As paredes celulares vegetais são estruturas essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas. Além das suas diversas funções biológicas, os componentes polissacarídicos constituintes das paredes celulares (celulose, hemiceluloses e pectinas) são de vital importância como fonte natural de fibras para a nutrição humana e animal e são considerados os principais recursos renováveis do planeta, utilizados como matéria-prima para diversos processos industriais, por exemplo nos processos de produção de polpa celulósica. Todos esses fatores têm despertado grande interesse no estudo da composição e biossíntese das paredes celulares. A biossíntese dos seus polímeros se inicia no citoplasma das células, onde ocorre a formação dos precursores por uma rota metabólica complexa de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. O entendimento da regulação dessa rota metabólica é fundamental para modular a dinâmica de biossíntese desses açúcares e assim tentar manipular as propriedades bioquímicas das paredes celulares. Nesse contexto, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito da superexpressão do gene miox2 de Arabidopsis thaliana em plantas de Nicotiana tabacum. O produto desse gene é a enzima mio-inositol oxigenase (E.C. 1.13.99.1), cuja função é converter o mio-inositol em ácido D-glucurônico, composto central da rota de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. Foram determinadas quatro isoformas tecido-específicas para o gene miox (miox1, miox2, miox4 e miox5) em Arabidopsis, sendo que a isoforma miox2 é a predominante em caules. Esse gene foi clonado em trabalhos anteriores realizados no laboratório e no presente trabalho, o cDNA do gene miox2 foi superexpresso em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) a fim de se avaliar o efeito da superexpressão na composição de carboidratos de parede celular secundária. As linhagens de plantas transgênicas obtidas, não mostraram diferenças visualmente perceptíveis em comparação aos controles, indicando ausência de alterações fisiológicas e morfológicas. Foram quantificados os monossacarídeos de paredes celulares secundárias (arabinose, ramnose, galactose, glicose, xilose, manose), os ácidos urônicos (ácido galacturônico e glucurônico) e as ligninas (solúvel e insolúvel), a partir de tecido xilemático e parênquima medular do caule. A ausência de modificações significativas nas proporções desses metabólitos, indica que as plantas exercem um estrito controle na regulação da biossíntese de paredes celulares secundárias de forma que a superexpressão do gene miox2 não provocou nenhuma alteração altamente significativa. Outros genes candidatos e os mecanismos envolvidos na sua regulação deverão ser testados quanto ao nível de transcrição, modificações pós-trancricionais e pós-traducionais a fim de entender a regulação do fluxo de carbono para a biossíntese de paredes celulares. / Cell-walls are essential structures for plant development and growth. Apart from its biological functions, the polyssacharides that make cell-walls (cellulose, hemicellulose and pectins) are the principal natural fibrous materials used for human and animal nutrition. They are also considered the most important renewable resource on earth and their use as industrial raw material is inevitable. An example is the use of wood in the production of pulp and paper. For all these reasons, the study of molecular composition and biosynthesis of plant cell-walls has been a matter of great interest for researchers over the past few years. Cell-wall polyssacharides biosynthesis begins at the cytoplasm, where a pool of UDP-glucose and other activated sugar nucleotide precursors are generated by multiple and complex interconvertion reactions. Understanding how cells control the metabolic pathways responsible for sugar nucleotide precursors synthesis, would be a primary requirement for manipulating them in an attempt to generate plants with improved properties for human use. In that context, tha aim of this research work was to analyze the effects of Arabidopsis thaliana miox2 gene overexpression in a plant model system (Nicotiana tabacum). The product of miox2 gene is myo-inositol oxygenase enzyme 2 (E.C.1.13.99.1) which converts D-glucuronic acid, an important sugar nucleotide precursor, from its substrate myo-inositol. Four isoforms of miox gene, with apparent tissue specific expression (miox1, miox2, miox4 and miox5) were already determined, but miox2 is the one primarily expressed in stems. Its cDNA was cloned from Arabidopsis thaliana in previous works and overexpressed in tobacco plants. Five normal transgenic lines were obtained, showing no phenotypically differences relative to the control line. This fact implied that miox2 overexpression did not alter any physiological nor morphological aspect of plant development. The cell-wall monossacharides (arabinose, rhamnose, galactose, glucose, xylose and mannose), uronic acids (galacturonic and glucuronic acid) and lignins (soluble and insoluble) from stem xylem and parenchymal tissue were quantified. The absence of major changes in any of the compounds measured for the transgenic lines indicated that they were able to adjust their level of carbohydrate composition. Plants seem to regulate the proportions of sugar nucleotide precursors through highly complex metabolic pathways that establish strong compensatory mechanisms. It will be necessary to study other candidate genes and some aspects of their regulation at transcriptional, postranscriptional and postransaltional level, as an attempt to understand the cell-wall carbohydrate flux.

As tecnologias de conversão de biomassa para produção de biocombustíveis são principalmente desenvolvidas de forma empírica, baseadas na compreensão das suas propriedades biológicas e químicas. Muitos estudos de variações de parâmetros de processo são realizados, porém todos encontram dificuldades na compreensão do que ocorre com o material lignocelulósico durante as reações. Neste contexto, os estudos topoquímicos tornam-se uma ferramenta de fundamental importância para elucidar estes mecanismos. Este trabalho tem por objetivo avaliar diferentes condições de pré-tratamento hidrotérmico seguida de deslignificação alcalina de bagaço e palha de cana de açúcar. E, a partir de uma condição otimizada, compreender, o que ocorre com a parede celular vegetal durante estes processos de modificação. O bagaço e a palha de cana apresentaram comportamentos distintos ao final do seu processamento. Observou-se uma maior mudança morfológica do bagaço comparado à palha, a qual apresentou exposição das fibras, porém ainda agregadas. Tal fato pode ser explicado pela menor remoção de lignina e hemicelulose desta biomassa quando comparada as mesmas condições de processamento do bagaço. Este fator contribuiu para uma maior digestibilidade da celulose de bagaço, devido a uma área maior de contato da enzima com o substrato e minimização da interferência de inibidores, como a lignina. As condições de pré-tratamento mais promissoras para o bagaço e a palha foram a 180oC por 20 e 30 min. respectivamente, mostrando que a palha necessita de tratamentos mais prolongados para obter uma maior digestibilidade no processo de hidrolise enzimática. A condição otimizada para o bagaço de cana foi utilizada para caracterização das mudanças que ocorrem nas células de parênquima e feixes vasculares do colmo da cana, em diferentes regiões de crescimento, após o seu processamento. Os resultados mostraram uma variação de tamanho das células em função do crescimento da planta sendo a diferença entre medula e casca mais pronunciada para a região do topo da cana, onde observou-se 60% de diferença no tamanho das células de parênquima. Além disso, observou-se que após processamento estas células e os feixes vasculares perderam sua conformação estrutural e tornaram-se mais frágeis, após secagem, evidenciando a significativa remoção dos componentes estruturais. Os dados de microscopia Raman revelaram que a lignina das células de parênquima foi totalmente removida após a deslignificação, diferentemente do que ocorreu com os feixes vasculares, os quais apresentaram lignina principalmente localizada nos cantos das células. Em relação à orientação de celulose foi possível determinar que a parte inicial do colmo da cana apresenta duas direções preferenciais de orientação, sendo uma paralela e outra perpendicular ao eixo de crescimento da planta, que podem estar associadas à fase de maturação da cana que se apresenta incompleta, uma vez que a parte intermediária e topo da cana apresentam apenas uma direção preferencial evidenciando que a contribuição da camada S1 é proeminente, sendo a camada secundária S2 ainda não depositada. Outro indicativo de maturação incompleta pode ser associado à porosidade do parênquima e feixes vasculares, os quais apresentam o topo da cana mais poroso, que indica um processo de lignificação incompleto. Os resultados revelam que o processo de pré-tratamento contribui para um aumento de até 54% na porosidade, sendo este tratamento o mais impactante nesta variável, uma vez que o processo de deslignificação não alterou significativamente a porosidade das células. / Studies of fuels from renewable sources are a topic of fundamental importance. Taking into account, the production of ethanol from biomass, such as bagasse and straw sugarcane, offers benefits to sustainable production and energy security. Biomass conversion technologies are mainly developed empirically, based on chemical and biological properties of biomass and many studies include variations of parameters of process. But there are difficulties to understand the changes of the lignocellulosic material during reactions. In this context, topochemical studies are a tool of significant importance to elucidate these characteristics. This study aims to evaluate different conditions of hydrothermal pretreatment followed by a fixed condition of alkaline delignification of straw and bagasse sugarcane. Additionally, this work deals the evaluation of plant cell wall modification during hydrothermal pretreatment an alkaline delignification in the optimized condition, considering the best cellulose digestibility at enzymatic hydrolysis process of bagasse. Results reveal a different behavior of bagasse and straw from sugarcane at the end of its processing. There was a greater morphological change of sugarcane bagasse compared to straw, which presented exposure of the fibers, but also aggregated. This fact can be explained by less removal of lignin and hemicellulose of this biomass compared to the same processing conditions of bagasse. The exposure of fibers contributed to increase the cellulose of bagasse digestibility, since there was a greater area of contact of the enzyme with the substrate and a minimization of interference from inhibitors, such as lignin. The conditions of pretreatment most promising for bagasse and straw sugarcane were 180oC for 20 and 30 min. respectively, showing that the straw requires longer treatments to reach a higher digestibility in the enzymatic hydrolysis process. The optimal condition for the sugarcane bagasse was used to characterize the changes in parenchyma cells and vascular bundles from stalk of sugarcane at different growth regions, after its processing. The results showed a variation of cell size depending on growth of the plant. The top of sugarcane stalk presented the more pronounced difference between parenchyma cells from pith and rind region. Furthermore, it was observed that after processing these cells and vascular bundles lost its structural conformation and become more fragile after drying. This result indicated the significant removal of the structural components for all growth region of sugarcane stalk analyzed. Differently from vascular bundles, which presented lignin mainly located in the cell corners, the lignin from parenchyma cells was completely removed after delignification. Regarding the orientation of cellulose, determined by SAXS and Raman microscopy, the parenchyma cells from initial part of stalk presented two preferential directions of orientation, one parallel and other perpendicular to the axis of plant growth. This feature may be associated with maturation phase of sugarcane which appears incomplete, since the middle and top part of the stalk showed only one preferred direction, indicating that the contribution of the layer S1 is prominent, and the S2 layer is not deposited. Another indication of incomplete maturation process may be associated with porosity of parenchyma and vascular bundles, which have the top of the cane more porous that indicates an incomplete lignification process. The results showed that the pretreatment can be considered the most important treatment which affects this variable, since promotes an increase of up to 54% in porosity, differently of alkaline delignification process which no presented significant changes in the porosity of the cells.

O Brasil, segundo maior produtor mundial de biocombustíveis, produz etanol a partir da extração e fermentação de sacarose de colmos de cana-de-açúcar. A utilização da energia presente nas ligações químicas entre os carboidratos da parede celular (celulose, hemiceluloses e pectina), das biomassas de folha e bagaço (hoje ambos considerados resíduos de produção), é uma possibilidade para o incremento, de cerca de 3 vezes o valor atual, na produção de etanol. O entendimento da estrutura química dos polissacarídeos da parede celular de cana-de-açúcar é imprescindível para que esta tecnologia seja desenvolvida. O presente trabalho teve como objetivo isolar as hemiceluloses de colmo de cana-de-açúcar e estudar as suas estruturas químicas. Para tal, utilizou-se AIR (Alcohol Insoluble Residue) - parede celular sem açúcar solúvel - de colmo e folha de cana-de-açúcar SP80-3280 em hidrólises enzimáticas com endo-β-xilanase, liquenase e celulase isoladamente ou em conjunto de forma a determinar a estrutura fina dos polímeros atacáveis por tais hidrolases. O AIR de colmo também foi submetido ao fracionamento da parede celular com oxalato de amônio, seguido de extrações com 1M e 4M de NaOH para a separação das hemiceluloses. Somente as frações 1M e 4M de NaOH foram analisadas, através de hidrólises com endo-β-xilanases, seguido da análise dos oligossacarídeos resultantes por HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) e por espectrometria de massas MALDI-TOF. Paralelamente, grupos de oligossacarídeos provenientes de hidrólises do colmo com endo-β-xilanase foram isolados por cromatografia em camada delgada (TLC) preparativa e, em seguida, hidrolisados com α-arabinofuranosidases e analisados por PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) para o esclarecimento da estrutura fina de arabinoxilanos. Os resultados obtidos mostraram a presença de xiloglucano na fração NaOH 4M em pequena proporção, cerca de 3% da parede celular, sendo este xiloglucano de 2 tipos: estrutura fina típica de gramíneas (composta por glucose, e os oligossacarídeos isoprimeverose, XG, XXG, XXGG, XXGGG) e estrutura fina de eudicotiledôneas e monocotiledôneas não-comelinóides (composta por oligossacarídeos: XXXG, XLXG/XXLG, XXXXG). A análise por MALDI-TOF da hidrólise das frações 1M e 4M de colmo de cana-de-açúcar com endo-β-xilanase revelou a existência de xilanos lineares (série homóloga de xilanos) em conjunto com um grupo de xilanos ramificados com arabinose de forma regular, com motivos arabinosilados com até 6 xiloses na cadeia principal. As hidrólises com endo-β-xilanase e liquenase em conjunto revelaram que o arabinoxilano e o β-glucano, juntos, perfazem cerca de 40% da parede celular de cana-de-açúcar, e não interferem na hidrólise uma da outra, permitindo o uso concomitante das enzimas em processos industriais. Além disso, especula-se que as arabinoses do arabinoxilano interagem, possivelmente, através de ligações por compostos fenólicos, prevenindo a ação enzimática. O presente trabalho começa a desvendar a estrutura fina das principais hemiceluloses da parede celular de colmo de cana-de-açúcar e aponta para a necessidade de experimentos que permitam compreensão de outros níveis de complexidade da parede celular, como por exemplo, as ramificações com agliconas e interações entre os polissacarídeos. / Brazil is the second-generation ethanol producer in the World, obtaining it from sugarcane soluble sugar from culms. The second generation ethanol consists of using the energy present in the covalent linkages of the cell wall carbohydrates (cellulose, hemicelluloses and pectin) from culms and leaves (both considered nowadays as litter). This is considered as a great opportunity to increase ethanol production up to 3 times the current figures. The knowledge about sugarcane polysaccharide structure is crucial for the development of the second-generation ethanol technology. This work, aimed at the isolation and structural studis of the hemicellulosic components of the sugarcane cell walls. To achieve this, AIR (Alcohol Insoluble Residue) from culms and leaves (SP 80-3280 variety) were digested with endo-β-xylanase, lichenase and cellulase (in different sequences, or with isolated or combined enzymes) to help determining the fine structures of the polysaccharides. The AIR from culm was fractionated with increasing alkali concentrations (NaOH 0,1M, 1M and 4M) to purify the different hemicelluloses. Only the 1M and 4M fractions were analyzed, after digestions with endo-β-xylanase, followed by HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) and MALDI-TOF Mass Spectrometry analyses. Also, the oligosaccharides obtained by the endo-β-xylanase digestion were isolated by preparative TLC (Thin Layer Chromatography), re-digested with α-arabinofuranosidases and finally analyzed by PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) in order to clarify the fine structure of the arabinoxylan from sugarcane culm. The same fractionated material was digested by an endo-β-glucanase to clarify the xyloglucan structure. The results showed that in the 4M fraction, a small concentration of xyloglucan can be found (ca. 3% of the total hemicelluloses), and this polysaccharide has the typical grass structure: XG, XXG, XXGG and XXGGG/XLGG. Other oligosaccharides, typical from eudicotyledons were also found: the XXXG, XLXG/XXLG and XXXXG. The MALDI-TOF and PACE analyses performed after digestion with endo-β-xylanase and α-arabinofuranosidases, revealed the presence of linear xylan oligosaccharides (from 2 to 14) and also fragments with arabinose substitutions. The digestions with endo-β-xylanase and lichenase at the same time, revealed that the arabinoxylan and β-glucans, are 40% of all the sugarcane cell wall mass, and one enzyme does not interfere in the activity of the other. The present work starts to clarify the fine structure of the sugarcane culm (and leaves) major hemicelluloses, and also suggest that experiments aimed at understanding cell wall complexity are important steps to help developing efficient cellulosic ethanol technologies to obtain second generation ethanol from sugarcane biomass.

Como os outros organismos, as plantas têm a habilidade de se defenderem através do reconhecimento de patógenos (resposta de hipersensibilidade - RH), causando a morte imediata das células no sítio primário da infecção, desta maneira oferecendo resistência ao seu crescimento. A RH é caracterizada pela necrose dos tecidos neste local, através de muitos sinais ainda não completamente elucidados, como a formação de radicais livres, incluindo o peróxido de hidrogênio (H2O2), e o reforço da parede celular. O objetivo deste estudo foi estabelecer a relação entre esses sinais em cultura de células de amora-preta (Rubus fruticosus). As condições experimentais para a análise da parede celular, das espécies reativas de oxigênio (EROs) e do H2O2 foram padronizadas. O polissacarídeo ácido (ramnoglucuronogalactana, F-I), o ácido salicílico (AS), e o metil jasmonato (MeJA), bem estabelecidos efetores da resposta da defesa, foram usados como elicitores. A produção das EROs e do H2O2 foram ativadas por F-I e pelo AS, seguidos da liberação de fragmentos de dissacarídeos da parede celular, aparentemente devido a sua degradação. Por outro lado, uma produção pequena de EROs e de H2O2 foram observadas na presença de MeJA, assim como um aumento de fragmentos de massa molecular mais elevada, que podem funcionar como sinais para o reforço da parede celular, indução de enzimas e para a produção de outra moléculas de defesa. Quando da elicitação, concomitante, com dois elicitores, AS + MeJA, houve a inibição da produção de EROs causada pelo MeJA e foi mantida a liberação de compostos extracelulares de massa molecular mais elevada. / Like the other organisms, plants have the ability to self-defend through recognition of pathogens (hypersensitive response - HR), causing immediate cell death at the primary infection site, thus offering resistance to their grown. The HR is characterized by necrosis of tissues in this site via many signals still not completely elucidated, like formation of free radicals including H2O2 and reinforcement of cell wall. The aim of this study was to establish the relationship between these signals in blackberry-black cell culture (Rubus fruticosus). The experimental conditions for analysis of cell wall, reactive oxygen species (ROS) and H2O2, were established. Acid polysaccharide (rhamnoglucuronogalactan, F-I), salicylic acid (SA), and methyl jasmonate (MeJA), well established effectors of the defense response, were used as elicitors. ROS and H2O2 production was activated by F-I and SA, followed by release of fragments like disaccharides from the cell wall, apparently due to its degradation. By contrast, a small production of ROS and H2O2 was observed in presence of MeJA, as well as an increase of high molecular weight fragments, that may function as signals for reinforcement of cell wall, enzyme induction and production of others defense molecules. Together, the two elicitors SA and MeJA inhibited the ROS production, caused by MeJA, while sustaining release of the extra cellular compounds of high molecular weight.

A parede celular vegetal, estrutura essencial para as plantas, é extremamente importante para a economia humana, já que apresenta diversas utilidades, como por exemplo, fabricação de papel, fibras de vestuário, construção civil, entre outras. A maior parte da parede celular vegetal primária (aproximadamente 90%), é formada por polissacarídeos como celulose, hemiceluloses e pectinas. Os monossacarídeos, unidades formadoras dos polissacarídeos, são sintetizados, nas plantas, a partir de diferentes açúcares nucleotídeos, sendo que, o suprimento desses, pode afetar a biossíntese dos polissacarídeos da parede celular. Visando analisar o impacto da alteração do fluxo metabólico do carbono na composição da parede celular, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo alterar a composição dos polissacarídeos da parede celular de Nicotiana tabcum, através da modulação da expressão do gene uxs, responsável pela codificação da enzima UDP-D-glucuronato descarboxilase (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) que converte UDP-D-glucuronato em UDP-D-xilose, importante açúcar nucleotídeo, precursor do monossacarídeo xilose. Para isso, após a clonagem do gene uxs de ervilha, foram obtidas plantas transgênicas de tabaco superexpressando esse gene. Diversas análises foram realizadas para determinação da composição química da parede celular primária e secundária dessas plantas. Pela análise de FTIR da parede celular primária, verificou-se que três linhagens transgênicas apresentaram espectrotipos consistentes, indicando uma redução na quantidade de pectinas e ligações ésteres carboxílica nessas linhagens transgênicas. Apesar de não terem sido detectadas alterações na proporção dos monossacarídeos ramnose, xilose, arabinose, manose e galactose, e na quantidade de celulose, na parede celular primária das plantas transgênicas, foram observadas diferenças na proporção de galactose não esterificada, nas linhagens que apresentaram espectrotipo. Com relação à parede celular secundária, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentaram maior concentração de lignina solúvel relacionada a uma redução no conteúdo de lignina insolúvel. / The plant cell wall is not only an essential structure for plants, but also an extremely important raw material in human economy. The plant cell wall has diverse utilities, for example, papermaking, textile fiber, civil construction. Polysaccharides, such as cellulose, hemicelluloses and pectins, are the major components of the primary plant cell wall (approximately 90%). These polysaccharides are formed by monosaccharides, which are synthesized in the plant from different nucleotide sugars. The suppliment of the nucleotide sugars can affect plant cell wall polysaccharides biosynthesis. Aiming at analyzing the impact of the alteration in the metabolic carbon flux on cell wall composition, the objective of this research project was to alterate the plant cell wall polysaccharides composition by the modulation of the uxs gene. This gene encodes the UDP-D-glucuronic acid decarboxylase enzyme (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) that promotes the conversion of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose, an important sugar nucleotide precursor of xylose monosaccharide. To achieve this goal, the pea uxs gene was cloned and transgenic tobacco plants overexpressing this gene were obtained. Several analyses were performed to determinate the primary and secondary cell wall composition of those transgenic plants. The primary cell wall analysis by FTIR identified three transgenic lines that show different spectrotypes compared to wild type and those transgenic spectrotypes had the same features. The results indicate a reduction of pectin and ester carbonyl binding in the transgenic plants. No alterations were detected in the monosaccharide (rhamnose, xylose, arabinose, manose and galactose) proportions and the amount of cellulose in the primary cell wall of the transgenic plants. Nevertheless, differences in the proportion of unesterified galactose were observed in the same transgenic lines that showed spectrotypes. With regard to secondary cell wall, some transgenic lines showed an increase in soluble lignin which is related to a reduction in insoluble lignin.

Os elementos celulares que constituem o tecido xilemático de várias espécies vegetais são amplamente utilizados em diversos setores industriais, com inúmeras aplicações, como por exemplo, a geração de energia e produção de celulose e papel. A parede celular das células vegetais é formada basicamente por celulose, hemiceluloses e lignina. A formação dos polímeros de celulose e hemicelulose dependem exclusivamente do suprimento de precursores chamados de nucleotídeos-açúcares, tais como UDP-glicose, UDP-glucuronato, UDP-xilose, UDP-arabinose, UDP-manose e UDP-galactose. A biossíntese da parede celular é altamente regulada do ponto de vista metabólico, e envolve a participação de várias enzimas que catalisam uma série de reações. Estratégias para alterar o fluxo metabólico destes precursores, podem originar modificações na deposição dos polissacarídeos na parede celular. Em particular, para o setor de celulose e papel tal estratégia pode resultar em fibras com determinadas características, melhorando a qualidade da polpa celulósica ou do papel produzido. O UDP-glucuronato é um dos principais precursores de polissacarídeos hemicelulósicos da parede celular, sendo formado a partir de UDP-glucose pela ação da enzima UDP-glicose desidrogenase (EC. 1.1.1.22). Esta enzima é chave na regulação da biossíntese das pentoses e hexoses da parede celular de plantas superiores. Com o objetivo de modular a síntese dos polissacarídeos hemicelulósicos na parede celular, o presente trabalho analisou o impacto da superexpressão do gene ugdh em plantas transgênicas de tabaco. Foram realizadas análises da composição química da parede celular primária e secundária de folhas e caules, bem como avaliações morfológicas das fibras do tecido xilemático, e também cortes histológicos da região basal do caule. Da parede secundária do tecido xilemático determinou-se o conteúdo de lignina klason e solúvel, bem como a concentração dos carboidratos via HPAE-PAD. No tecido xilemático, todas as plantas transgênicas apresentaram aumento do conteúdo de xilose, embora não significativo. Juntamente, ocorreu um aumento de arabinose significativo em três linhagens transgênicas. Paralelamente, todas as plantas transgênicas tiveram redução do conteúdo de lignina klason, embora significativo em apenas uma linhagem. A relação hexoses/pentoses reduziu em todas as linhagens transgênicas, sendo significativa em três linhagens. As análises histológicas do caule mostraram que os transformantes apresentaram um aumento do tecido xilemático em relação às plantas controles. As análises morfológicas das fibras mostraram que todas as plantas transgênicas apresentaram reduções significativas no comprimento, em relação às plantas controles. No tecido foliar, o conteúdo de polissacarídeos da parede celular primária apresentou uma redução significativa em todas as plantas transgênicas. / The cellular elements that constitute the xylematic tissue of various plant species are widely used in diverse industrial sectors, with numerous applications, for example, the generation of energy and production of cellulose and paper. Plant cell walls are basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of cellulose and hemicellulose polymers depend exclusively on the supply of the precursors called nucleotide sugars, such as UDPglucose, UDP-glucuronate, UPD-xylose, UDP-arabinose, UDP-mannose and UDP-galactose. The biosynthesis of the cell wall is highly regulated from the metabolic point of view and involves the participation of various enzymes that catalyse a series of reactions. Strategies to alter the metabolic flux of these precursors could give rise to modifications in the deposition of polysaccharides in the cell wall. In particular, for the cellulose and paper sector these strategies could result in fibers with determined characteristics, improving the quality of the cellulose pulp or the paper produced. UDP-glucuronate is one of the principal precursors of the hemicellulose polysaccharides of the cell wall, which is formed from UDP-glucose by the action of UDPglucose dehydrogenase (EC1.1.1.22). This is a key enzyme in the regulation of the biosynthesis of the pentoses and hexoses in the cell walls of higher plants. With the objective of modulating the synthesis of the hemicellulose polysaccharides in the cell wall, the present study analysed the impact of the superexpression of the ugdh gene in transgenic tobacco plants. Chemical analyses were performed to determine the chemical composition of the primary and secondary cell walls of leaves and stems, as well as morphological evaluations of the fibers of the xylematic tissue and histological cuts through the base of the stem. The Klason and soluble lignin content as well as the carbohydrate concentrations (using HPAE-PAD) were determined in the secondary cell walls of the xylematic tissue. All of the transgenic plants showed an increase in xylose content, albeit not significant. A significant increase in arabinose content was observed in three transgenic lines. In parallel all the transgenic plants presented a reduction in Klason lignin, but only significant in one line. The ratio hexose/pentose was reduced in all transgenic lines, being significant in three. Histological analyses on the stem showed that the transformants presented an increase in the xylematic tissue when compared to the controls. The morphological analyses of the fibers showed that all the transgenic plants presented significant reductions in length when compared to the controls. In the leaf tissue, the polysaccharide content of the primary cell wall showed a significant reduction in all of the transgenic plants.

As tecnologias de conversão de biomassa para produção de biocombustíveis são principalmente desenvolvidas de forma empírica, baseadas na compreensão das suas propriedades biológicas e químicas. Muitos estudos de variações de parâmetros de processo são realizados, porém todos encontram dificuldades na compreensão do que ocorre com o material lignocelulósico durante as reações. Neste contexto, os estudos topoquímicos tornam-se uma ferramenta de fundamental importância para elucidar estes mecanismos. Este trabalho tem por objetivo avaliar diferentes condições de pré-tratamento hidrotérmico seguida de deslignificação alcalina de bagaço e palha de cana de açúcar. E, a partir de uma condição otimizada, compreender, o que ocorre com a parede celular vegetal durante estes processos de modificação. O bagaço e a palha de cana apresentaram comportamentos distintos ao final do seu processamento. Observou-se uma maior mudança morfológica do bagaço comparado à palha, a qual apresentou exposição das fibras, porém ainda agregadas. Tal fato pode ser explicado pela menor remoção de lignina e hemicelulose desta biomassa quando comparada as mesmas condições de processamento do bagaço. Este fator contribuiu para uma maior digestibilidade da celulose de bagaço, devido a uma área maior de contato da enzima com o substrato e minimização da interferência de inibidores, como a lignina. As condições de pré-tratamento mais promissoras para o bagaço e a palha foram a 180oC por 20 e 30 min. respectivamente, mostrando que a palha necessita de tratamentos mais prolongados para obter uma maior digestibilidade no processo de hidrolise enzimática. A condição otimizada para o bagaço de cana foi utilizada para caracterização das mudanças que ocorrem nas células de parênquima e feixes vasculares do colmo da cana, em diferentes regiões de crescimento, após o seu processamento. Os resultados mostraram uma variação de tamanho das células em função do crescimento da planta sendo a diferença entre medula e casca mais pronunciada para a região do topo da cana, onde observou-se 60% de diferença no tamanho das células de parênquima. Além disso, observou-se que após processamento estas células e os feixes vasculares perderam sua conformação estrutural e tornaram-se mais frágeis, após secagem, evidenciando a significativa remoção dos componentes estruturais. Os dados de microscopia Raman revelaram que a lignina das células de parênquima foi totalmente removida após a deslignificação, diferentemente do que ocorreu com os feixes vasculares, os quais apresentaram lignina principalmente localizada nos cantos das células. Em relação à orientação de celulose foi possível determinar que a parte inicial do colmo da cana apresenta duas direções preferenciais de orientação, sendo uma paralela e outra perpendicular ao eixo de crescimento da planta, que podem estar associadas à fase de maturação da cana que se apresenta incompleta, uma vez que a parte intermediária e topo da cana apresentam apenas uma direção preferencial evidenciando que a contribuição da camada S1 é proeminente, sendo a camada secundária S2 ainda não depositada. Outro indicativo de maturação incompleta pode ser associado à porosidade do parênquima e feixes vasculares, os quais apresentam o topo da cana mais poroso, que indica um processo de lignificação incompleto. Os resultados revelam que o processo de pré-tratamento contribui para um aumento de até 54% na porosidade, sendo este tratamento o mais impactante nesta variável, uma vez que o processo de deslignificação não alterou significativamente a porosidade das células. / Studies of fuels from renewable sources are a topic of fundamental importance. Taking into account, the production of ethanol from biomass, such as bagasse and straw sugarcane, offers benefits to sustainable production and energy security. Biomass conversion technologies are mainly developed empirically, based on chemical and biological properties of biomass and many studies include variations of parameters of process. But there are difficulties to understand the changes of the lignocellulosic material during reactions. In this context, topochemical studies are a tool of significant importance to elucidate these characteristics. This study aims to evaluate different conditions of hydrothermal pretreatment followed by a fixed condition of alkaline delignification of straw and bagasse sugarcane. Additionally, this work deals the evaluation of plant cell wall modification during hydrothermal pretreatment an alkaline delignification in the optimized condition, considering the best cellulose digestibility at enzymatic hydrolysis process of bagasse. Results reveal a different behavior of bagasse and straw from sugarcane at the end of its processing. There was a greater morphological change of sugarcane bagasse compared to straw, which presented exposure of the fibers, but also aggregated. This fact can be explained by less removal of lignin and hemicellulose of this biomass compared to the same processing conditions of bagasse. The exposure of fibers contributed to increase the cellulose of bagasse digestibility, since there was a greater area of contact of the enzyme with the substrate and a minimization of interference from inhibitors, such as lignin. The conditions of pretreatment most promising for bagasse and straw sugarcane were 180oC for 20 and 30 min. respectively, showing that the straw requires longer treatments to reach a higher digestibility in the enzymatic hydrolysis process. The optimal condition for the sugarcane bagasse was used to characterize the changes in parenchyma cells and vascular bundles from stalk of sugarcane at different growth regions, after its processing. The results showed a variation of cell size depending on growth of the plant. The top of sugarcane stalk presented the more pronounced difference between parenchyma cells from pith and rind region. Furthermore, it was observed that after processing these cells and vascular bundles lost its structural conformation and become more fragile after drying. This result indicated the significant removal of the structural components for all growth region of sugarcane stalk analyzed. Differently from vascular bundles, which presented lignin mainly located in the cell corners, the lignin from parenchyma cells was completely removed after delignification. Regarding the orientation of cellulose, determined by SAXS and Raman microscopy, the parenchyma cells from initial part of stalk presented two preferential directions of orientation, one parallel and other perpendicular to the axis of plant growth. This feature may be associated with maturation phase of sugarcane which appears incomplete, since the middle and top part of the stalk showed only one preferred direction, indicating that the contribution of the layer S1 is prominent, and the S2 layer is not deposited. Another indication of incomplete maturation process may be associated with porosity of parenchyma and vascular bundles, which have the top of the cane more porous that indicates an incomplete lignification process. The results showed that the pretreatment can be considered the most important treatment which affects this variable, since promotes an increase of up to 54% in porosity, differently of alkaline delignification process which no presented significant changes in the porosity of the cells.

Apenas muito recentemente estratégias genômicas e pós-genômicas têm sido utilizadas em estudos de espécies arbóreas importantes na silvicultura. Nos países tropicais, a exemplo do Brasil, as espécies de eucalipto são especialmente importantes nos plantios comerciais principalmente destinados à indústria de papel e celulose. O eucalipto é caracterizado por elevadas taxas de crescimento e alta adaptabilidade resultante da interação de mecanismos moleculares e processos metabólicos ainda pouco conhecidos. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo principal o estabelecimento de perfis transcricionais comparativos para folhas e para o xilema em formação de árvores de Eucalyptus grandis. grandis. O uso do método SAGE permitiu analisar 5864 genes dos quais 2247 (38%) puderam ser identificados. Foram encontrados 464 genes diferencialmente expressos, sendo 47 exclusivamente expressos na região cambial e 64 nas folhas. Além disso, as estratégias adotadas na identificação tags-genes permitiram que as SAGE tags fossem eficientemente utilizadas na diferenciação de isoformas gênicas tecido-específicas e de localização celular específica. Genes relacionados à fotossíntese, fotorrespiração e destoxificação celular foram preferencialmente encontrados na biblioteca SAGE de folhas, enquanto genes relacionados à síntese da parede celular, organização do citoesqueleto e respiração, foram preferencialmente expressos na biblioteca SAGE de madeira. Os níveis de expressão dos transcritos sugeriram a ocorrência de possíveis mecanismos de controle transcricional comum para grupos de genes funcionalmente relacionados e foram também utilizados para sugestão de genes e processos que representam alvos potenciais para o melhoramento do eucalipto. / Recently genomic and post-genomic strategies have been used to study important tree species in planted forests. In the tropical countries, like Brazil, Eucalyptus species are especially important in commercial plantations destined for the paper and cellulose industry. Eucalyptus species are characterized by their high growth rates and great adaptability resulting from the interaction between molecular mechanisms and metabolic processes that are still uncharacterized. Thus, the main goal of this work was the comparison of the transcriptional profiles from leaves and the cambial region of Eucalyptus grandis trees. The use of SAGE allowed the evaluation of 5864 expressed tags of which 2247 (38%) could be identified. 464 differentially expressed tags were indicated, of which 47 were exclusively expressed in the cambial region library and 64 in the leaf library. Furthermore, the strategies used in the tag mapping process allowed an efficient use of the SAGE tags to distinguish gene isoforms with tissue-specific and/or specific cell localizations. Genes related to photosynthesis, photorespiration and cellular detoxification were preferentially found in the SAGE leaf library, while genes involved in cell wall biosynthesis, cytoskeletal organization and respiration were preferentially expressed in the developing xylem. Transcript expression levels suggested the presence of a common transcriptional control for a few functionally related genes, for example, some lignin related genes. Importantly, transcript expression levels were also used for the identification of target genes and processes potentially useful in future Eucalyptus breeding programs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-01Bitstream added on 2014-06-13T20:24:22Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_azl_dr_rcla.pdf: 1708787 bytes, checksum: b3a9a5f321c84fbef694ca3153961530 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente trabalho vinte de cinco linhagens de basidiomicetos, estocadas na coleção de microrganismos do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada, foram avaliadas com relação aos seus potenciais de produção de enzimas ligninolíticas. A finalidade dessas enzimas é complementar um preparado enzimático (contendo xilanases e celulases) para ser aplicado em dietas de ruminantes. A produção das enzimas nos resíduos/subprodutos farelo de trigo, farelo de algodão, polpa cítrica e bagaço de cevada foi considerável. Farelo de trigo e bagaço de cevada proporcionaram as melhores quantidades da enzima lacase. O fungo Coriolopsis byrsina produziu altos níveis de lacase extracelular, com baixa atividade de celulase. A atividade de feruloil esterase foi detectada no extrato enzimático bruto desse mesmo fungo quando cultivado em bagaço de cevada. A lacase foi estável até 60 °C por 1 hora, apresentando duas temperaturas ótimas, a 40 e 55 °C. Foi estável em ampla faixa de pH (4,0 – 8,0), apresentando pH ótimo 4,5 e mantendo 20% de sua atividade em pH 7,0. Além disso, apresentou 30% da sua atividade após 6 horas de incubação nas condições do ambiente ruminal. O tratamento das fibras vegetais com o extrato enzimático bruto de C. byrsina (alta atividade de lacase) misturado com o extrato enzimático bruto Trichoderma reesei (celulase + xilanase) melhorou o percentual de hidrólise, disponibilizando os carboidratos fermentáveis para posterior fermentação ruminal. A digestibilidade in vitro por produção de gases apresentou aumento significativo em todos os alimentos (forragens) avaliados / At the present research work twenty five basidiomycete strains kept in the colection of microrganisms in the Processing Biochemistry and Applied Microbiology laboratory at IBILCE were evaluated according to their ligninolytic enzymes production potential. The objective of these enzymes would be to complement an enzymatic mix (containing xylanases and cellulases) to be added to ruminants diets. The enzyme production in the byproducts like wheat bran, cotton bran, citrus pulp and brewer’s spent grain were considerably high. The wheat bran and the brewer’s spent grain presented the highest quantity of laccase. The fungal Coriolopsis byrsina produced high levels of extracellular laccase with low cellulose activity. The feruloyl esterase activity was detected in the crude enzyme of the same fungal when cultivated in brewer’s spent grain. Laccase was stable at 60 °C for 1 hour, presenting two optimal temperature at 40 and 55 °C. It was stable at (4.0 – 8.0) pH range, presenting optimal pH at 4.5 and keeping 20% of its activity at pH 7.0. Besides that, it presented 30% of its activity after 6 hours of incubation under ruminal conditions. The vegetable fiber treatment with C. byrsina crude enzyme (laccase high activity) mixed to Trichoderma reesei crude enzyme (cellulose + xylanase) improved the hydrolysis percentage releasing sugars for further ruminal fermentation. In vitro gas production digestibility showed significant increase in various crops

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:49:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renan Vasconcelos Santos.pdf: 2145055 bytes, checksum: 12d61fee1beb0fbd0b1b459c9f469ff6 (MD5) Previous issue date: 2013-04-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Since the dawn of civilization, man has used microbial fermentation to produce various consumer goods. The yeast Saccharomyces cerevisiae is undoubtedly the main factor in known fermentation processes, responsible for the production of bread, beer, wine, cachaça and bioethanol. S. cerevisiae was the first eukaryotic organism to have its genome sequenced and has been used for several decades as a model for eukaryotic cellular and molecular studies. The yeast cell wall is a robust structure composed of a structural internal layer of glucan and chitin, and an outer layer of mannoproteins covalently linked to the structural layer, which determine the bulk properties of the cell surface. The flocculation of yeast can be defined as a non-sexual, reversible and calcium-dependent aggregation of cells in multicellular masses, called flocs, with subsequent sedimentation from the medium in which they are suspended. It is a very complex process and depends on numerous factors such as the characteristics of the medium (pH and the presence of cations), conditions of fermentation (oxygenation, sugars, growth temperature, and the ethanol concentration) and the expression of genes of the FLO family. The process involves the interaction of specialized cell wall proteins called lectins, present only in cell flocculants, and carbohydrates (receptors) in the cell wall of neighboring cells. Flocculation properties specifically set may lead to an improvement in the processing of fermentation biotechnology products, such as food, beverages and biofuels. The group s previous data on the identity of flocculation profile between wild yeast strains isolated from different stills showed two strains with a characteristic profile of sedimentation (BT0510 BT0605), while two others (BT0505 and BT0601) showed no flocculation capacity. The objective of this study was to evaluate the relationship between the content of carbohydrates (glucose and mannose) and cell wall-related genes to the flocculation process in order to better understand the factors that cause the difference in behavior flocculant. Yeast cells were grown in YEPD medium and incubated at 28 ° C and 150 rpm agitation. The cell wall was extracted by a combination of sonication, vigorous agitation with glass beads and boiling in detergent solution. After extensive washing with ultrapure water, the pellet containing the cell wall was incubated at 80 ° C to complete drying and determination of dry weight. Then the samples were subjected to hydrolysis with sulfuric acid, precipitation of sulphate ions by adding Ba (OH) 2, and concentration in vacuum. The liberated monosaccharides were analyzed by HPLC on a column of REZEX-RHM, isocratic elution with ultrapure water, differential refraction detector at 60 ° C. The expression levels of FLO genes and genes related to cell wall between a flocculent strain and a non-flocculent were compared using Real Time PCR. No significant difference was found between the levels of glucose and mannose in flocculent and non-flocculent strains, which suggests that the profile of flocculation is not directly related to the concentration of cell wall carbohydrates. Analysis of relative gene expression showed a significant increase in the FLO gene family (FLO1, FLO8 and FLO10) in flocculant strain, confirming expectations. A large increase of 27 times was noted in CWP1 gene, confirming studies suggesting a major importance of this gene for the cell wall and in the flocculation process. There was also an increase in other genes related to the cell wall. Studies of cell wall proteomics, and mass spectrometry analysis may help elucidate the results, and contribute to a better understanding of flocculation in fermentation processes / Desde os primórdios da civilização, o homem utiliza as fermentações microbianas para a produção de diversos bens de consumo. A levedura Saccharomyces cerevisiae é, sem dúvida, o maior expoente dos processos fermentativos conhecidos, responsável pela fabricação do pão, da cerveja, do vinho cachaça e do bioetanol. S. cerevisiae foi o primeiro organismo eucarionte a ter seu genoma sequenciado e vem sendo utilizada há várias décadas como um modelo eucarionte para estudos celulares e moleculares. A parede celular de levedura é uma robusta estrutura composta por uma camada estrutural interna de glucanos e quitina, e uma camada externa de manoproteínas covalentemente ligadas à camada estrutural, que determinam a maior parte das propriedades de superfície da célula. A floculação de levedura pode ser definida como um processo não sexual, reversível e cálcio-dependente de agregação de células em massas multicelulares, chamadas flocos, com a subsequente sedimentação a partir do meio em que elas estão suspensas. É um processo muito complexo e depende de numerosos fatores, tais como as características do meio (pH e a presença de cátions), as condições de fermentação (oxigenação, os açúcares, a temperatura de crescimento, a concentração de etanol) e a expressão dos genes da família FLO. O processo envolve a interação de proteínas especializadas da parede celular denominadas lectinas, presentes apenas em células floculantes, e carboidratos (receptores) na parede celular das células vizinhas. Propriedades de floculação especificamente ajustadas poderia levar a uma melhoria no processamento de produtos biotecnológicos de fermentação, tais como alimentos, bebidas e biocombustíveis. Dados anteriores do grupo sobre a identificação do perfil de floculação entre cepas selvagens de levedura isoladas de diferentes alambiques mostraram duas cepas com um perfil característico de sedimentação (BT0510 e BT0605), enquanto outras duas (BT0505 e BT0601) sem capacidade de floculação. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre o conteúdo de carboidratos (glicose e manose) da parede celular e de genes relacionados à parede com o processo da floculação, a fim de melhor entender os fatores que causam a diferença no comportamento floculante. As células de levedura foram cultivadas em meio YEPD, incubadas a 28 ºC e 150 rpm de agitação. A parede celular foi extraída por combinação de sonicação, agitação vigorosa com pérolas de vidro e de ebulição em solução detergente. Após lavagem extensiva com água ultra pura, o pellet contendo a parede celular foi incubado a 80 ºC para secagem completa e determinação do peso seco. Em seguida, as amostras foram submetidas a uma hidrólise com ácido sulfúrico, precipitação de íons sulfato por adição de Ba(OH)2, e concentração a vácuo. Os monossacarídeos liberados foram analisados por HPLC na coluna REZEX-RHM, eluição isocrática com água ultra pura, detector de refração diferencial a 60 ºC. Por PCR em Tempo Real foram comparados os níveis de expressão dos genes FLO e de genes relacionados à parede celular entre uma cepa floculante e outra não-floculante. Não foi encontrada diferença significativa entre o teor de glicose e manose nas cepas floculantes e não floculantes, o que sugere que o perfil de floculação não está diretamente relacionado com a concentração de carboidratos de parede celular. A análise da expressão gênica relativa mostrou um aumento significativo dos genes da família FLO (FLO1, FLO8 e FLO10) na cepa floculante, confirmando as expectativas. Um grande aumento, de 27 vezes, foi observado no gene CWP1, corroborando com estudos que sugerem uma grande importância deste gene para a integridade da parede celular e para o processo de floculação. Também houve aumento de outros genes relacionados à parede celular. Estudos de proteômica da parede celular, além de análise em espectrometria de massas poderiam ajudar a elucidar os resultados encontrados, e contribuir para o melhor entendimento da floculação nos processos fermentativos