l’actine. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les souris CD40-/- démontrent un défaut significatif de l’agrégation plaquettaire en réponse au collagène, ce qui souligne l’importance du CD40 dans les interactions plaquettes-plaquettes. Dans un deuxième temps, le sCD40L amplifie l’agrégation plaquettaire en sang complet, accélère les temps de thrombose in vitro mesurés à l’aide du système PFA-100 et augmente l’adhésion plaquettaire au collagène sous condition de flux, le tout par l’entremise du CD40. Finalement, dans un modèle de thrombose artérielle murin, l’infusion du sCD40L exacerbe la formation du thrombus chez les souris du type sauvage ("Wild Type", WT), mais non chez les souris CD40-/-. Ceci fut en plus associé à une augmentation significative du nombre de leucocytes au sein du thrombus des souris WT traitées à l’aide du sCD40L, tel que démontré par marquage immuno-histologique anti-CD45 et par quantification des coupes artérielles par microscopie optique. En résumé, ce projet identifie une nouvelle voie signalétique, TRAF-2/Rac1/p38 MAPK, en réponse au sCD40L et démontre ses effets sur l’activation et l’agrégation plaquettaire. De manière encore plus importante, nous démontrons pour la première fois la présence d’une corrélation positive entre les niveaux circulants du sCD40L et la thrombose artérielle, tout en soulignant l’importance du CD40 dans ce processus. Ainsi, le sCD40L constitue un activateur important des plaquettes, les prédisposant à une thrombose exacerbée en réponse au dommage vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer le lien étroit qui existe entre les niveaux circulants du sCD40L et l’incidence des maladies cardiovasculaires. / CD40 ligand (CD40L) is an inflammatory molecule of the tumor necrosis factor (TNF) superfamily originally identified on cells of the immune system. Interaction of CD40L with its respective receptor on B cells, CD40, is of critical importance for immunoglobulin isotype switching during the immune response. Today, we know that these two molecules are also present on cells of the vascular system and have important implications in various inflammatory reactions, such that CD40L is now regarded as a thrombo-inflammatory molecule that predicts cardiovascular events. Platelets constitute the major source of soluble CD40L (sCD40L) found in plasma and it has been shown in return to influence platelet activation, albeit the exact functional impact and underlying mechanisms remain undefined. Hence, this project was designed to investigate the effects of sCD40L on platelet function and to elucidate the cellular and molecular mechanisms involved. The specific aims of this study are four fold: 1) evaluate the impact of sCD40L on platelet activation and aggregation in vitro; 2) determine through which receptor (CD40 or other) these responses are mediated; 3) elucidate the underlying intracellular signalling pathways and molecular mechanisms involved, including the potential participation of the Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor (TRAF) family and 4) assess the impact of sCD40L on thrombus formation in vivo. sCD40L strongly enhances activation and aggregation of washed human platelets induced by sub-threshold concentrations of agonists. Human platelets treated with a mutated form of sCD40L that does not bind CD40 and CD40 deficient (CD40-/-) mouse platelets failed to elicit such responses. Furthermore, we found that platelets express multiple members of the TRAF family, among which only TRAF-2 associates with CD40 upon sCD40L stimulation. Noticeably, sCD40L primes resting platelets through activation of the small GTPase Rac1 and its downstream target p38 mitogen activating protein kinase (MAPK), which leads to platelet shape change and actin polymerization. Interestingly, CD40-/- mice exhibit impaired platelet aggregation in response to collagen, thus highlighting the importance of CD40 in platelet-platelet interactions. Moreover, sCD40L dose-dependently enhances whole blood platelet aggregation and accelerates platelet function analyzer (PFA)-100 closure times in a CD40-dependant fashion. Preincubation of whole blood with sCD40L significantly increases platelet adhesion to collagen in an ex-vivo perfusion system under flow. In addition, in a ferric chloride-induced murine arterial thrombosis model, infusion of sCD40L exacerbates thrombus formation in wild type (WT), but not in CD40-/- mice. This was further associated with increased leukocyte infiltration within the thrombus mass of WT mice treated with sCD40L. In this project, we identify a new TRAF-2/Rac1/p38 MAPK signaling pathway in response to sCD40L and its effects on platelet activation and aggregation. More importantly, we establish a direct positive correlation between levels of sCD40L and thrombus formation in vivo, while highlighting the requirement of CD40 in this process. Thus, sCD40L is an important platelet primer predisposing platelets to enhanced thrombus formation in response to vascular injury. These results may explain the link between circulating levels of sCD40L and the occurrence of cardiovascular diseases.

Le CD40 est un membre de la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale ("Tumour necrosis factor", TNF), initialement identifié sur des cellules de carcinome de la vessie. L'interaction du CD40 avec son ligand (CD40L) est d'une importance cruciale pour le développement des cellules B et de la commutation d'isotype au cours de la réponse immunitaire acquise. L'expression du complexe CD40/CD40L était initialement cru d'être limiter aux cellules du système immunitaire, mais aujourd'hui il est bien connu que ce complexe est également exprimé sur les cellules du système circulatoire et vasculaire, et est impliqué dans diverses réactions inflammatoires; de sorte que le CD40L est maintenant considéré comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des événements cardiovasculaires. Les plaquettes expriment constitutivement le CD40, alors que le CD40L n'est exprimé que suite à leur l'activation. Il est ensuite clivé en sa forme soluble (sCD40L) qui représente la majorité du sCD40L en circulation. Il fut démontré que le sCD40L influence l'activation plaquettaire mais son effet exact sur la fonction plaquettaire, ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à son action demeurent inconnus. Ainsi, ce projet a été entrepris dans le but d’adresser les objectifs spécifiques suivants: 1) évaluer les effets in vitro du sCD40L sur l'activation et l'agrégation plaquettaire; 2) identifier les récepteurs plaquettaires impliqués dans l’action du sCD40L; 3) élucider les voies signalétiques intracellulaires induits par le sCD40L; 4) évaluer les effets du sCD40L sur la formation de thrombus in vivo. Nous avons trouvé que le sCD40L augmente fortement l'activation et l'agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations d'agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n'interagit pas avec le CD40, et les plaquettes de souris déficientes en CD40 ne furent pas en mesure d'induire de telles réponses, indiquant que le récepteur principal du sCD40L au niveau des plaquettes est le CD40. En plus, nous avons identifié la présence de plusieurs membres de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("TNF receptor-associated factor", TRAF) dans les plaquettes et nous avons montré que seulement le TRAF2 s'associe avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Nos résultats indiquent aussi que le sCD40L agisse sur les plaquettes au repos par l'entremise de deux voies signalétiques distinctes. La première voie implique l'activation de la petite GTPase Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase p38 activée par le mitogène ("p38 mitogen-activated protein kinase", p38 MAPK ), menant au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l'actine; alors que la deuxième voie implique l'activation de la cascade signalétique du NF-kB. Par ailleurs, à la suite d'une lésion artérielle induite par le chlorure de fer, le sCD40L exacerbe la formation de thrombus et l'infiltration leucocytaire au sein du thrombus dans les souris du type sauvage, mais pas chez les souris déficientes en CD40. En conclusion, ce projet a permis d'identifier pour la première fois deux voies signalétiques distinctes en aval du CD40 plaquettaire et a permis d'établir leur implication dans l'activation et l'agrégation plaquettaire en réponse au sCD40L. De manière plus importante, ce projet nous a permis d'établir un lien direct entre les niveaux élevés du sCD40L circulant et la formation de thrombus in vivo, tout en soulignant l'importance du CD40 dans ce processus. Par conséquent, l'axe CD40/CD40L joue un rôle important dans l'activation des plaquettes, les prédisposant à une thrombose accrue en réponse à une lésion vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer en partie la corrélation entre les taux circulants élevés du sCD40L et l'incidence des maladies cardiovasculaires. / CD40 is a member of the tumour necrosis factor (TNF) receptor family, originally identified on human bladder carcinoma cells. Interaction of CD40 with its ligand (CD40L) is of crucial importance for B cell development and immunoglobulin isotype switching during the adaptive immune response. Expression of the CD40/CD40L dyad was initially thought to be restricted to cells of the immune system, but today it is known to be also expressed on cells of the circulatory and vascular systems, and have important implications in various inflammatory reactions, such that CD40L is now regarded as a thrombo-inflammatory molecule and a reliable predictor of cardiovascular events. Platelets constitutively express CD40, whereas CD40L is expressed upon activation and subsequently cleaved into its soluble form (sCD40L), accounting for the majority of circulating sCD40L. Soluble CD40L has been shown to influence platelet activation but its precise effect on platelet function, and the underlying cellular and molecular mechanisms remain undefined; hence the purpose of this project. The specific aims of this study are: 1) to evaluate the in vitro effects of sCD40L on platelet activation and aggregation; 2) to determine the receptor(s) on platelets involved in the action of sCD40L; 3) to elucidate the intracellular signalling pathways induced by sCD40L; and 4) to evaluate the in vivo effects of sCD40L on thrombus formation. We have showed that sCD40L strongly enhances activation and aggregation of washed human platelets in response to sub-threshold concentrations of agonists. Human platelets treated with a mutated form of sCD40L that lacks CD40 binding, and platelets from CD40 deficient mice failed to elicit such responses, indicating that CD40 is the major platelet receptor for sCD40L. Moreover, we identified the presence of multiple members of the TNF receptor-associated factor (TRAF) in platelets and showed that only TRAF2 associates with CD40 after sCD40L stimulation. Interestingly, sCD40L primes resting platelets through two distinct signalling pathways. The first pathway involves activation of the small GTPase Rac1 and its downstream target p38 mitogen-activated protein kinase, leading to platelet shape change and actin polymerization; whereas the second pathway involves activation of the NF-κB signalling cascade. Furthermore, sCD40L exacerbates thrombus formation and leukocyte infiltration within the thrombus mass in wild-type mice but not in CD40 deficient mice following ferric chloride-induced arterial injury. In conclusion, we have identified for the first time two distinct signalling pathways downstream of platelet CD40, and established their implication in platelet activation and aggregation in response to sCD40L. Noticeably, we established a direct link between elevated levels of sCD40L and in vivo thrombus formation, while emphasizing the requirement of CD40 in this process. Therefore, the CD40/CD40L dyad plays an important role in platelet priming that predisposes platelets to enhanced thrombus formation in response to vascular injury. These results may partly explain the correlation between elevated circulating levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular diseases.

La famille des protéines kinases C (PKC) est essentielle pour la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine qui signale et active les plaquettes via les proteases activated receptors (PAR-1 et PAR-4) et le GPIbα. Ces derniers constituent les récepteurs de moyenne/faible et de hautes affinités pour la thrombine, respectivement. L’isoforme PKCδ régule positivement ou négativement la fonction des plaquettes tout dépendamment de la nature du stimulus. Cependant, son importance dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine en aval de la GPIbα reste inconnue. L’objectif principal de ce projet de doctorat était de déterminer l'implication de l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans la fonction plaquettaire et d’évaluer le rôle de cet axe dans la régulation de la thrombose. Dans les plaquettes humaines, le prétraitement avec l'inhibiteur spécifique de la PKCδ δ(V1-1)TAT, a significativement potentialisé l'activation et l’agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations de α-thrombine, mais pas en réponse à la γ-thrombine ou aux agonistes des PARs. Ce phénomène de potentialisation a été associé à une sécrétion accrue de granules, de génération de thromboxane A2 (TXA2) et une phosphorylation de la PKCδ sur la Tyr311, qui ont toutes été prévenues par l’inhibition spécifique du GPIbα à l’aide d’un anticorps monoclonal bloquant. En outre, l'inhibition de la p38 MAPK, ERK1/2 et le TXA2 a inversé ce processus de potentialisation. Les plaquettes murines déficientes en PKCδ étaient aussi plus réactives à la thrombine et ont montré une augmentation significative de l'agrégation, alors qu’une étude menée in vivo chez la souris PKCδ- /- a montré, suite à une stimulation par α-thrombine, une réaction thrombotique accrue caractérisée par une diminution significative du temps de saignement ainsi qu’une formation de thrombo-embolies pulmonaires. En bloquant le GPIbα, ces effets ont été renversés. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle de la PKCδ dans les plaquettes en aval de GPIbα, où elle régule négativement la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine. Ainsi, l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans les plaquettes pourrait représenter un régulateur critique de la fonction plaquettaire et l'hémostase, et le dysfonctionnement de cette voie pourrait conduire à des événements thrombotiques. / The protein kinase C (PKC) family is essential for platelet function in response to thrombin, which signals and activates platelets via protease-activated receptors (PARs) and GPIbα, the low/medium and high affinity receptors in human platelets, respectively. PKCδ positively and negatively regulates platelet function depending on the nature of the stimulus. However, its importance in platelet function in response to thrombin downstream of GPIbα remains unknown. Here, we aimed to determine the involvement of the thrombin/GPIbα/PKCδ axis in platelet function and investigate the relevance of this axis in regulating thrombosis. In human platelets, pre-treatment with the specific PKCδ inhibitor δ(V1-1)TAT significantly potentiated platelet activation and aggregation in response to a priming concentration of α-thrombin, but not to γ-thrombin or PAR agonists. This potentiation process was associated with enhanced granule secretion, TXA2 generation and PKCδ phosphorylation on Tyr311, all of which were prevented by GPIbα blockade. Moreover, inhibition of p38 MAPK, Erk1/2 and TXA2 reverses this potentiation process. Platelets from PKCδ-/- mice show increased aggregation, whereas PKCδ-/- mice exhibit significantly decreased in vivo tail bleeding times and exacerbated pulmonary thrombo-emboli in response to α-thrombin. Blockade of GPIbα protects PKCδ-/- mice from these effects. This study adds new insights into the role of PKCδ in platelets downstream of GPIbα, where it negatively regulates platelet function in response to thrombin. Thus, the thrombin/GPIbα/PKCδ axis in platelets may represent a critical regulator of platelet function and hemostasis, and dysfunction of this pathway could lead to adverse thrombotic events.