Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin. / Bone development and homeostasis need a large amount of molecular signals to be finely regulated in time and space. These signals lead to the activation or to the inhibition of different transcription factors, which are implicated in the control of osteoblast and chondrocyte proliferation and differentiation. The integrity of these mechanisms is required in order to have a healthy life. Indeed, if one of these mechanisms is dysfunctional, different diseases could develop such as hypophosphatemia, osteoporosis and osteoarthritis (OA). In order to contribute to the comprehension of bone biology, the present thesis describes new mechanisms for the transcriptional regulation of two genes implicated in bone development and regulation: PITX1 (Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1) and PHEX (Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome). The first mechanism described in this thesis relates to the transcriptional regulation of PITX1, a gene that encodes for a member of the homeobox family of transcription factors. PITX1 is required in bone development of inferior members and in the maintenance of the articular cartilage integrity in adults. Thereby, we showed that in articular chondrocytes, the expression of PITX1 is activated after the transcription factor E2F1 was recruited at two response elements in the proximal region of its promoter. Moreover, in articular chondrocytes from OA patients, we observed that the expression of PITX1 is strongly decreased. We proposed that the mechanism responsible for this repression requires the multitask protein Prohibitin (PHB1), which is strongly accumulated in OA chondrocyte nuclei, but not in chondrocyte nuclei from healthy individuals. The second mechanism described in this thesis reports a transcriptional mechanism by which PHEX, the gene that encodes for the peptidase mutated in the syndrome X-Linked Hypophosphatemia (XLH)and characterized by hypophosphatemia and osteomalecia, is repressed. We showed that the treatment of osteoblasts with the Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) induced a decrease in PHEX expression. In order to characterize the mechanism responsible for this repression, we performed gene reporter experiments and identified two response elements for the transcription factor E4BP4 in the PHEX promoter. The downregulation of E4BP4 by siRNA led to the validation that this repressor decreased the expression of PHEX in osteoblasts after their treatment with PTHrP. In conclusion, the new transcriptional mechanisms presented in this thesis allow a better understanding of PITX1 and PHEX expression. Moreover, the potential role of PHB1 in the establishment of OA presents many interesting possibilities regarding the treatment and diagnosis of this disease. Finally, the characterization of E4BP4 as a mediator of PHEX repression by the PTHrP suggests that E4BP4 could be implicated in the control of bone mineralization and phosphate levels in the blood.

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire. / Post-transcriptional regulation plays a major role in the fine tuning of gene expression by allowing a modulation of protein synthesis in space and time, according to cellular requirements. For instance, proteins recognizing RNA elements on transcripts can influence all the steps of their existence, such as their splicing, nuclear export, subcellular localization, translation and degradation. Staufen1 (Stau1) is a member of the double-stranded RNA-binding protein family that contributes to the post-transcriptional regulation of gene expression by its involvement in mechanisms that promote alternative splicing, transport, de-repression of translation and decay of specific messenger RNAs (mRNAs). The identity of potential Stau1 targets is now known as genome-wide analyses have shown that the protein is associated with about 7% of the HEK293T cell transcriptome. Although these mRNAs are classified in a broad range of functional categories, a large proportion of them code for proteins related to cellular metabolism and regulation of cellular processes. Considering all this information, we hypothesized that the different activities of Stau1 may be modulated in order to control appropriately the expression of Stau1-bound mRNAs. Since some of the mRNAs that are part of Stau1-containing complexes encode key regulators of cell proliferation, we wanted to examine whether Stau1 expression fluctuates during the cell division cycle. We showed that Stau1 abundance peaks at the onset of mitosis and then decreases as cells complete division. We then found that Stau1 down-regulation in mitosis exit is mediated by the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C). To support the idea that Stau1 is a target of this E3-ubiquitin ligase, we further demonstrated that Stau1 is ubiquitinated and degraded by the proteasome. The importance of controlling Stau1 levels during the cell cycle is underscored by the observation that its overexpression delays mitotic exit and impairs cell proliferation. Furthermore, we speculated that Stau1 different functions may also be regulated. In the view that the activities of numerous RNA-binding proteins can be controlled by post-translational modifications such as phosphorylation, we tested the possibility that Stau1 is phosphorylated. Mass spectrometry analysis of immunopurified Stau1 allowed the identification of three phosphosites in this protein. Assessment of the role of these phosphorylation events using phosphomimetic or non-phosphorylatable mutants revealed that Stau1 phosphorylation may compromise its association with Upf1. Because this interaction is necessary to elicit the destabilisation of Stau1-bound RNAs, our results strongly suggest that Stau1 function in mRNA decay is negatively regulated by its phosphorylation. Collectively, these data highlight the importance of post-translational modifications such as ubiquitination and phosphorylation in the modulation of Stau1 expression and functions. Overall, the mechanisms that control Stau1 are likely to have a significant impact on the fate of Stau1-bound mRNAs, especially in the context of cell cycle progression.

Problématique : Le concept d’« Hôpital promoteur de santé » (HPS) a émergé dans le sillon de la Charte d’Ottawa (1986) qui plaide notamment pour une réorientation des services de santé vers des services plus promoteurs de santé. Il cible la santé des patients, du personnel, de la communauté et de l’organisation elle-même. Dans le cadre de la réforme du système de santé au Québec qui vise à rapprocher les services de la population et à faciliter le cheminement de toute personne au sein d’un réseau local de services de santé et de services sociaux (RLS), l’adoption du concept HPS semble constituer une fenêtre d’opportunité pour les CHU, désormais inclus dans des réseaux universitaires intégrés de soins de santé et rattachés aux RLS, pour opérer des changements organisationnels majeurs. Face au peu de données scientifiques sur l’implantation des dimensions des projets HPS, les établissements de santé ont besoin d’être accompagnés dans ce processus par le développement de stratégies claires et d’outils concrets pour soutenir l’implantation. Notre étude porte sur le premier CHU à Montréal qui a décidé d’adopter le concept et d’implanter notamment un projet pilote HPS au sein de son centre périnatal. Objectifs : Les objectifs de la thèse sont 1) d’analyser la théorie d’intervention du projet HPS au sein du centre périnatal; 2) d’analyser l’implantation du projet HPS et; 3) d’explorer l’intérêt de l’évaluation développementale pour appuyer le processus d’implantation. Méthodologie : Pour mieux comprendre l’implantation du projet HPS, nous avons opté pour une étude de cas qualitative. Nous avons d’abord analysé la théorie d’intervention, en procédant à une revue de la littérature dans le but d’identifier les caractéristiques du projet HPS ainsi que les conditions nécessaires à son implantation. En ce qui concerne l’analyse d’implantation, notre étude de cas unique a intégré deux démarches méthodologiques : l’une visant à apprécier le niveau d’implantation et l’autre, à analyser les facteurs facilitants et les contraintes. Enfin, nous avons exploré l’intérêt d’une évaluation développementale pour appuyer le processus d’implantation. À partir d’un échantillonnage par choix raisonnés, les données de l’étude de cas ont été collectées auprès d’informateurs clés, des promoteurs du projet HPS, des gestionnaires, des professionnels et de couples de patients directement concernés par l’implantation du projet HPS au centre périnatal. Une analyse des documents de projet a été effectuée et nous avons procédé à une observation participante dans le milieu. Résultats : Le premier article sur l’analyse logique présente les forces et les faiblesses de la mise en oeuvre du projet HPS au centre périnatal et offre une meilleure compréhension des facteurs susceptibles d’influencer l’implantation. Le second article apprécie le niveau d’implantation des quatre dimensions du projet HPS. Grâce à la complémentarité des différentes sources utilisées, nous avons réussi à cerner les réussites globales, les activités partiellement implantées ou en cours d’implantation et les activités reposant sur une théorie d’intervention inadéquate. Le troisième article met en évidence l’influence des caractéristiques de l’intervention, des contextes externe et interne, des caractéristiques individuelles sur le processus d’implantation à partir du cadre d’analyse de l’implantation développé par Damschroder et al. (2009). Enfin, le dernier article présente les défis rencontrés par la chercheure dans sa tentative d’utilisation de l’évaluation développementale et propose des solutions permettant d’anticiper les difficultés liées à l’intégration des exigences de recherche et d’utilisation. Conclusion : Cette thèse contribue à enrichir la compréhension de l’implantation du projet HPS dans les établissements de santé et, particulièrement, en contexte périnatal. Les résultats obtenus sont intéressants pour les chercheurs et les gestionnaires d’hôpitaux ou d’établissements de santé qui souhaitent implanter ou évaluer les projets HPS dans leurs milieux. / Problem: The concept of health promoting hospitals (HPH) emerged in the wake of the 1986 Ottawa Charter, which notably calls for the reorientation of health services toward more health promoting services. The concept targets the health of patients, staff, the community and the organization itself. In the context of Quebec’s health system reform that aims to bring services closer to the population and facilitates the journey of any person within a local network of health and social services (RLS), the adoption of the HPH concept appears to be a window of opportunity for teaching hospitals, now included in integrated university health care networks (RUIS) and linked to RLS, to carry out major organizational changes. Given the paucity of evidence regarding implementation of the different dimensions of HPH projects, there is a need for health care facilities to be accompanied in this process through the development of clear-cut strategies and practical tools in order to support implementation. Our study will focus on the first university hospital in Montreal that decided to adopt the concept and implement a HPH pilot project within its perinatal centre. Objectives: The objectives of this thesis are 1) to analyse the intervention theory underlying the HPH project; 2) to analyse the implementation of the HPH project; and 3) to explore the potential of developmental evaluation as a means of supporting the implementation process. Methods: To better understand the implementation of the HPS project, we opted for a qualitative case study. We first analyzed the theory of intervention by conducting a literature review in order to identify the characteristics of an HPS project as well as the conditions necessary for its implementation. Then, as regards the implementation analysis, our single case study had two methodological approaches: one to assess the level of implementation and the other to analyze facilitators and barriers to implementation. Finally, we explored the interest of using developmental evaluation to support the implementation process. Based on purposeful sampling, data of the case study were collected from key informants, HPH project promoters, managers, professionals and couples of patients directly concerned by the HPH project implementation in the perinatal centre. A documentary analysis of project documents has been done and participant observation was conducted in the setting. Results: The first article is about a logical analysis that presents the strengths and weaknesses of the implementation of the HPH project within the birthing centre, and offers a deeper comprehension of the factors likely to influence implementation. The second article assesses the level of implementation of the four dimensions of the HPH project. The complementarity of the different sources used allowed us to identify global successes, activities that were implemented only partially or still in the process of implementation, and activities that were based on an inadequate intervention theory. The third article shows the influence of intervention characteristics, outer and inner settings, and individual characteristics upon the implementation process, using the consolidated framework for implementation research developed by Damschroder et al. (2009). The fourth and final article highlights the challenges encountered by the researcher in attempting to use developmental evaluation, and puts forth solutions that will enable researchers to anticipate the difficulties that can emerge from integrating the demands of research and of utilization. Conclusion: This thesis contributes to the understanding of HPH project implementation in health care facilities, particularly within a perinatal care context. The results we have obtained are of interest to researchers as well as hospital or health care facility administrators who wish to implement or evaluate HPH projects.

Pour mon travail de thèse Doctorat j'ai rejoint l'hôpital Saint Louis à Paris sous la direction scientifique Dr. Fabien Calvo. L'objectif principal de mon travail de doctorat Es Science était de développer des modèles cellulaires de cancer du sein humain afin d'étudier les effets d'agents anticancéreux. En parallèle, j'ai étudié l'expression des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) dans les cellules d'adénocarcinome mammaire humain ainsi que leur modulation par l'IFN-g. J'ai montré que l'induction de l'expression des antigènes du CMH était associée à la résistance à la lyse par les cellules NK et cellules LAK et à l'augmentation de la susceptibilité à la lyse mediée par l'anticorps (Antibody Dependent Cytotoxicity ADCC). Ces travaux ont fait l'objet de plusieurs publications dans des journaux avec comité de sélection (Jabrane-Ferrat 1-6 et de thèse de Doctorat de l'Université Scientifique et Médicale de Grenoble en Juin 1988).<br />Lors de mon travail post-doctoral à l'université de Californie San Francisco, j'ai travaillé sur les aspects moléculaires de la régulation de l'expression des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII).<br />Dans une première phase nous avons définit les aspects structuraux des gènes CMHII et leur niveau de méthylation et du compactage de la chromatine. Nous avons montré que MDBP forme un complexe avec la boîte X du DRA et que le complexe MDBP qui est équivalent à l'activité EF-C (protéine qui se lie sur la séquence enhancer du virus du polyome), EP (protéine qui se lie sur la séquence enhancer de l'hépatite B) et MIF (une séquence intronique de c-myc) contient RFX-1 (Zhang, Jabrane-Ferrat et al. 1993).<br />Ensuite, j'ai montré que la boîte pyrimidine tract contenait une séquence GGAAG présente dans les séquences consensus reconnues par la famille de protéines de l'oncogène Ets-1. Ainsi, j'ai démontré le rôle de l'oncogène Ets-1 dans l'expression d'un taux élevé des gènes du CMH II dans les cellules B et les cellules dendritiques. Ce travail a été publié dans MCB (Jabrane-Ferrat et al. 1994).<br />En plus de la séquence TATA, le promoteur HLA-DRA possède une séquence Octamer qui fixe les facteurs Oct1 (expression ubiquitaire) et Oct2 (expression spécifique aux cellules B). Les mutations du site TATA ne semblent pas affecter l'expression du promoteur, alors que toutes mutations du site octamer réduisent l'expression du promoteur. Nous avons substitué la séquence Octamer-TATA par la boîteTATA de l'adénovirus E1b et montré que cette mutation par substitution enlève la dépendance du site octamer. Nous avons également montré que la boîteTATA de E1b fixe le facteur TBP, tandis que celle du promoteur DRA ne le fixe pas. Cela nous a permis de conclure qu'au niveau du promoteur HLA-DRA, la boîteTATA n'est pas fonctionnelle et que la séquence Octamer joue un rôle dans le recrutement du TBP à la machinerie de transcription basale (TBP, Pol II et TAFs) (Voliva, Jabrane-Ferrat and Peterlin 1995).<br />Après clonage du facteur OCA-B, activateur spécifique des cellules B qui interagit de façon équivalente avec les protéines Oct-1 et Oct-2 liée au site octamer, nous avons décrit la première interaction entre deux co-activateurs tissu-spécifiques: CIITA et OCA-B. Nous avons montré que le CIITA et OCA-B interagissent directement et agissent de facon synergique au niveau du promoteur HLA-DRA. Nos résultats suggèrent qu'au niveau des promoteurs de classe II le CIITA permet de recruter un second activateur OCA-B ceci permet d'exposer deux surfaces d'activation pour une interaction avec les TAFs (TBP associated factors [12]) et la machinerie de transcription de base. Ou encore que OCA-B via son interaction avec TBP et d'autres TAFs créerait un complexe qui fixerait le CIITA avec une plus grande affinité et activerait la transcription avec une plus grande éfficacité. La formation d'un complexe multiprotéique entre les protéines régulatrices et le complexe de préinitiation serait responsable de l'expression des gènes de classe II et probablement d'autres gènes impliqués dans la réponse immunitaire. L'absence de l'expression d'OCA-B dans les cellules traitées par l'IFN-g pourrait-être responsable en partie du faible niveau d'expression des gènes de classe II dans les cellules présentatrices d'antigènes et dans les cellules somatiques (Fontes, Jabrane-Ferrat et al. 1996).<br />Des observations préliminaires nous ont permis de postuler que la boîte S est une duplication ancestrale de la boîteX. Dont le but de confirmer ce postulat, j'ai montré que la délétion de la boîte S est nécessaire à l'expression du promoteur DRA dans les cellules B et que les promoteurs du CMHII sont soumis à des contraintes spaciales très rigides. L'espace entre les boîtes S et X ne peut pas être modifié. De plus nous travaux nous permis de suggérer que non seulement les séquences X et S fixent la même protéine mais en plus il existe des interactions entre les protéines se fixant au niveau de la boîte X et au niveau de de la boîte S (Jabrane-Ferrat et al. 1996).<br />Pour confirmer que le rôle de la boîte S in vivo et déterminer son importance dans la régulation de l'expression des gènes CMHII, nous avons montré que RFX1 peut lier la séquence X en l'absence des autres séquences promotrices. La présence de la boîte Y permet de favoriser et d'augmenter la fixation de RFX5 par rapport à celle de RFX1. La boîte S quand à elle, elle augmente la fixation de RFX1 et de RFX5. Nos résultats ont suggéré que les boîtes S et Y permettent de sélectionner spécifiquement RFX5 (Fontes, Jabrane-Ferrat et al. 1996 et 1997). <br />L'ensemble des travaux résumés ici sont repris en détail dans ce mémoire d'habilitation à diriger des recherches.<br /><br /><br /><br /><br /><br /> <br /><br /><br />EXPOSE DES TRAVAUX DE RECHERCHE<br /><br />I. INTRODUCTION<br /><br />Les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII) ainsi que ceux nécessaires à la dégradation et à la présentation de l'antigène sont régulés de manière coordonnée dans les cellules. Leurs promoteurs contiennent des séquences régulatrices en cis (CUS) qui lient les complexes protéiques composés du facteur régulateur X (RFX) et le facteur nucléaire Y (NFY) (Reith et al. 2000, revue). Ces facteurs sont non seulement recrutés au niveau du promoteur de manière coopérative mais ils forment également une plateforme capable de recruter le trans-activateur du CMHII (CIITA). Le recrutement de CIITA permet ainsi l'initiation et l'élongation de la transcription des gènes du CMHII localisés sur le bras court du chromosome 6 (Fontes et al. 1999, Kanazawa et al. 2000). Notre compréhension, de ce système de régulation, a été favorisée par des analyses génétiques et biochimiques du syndrome du lymphocyte nu (BLS) (Gricelli et al. 1989, Lisowska-Gropierre et al. 1994) dont les patients ont été répértoriés en différents groupes de complémentation. Les mutations responsables de cette immunodéficience, ont été identifiées pour quatres groupes de complémentation et affectent les trois sous-unités de RFX (Steimle et al. 1995, Masternak et al. 1998, Nagarajan et al. 1999) ainsi que le CIITA (Steimle et al. 1993). Dans le dernier groupe (5eme) de BLS, seuls les promoteurs en direction du télomère sont transcrits et par conséquent ils se traduisent par l'absence d'expression de certains isotypes du CMHII. La transcription des gènes impliqués dans la dégradation et la présentation de l'antigène par les déterminants du CMHII est une nécessite absolue pour une immunité adaptative. L'équipe que je souhaite créer aura pour but de pousuivre la dissection des mécanismes moléculaires qui permettent les interactions ADN-protéines et protéine-protéine au niveau du promoteur, leurs fonctions, la régulation du CIITA et sa capacité à coordonner différentes activités de l'ARN polymerase II (ARNPII), recréer ce complexe de régulation dans un système de transcription in vitro. Notre but à long terme est d'utiliser les connaissances que nous allons acquérir pour l'obtention d'un vaccin anti-tumoral.

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin. / Bone development and homeostasis need a large amount of molecular signals to be finely regulated in time and space. These signals lead to the activation or to the inhibition of different transcription factors, which are implicated in the control of osteoblast and chondrocyte proliferation and differentiation. The integrity of these mechanisms is required in order to have a healthy life. Indeed, if one of these mechanisms is dysfunctional, different diseases could develop such as hypophosphatemia, osteoporosis and osteoarthritis (OA). In order to contribute to the comprehension of bone biology, the present thesis describes new mechanisms for the transcriptional regulation of two genes implicated in bone development and regulation: PITX1 (Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1) and PHEX (Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome). The first mechanism described in this thesis relates to the transcriptional regulation of PITX1, a gene that encodes for a member of the homeobox family of transcription factors. PITX1 is required in bone development of inferior members and in the maintenance of the articular cartilage integrity in adults. Thereby, we showed that in articular chondrocytes, the expression of PITX1 is activated after the transcription factor E2F1 was recruited at two response elements in the proximal region of its promoter. Moreover, in articular chondrocytes from OA patients, we observed that the expression of PITX1 is strongly decreased. We proposed that the mechanism responsible for this repression requires the multitask protein Prohibitin (PHB1), which is strongly accumulated in OA chondrocyte nuclei, but not in chondrocyte nuclei from healthy individuals. The second mechanism described in this thesis reports a transcriptional mechanism by which PHEX, the gene that encodes for the peptidase mutated in the syndrome X-Linked Hypophosphatemia (XLH)and characterized by hypophosphatemia and osteomalecia, is repressed. We showed that the treatment of osteoblasts with the Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) induced a decrease in PHEX expression. In order to characterize the mechanism responsible for this repression, we performed gene reporter experiments and identified two response elements for the transcription factor E4BP4 in the PHEX promoter. The downregulation of E4BP4 by siRNA led to the validation that this repressor decreased the expression of PHEX in osteoblasts after their treatment with PTHrP. In conclusion, the new transcriptional mechanisms presented in this thesis allow a better understanding of PITX1 and PHEX expression. Moreover, the potential role of PHB1 in the establishment of OA presents many interesting possibilities regarding the treatment and diagnosis of this disease. Finally, the characterization of E4BP4 as a mediator of PHEX repression by the PTHrP suggests that E4BP4 could be implicated in the control of bone mineralization and phosphate levels in the blood.

Une cascade de facteurs de transcription composée de SIM1, ARNT2, OTP, BRN2 et SIM2 est requise pour la différenciation des cinq types cellulaires qui peuplent le noyau paraventriculaire (PVN) de l’hypothalamus, un régulateur critique de plusieurs processus physiologiques essentiels à la survie. De plus, l’haploinsuffisance de Sim1 est aussi une cause d’hyperphagie isolée chez la souris et chez l’homme. Nous désirons disséquer le programme développemental du PVN, via une approche intégrative, afin d’identifier de nouveaux gènes qui ont le potentiel de réguler l’homéostasie chez l’individu adulte. Premièrement, nous avons utilisé une approche incluant l’analyse du transcriptome du PVN à différents stades du développement de la souris pour identifier de tels gènes. Nous avons comparé les transcriptomes de l’hypothalamus antérieur chez des embryons de souris Sim1+/+ et Sim1-/- à E12.5 issus de la même portée. De cette manière, nous avons identifié 56 gènes agissant en aval de Sim1 dont 5 facteurs de transcription - Irx3, Sax1, Rxrg, Ror et Neurod6. Nous avons également proposé un modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur. Selon ce modèle, les gènes qui occupent un domaine médial dans la zone du manteau caractérisent des cellules qui peupleront le PVN alors que les gènes qui ont une expression latérale identifient des cellules qui donneront plus tard naissance aux structures ventrolatérales de l’hypothalamus. Nous avons aussi démontré que Sim1 est impliqué à la fois dans la différenciation, la migration et la prolifération des neurones qui peuplent le PVN tout comme Otp. Nous avons également isolé par microdissection au laser le PVN et l’hypothalamus médiobasal chez des souris de type sauvage à E14.5 pour en comparer les transcriptomes. Ceci nous a permis d’identifier 34 facteurs de transcription spécifiques au PVN et 76 facteurs spécifiques à l’hypothalamus médiobasal. Ces gènes représentent des régulateurs potentiels du développement hypothalamique. Deuxièmement, nous avons identifié 3 blocs de séquences au sein de la région 5’ d’Otp qui sont conservés chez l’homme, la souris et le poisson. Nous avons construit un transgène qui est composé d’un fragment de 7 kb contenant ces blocs de séquences et d’un gène rapporteur. L’analyse de 4 lignées de souris a montré que ce transgène est uniquement exprimé dans le PVN en développement. Nous avons généré un deuxième transgène dans lequel le fragment de 7 kb est inséré en amont de l’ADNc de Brn2 ou Sim1 et de Gfp. Nous avons obtenu quatre lignées de souris dans lesquels le profil d’expression de Brn2 et de Gfp reproduit celui d’Otp. Nous étudierons le développement du PVN et la prise alimentaire chez ces souris. En parallèle, nous croisons ces lignées avec les souris déficientes en Sim1 pour déterminer si l’expression de Brn2 permet le développement des cellules du PVN en absence de Sim1. En résumé, nous avons généré le premier transgène qui est exprimé spécifiquement dans le PVN. Ce transgène constitue un outil critique pour la dissection du programme développemental de l’hypothalamus. Troisièmement, nous avons caractérisé le développement de l’hypothalamus antérieur chez l’embryon de poulet qui représente un modèle intéressant pour réaliser des études de perte et de gain de fonction au cours du développement de cette structure. Il faut souligner que le modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur semble être conservé chez l’embryon de poulet où il est aussi possible de classer les gènes selon leur profil d’expression médio-latéral et le devenir des régions qu’ils définissent. Finalement, nous croyons que cette approche intégrative nous permettra d’identifier et de caractériser des régulateurs du développement du PVN qui pourront potentiellement être associés à des pathologies chez l’adulte telles que l’obésité ou l’hypertension. / A cascade of transcription factors composed of SIM1, ARNT2, OTP, BRN2 and SIM2 is required for the differentiation of the five major cell types populating the paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus, a critical integrator of several homeostatic processes that are required for the survival of vertebrates. Haploinsufficency of Sim1 also causes isolated hyperphagia in mice and humans. The goal of our study is to dissect the developmental program of the PVN using an integrative approach in order to identify new genes that could potentially be implicated in the regulation of homeostasis in adults. First, we used a comparative approach to analyse the PVN transcriptome at different developmental stages in mice embryos in order to identity new genes implicated in PVN development. We compared gene expression in the anterior hypothalamus of E12.5 Sim1-/- and Sim1+/+ littermate embryos using a microarray approach. We identified 56 genes acting downstream of Sim1 including 5 transcription factors - Irx3, Sax1, Rxrg, Ror and Neurod6. We proposed a model for the development of the anterior hypothalamus. In this model, the genes expressed in the medial domain of the mantle layer characterise cells that will form the PVN and genes expressed in the lateral domain identify cells that will give rise to ventrolateral areas of the hypothalamus. We also showed that Sim1, like Otp, is implicated in the differentiation, migration and proliferation of the neurons populating the PVN. Furthermore, we have isolated by laser captured microdissection the PVN and ARC nucleus in wild type mice at E14.5 and compared their transcriptomes. This technique allowed us to identity 34 transcription factors specific to the PVN and 76 factors specific to the ARC. These genes represent potential regulators of hypothalamic development. Second, we identified 3 blocks of sequence in the 5’ region of Otp that are conserved between human, mouse and fish. We constructed a transgene which included a 7 Kb fragment encompassing these sequences followed by a reporter gene. The analysis of 4 mice strains showed that this transgene is specifically expressed in the prospective PVN. We have generated a second transgene in which the 7 Kb fragment is located upstream of the cDNA encoding Brn2 or Sim1 and Gfp. We obtained 4 mice strains in which the Brn2 and Gfp expression pattern is similar to the Otp expression pattern. These mice will be used to study PVN development and food intake. Also, to determine if Brn2 expression only – without Sim1 gene expression - allows the development of PVN cells, we are presently crossing these mice with Sim1 deficient mice. In conclusion, we have generated the first transgene that is specifically expressed in the PVN. This transgene constitutes a critical tool for dissecting the developmental program of the hypothalamus. Third, we have characterised the development of the anterior hypothalamus of chick embryos which represent an interesting model for loss and gain of function experiments during the development of this brain region. Interestingly, our proposed model for the development of the anterior hypothalamus seems to be conserved in chick embryos. As a matter of fact, it is possible to classify genes according to their medio-lateral expression patterns and the outcome of the regions that they are defining. Finally, we believe that this integrative approach will allow us to identify and characterize factors implicated in PVN development. From a clinical point of view, these factors could potentially be associated with pathologies such as obesity or arterial hypertension.

Le développement axé sur le transport en commun (transit-oriented development ou TOD) est un concept urbanistique souvent proposé comme solution aux problèmes associés à l’étalement urbain. La majorité des recherches sur ce concept sont descriptives ; rares sont les études qui examinent l’impact des projets de TOD sur les comportements en transport. Certains chercheurs proposent d’étudier les raisons qui expliquent la rareté de véritables TOD en Amérique du Nord. Cette approche s’appuie sur l’hypothèse que ce manque d’exemples est le résultat d’une faible demande, ou d’une multiplicité de barrières, quelles soient financière, réglementaire, politique, organisationnelle ou structurelle. Notre étude s’inscrit dans ce courant, afin d’examiner le développement de TOD dans la région métropolitaine de Montréal. L’étude empirique se concentre sur la perspective des promoteurs immobiliers quant à l’ampleur de la demande et des barrières à l’offre de TOD. La méthodologie de notre étude consiste en des entrevues avec les promoteurs immobiliers travaillant dans la banlieue montréalaise. Les résultats montrent que la demande est en croissance pour les produits ayant certaines caractéristiques de TOD, mais que la demande pour des TOD reste faible. Deux barrières principales ressortent de cette étude, soit le manque de terrains et l’offre insuffisante de service de transport en commun. On peut identifier d’autres obstacles majeurs dont le manque d’une définition commune du TOD et une structure de l’industrie de l’industrie mal adaptée à ces formes de développement. L’étude conclue que la réalisation de TOD dans le contexte montréalais requiert que les acteurs gouvernementaux assument un rôle plus proactif et visionnaire. / Transit-oriented development or TOD is an urban planning concept that is often proposed as a solution to the problems associated with suburban sprawl. The majority of research on this concept is descriptive; some authors examined the effect of TOD pro-jects on travel behaviour. A new research approach proposes to investigate the rarity of examples of veritable TOD in North America. This approach proposes that the lack of examples is either the result of a weak demand, or of a variety of supply barriers catego-rized as financial, regulatory, political, organizational or pertaining to the physical con-text of the city. Our study applies this research approach in order to examine the development of TOD in the Montreal metropolitan region. The empirical study focuses on the perspec-tive of real estate developers regarding the degree of demand and the supply barriers to TOD. The methodology consists of interviews with a diverse group of real estate devel-opers working in the Montreal suburbs. The results demonstrate that the demand is growing for products having certain characteristics of TOD, but that this does not reveal a demand specifically for TOD. We also determine that the two principal supply barriers are the lack of land and the insufficient supply of public transit service. Other major obstacles include lack of a common definition of TOD and the structure of the land de-velopment industry which is not well adapted to this form of development. The study concludes that the realization of TOD in the Montreal context requires that provincial and municipal government actors assume a more proactive and visionary role.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal