Thesis (Ph.D. in Neuroscience) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 108-118). Free to UCD Anschutz Medical Campus. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Thesis (Ph. D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2004. / Vita. Bibliography: 148-158.

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abstract: Mechanical properties of cells are important in maintaining physiological functions of biological systems. Quantitative measurement and analysis of mechanical properties can help understand cellular mechanics and its functional relevance and discover physical biomarkers for diseases monitoring and therapeutics. This dissertation presents a work to develop optical methods for studying cell mechanics which encompasses four applications. Surface plasmon resonance microscopy based optical method has been applied to image intracellular motions and cell mechanical motion. This label-free technique enables ultrafast imaging with extremely high sensitivity in detecting cell deformation. The technique was first applied to study intracellular transportation. Organelle transportation process and displacement steps of motor protein can be tracked using this method. The second application is to study heterogeneous subcellular membrane displacement induced by membrane potential (de)polarization. The application can map the amplitude and direction of cell deformation. The electromechanical coupling of mammalian cells was also observed. The third application is for imaging electrical activity in single cells with sub-millisecond resolution. This technique can fast record actions potentials and also resolve the fast initiation and propagation of electromechanical signals within single neurons. Bright-field optical imaging approach has been applied to the mechanical wave visualization that associated with action potential in the fourth application. Neuron-to-neuron viability of membrane displacement was revealed and heterogeneous subcellular response was observed. All these works shed light on the possibility of using optical approaches to study millisecond-scale and sub-nanometer-scale mechanical motions. These studies revealed ultrafast and ultra-small mechanical motions at the cellular level, including motor protein-driven motions and electromechanical coupled motions. The observations will help understand cell mechanics and its biological functions. These optical approaches will also become powerful tools for elucidating the interplay between biological and physical functions. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Electrical Engineering 2016

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors are glutamatergic ionotropic receptors involved in excitatory synaptic transmission, synaptic plasticity and excitotoxicity. They are heteromeric complexes of GluN1 combined with GluN2A-D and/or GluN3A-B subunits that are activated by glutamate and glycine. Many allosteric modulators can influence the activity of these receptors including neurosteroids. Pregnanolone sulfáte (3α5βS) is an endogenous neurosteroid that inhibits NMDA receptors in a use-dependent manner and has neuroprotective effect. Binding site for 3α5βS on the NMDA receptor molecule is still not indentified. The aim of my work was to contribute to the identification of the biding site by kinetic analysis of rate of response return from 3α5βS inhibition. Using the point mutation we also attempted to identify the amino acids residues that could be involved in the neurosteroid binding. In order to study the effect of 3α5βS on NMDA receptors the electropfysiological recordings on human embryonic kidney 293T cells expressing recombinant GluN1/GluN2B receptors was performed. We confirm that the effect of 3α5βS on GluN1/GluN2B receptors is voltage-independent. The results of my work indicate that steroids can reach the binding site on the NMDA receptors through the membrane rather than directly from the aqueous...

Untersucht wurde die mögliche Rolle von Adenosin-5´-Triphosphat (ATP) als extrazelluläres Signalmolekül im Neostriatum der Ratte. Zum Einsatz kam die patch-clamp Methode, adaptiert für Ableitungen aus akuten Hirnschnitten. Bereits bekannt war, dass ATP exzitatorische postsynaptische Ströme an GABAergen, striatalen Projektionsneuronen („medium spiny“ Neurone) hemmen konnte. Nun sollten die verantwortlichen Mechanismen hinter diesem Effekt aufgeklärt werden. Es zeigte sich, dass exogen zugeführtes ATP zunächst zu Adenosin metabolisiert werden musste, um seine Wirkung ausüben zu können. Ein Teil dieses Effektes war, vermittelt über präsynaptische Adenosin A1-Rezeptoren, einer Hemmung der striatalen Glutamat-Freisetzung geschuldet. Neu war, dass auch die „medium spiny“ Neurone selbst funktionelle A1-Rezeptoren exprimierten. Aktiviert durch lokal gebildetes Adenosin vermittelten diese eine Hemmung der Leitfähigkeit von Glutamat-Rezeptoren des N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Subtyps. Unter physiologischen Bedingungen mag dieser Mechanismus der Begrenzung der Informationsweiterleitung über die GABAergen Projektionsneurone dienen. Striataler Glutamat-Exzess mit Überaktivierung von NMDA-Rezeptoren ist ein Charakteristikum der Huntington´schen Erkrankung. Eine Adressierung der A1 Rezeptoren als therapeutische Option im Rahmen dieser Basalganglienerkrankung scheint daher prinzipiell möglich.

1. The effects of external H-7, a potent protein kinase inhibitor, on the responses mediated by γ-aminobutyric acid A type (GAGA(A))-, nicotinic acetylcholine (nicotinic ACh)-, ionotropic 5-hydroxytryptamine (5-HT3)-, adenosine 5'-triphosphate (ATP)-, N-methyl-D-aspartate (NMDA)- and kainate (KA)-receptors were studied in freshly dissociated rat dorsal root ganglion neurone by use of whole cell patch-clamp technique. 2. External H-7 (1-1000 μM) produced a reversible, dose-dependent inhibition of whole cell currents activated by GABA, ACh and 5-HT. 3. Whole-cell currents evoked by ATP, 2-methylthio-ATP, NMDA and KA were sensitive to external H-7. 4. External H-7 shifted the dose-response curve of GABA-activated currents downward without changing the EC50 significantly (from 15.0 ± 4.0 μM to 18.0 ± 5.0 μM). The maximum response to GABA was depressed by 34.0 ± 5.3%. This inhibitory action of H-7 was voltage-independent. 5. Intracellular application of H-7 (20 μM), cyclic AMP (1 mM) and BAPTA (10 mM) could not reverse the H-7 inhibition of GABA-activated currents. 6. The results suggest that external H-7 selectively and allosterically modulates the functions of GABA(A)-, nicotine ACh- and 5-HT3 receptors via a common conserved site in the external domain of these receptors.

Plusieurs bactéries possèdent des flagelles qui leur permettent de se déplacer dans leur milieu. Ce sont des moteurs rotatifs, imbriqués dans la membrane, qui font tourner des filaments hélicoïdaux à plus de 100 Hz et qui propulsent les bactéries dans leur environnement. La source d'énergie des moteurs flagellaire est le gradient électrochimique de protons de part et d'autre de la membrane dont l'énergie potentielle est convertie en mouvement de rotation. Plusieurs facteurs influencent la rotation des filaments, notamment la concentration de certaines protéines dans le cytoplasme des bactéries. Afin d'étudier plus facilement les caractéristiques du moteur flagellaire, un système in vitro a été développé pour contrôler les conditions de rotation des moteurs flagellaires d'Escherichia coli. Pour ce faire, les bactéries ont été coincées individuellement à l'extrémité d'une micropipette de verre. Une partie de la membrane de la bactérie située à l'intérieur de la micropipette a été perforée en utilisant l'ablation laser femtoseconde. La perméabilisation de la membrane de la bactérie a permis le contrôle externe de la source d'énergie du moteur et le remplacement du contenu cytoplasmique par le liquide à l'intérieur de la micropipette. Avec le contrôle des conditions de rotation du moteur, il a été possible d'observer la relation linéaire entre la vitesse de rotation des moteurs et la différence de potentiel électrique appliquée. La rotation des filaments des bactéries a également été soutenue pendant plus de 30 minutes grâce à un gradient de pH. La diffusion de protéines fluorescentes à l'intérieur des bactéries a permis de confirmer que notre technique pourrait être utiliser pour étudier l'effet de certaines protéines, notamment CheY-P, sur la rotation des moteurs. Enfin, notre technique a également permis des observations préliminaires de la dynamique d'entrée et de sortie des unités génératrices du couple dans les moteurs. Ce nouvel outil pour l'étude du moteur flagellaire devrait permettre d'approfondir notre compréhension du mécanisme de la génération du couple dans le moteur en fournissant des données permettant de mettre des contraintes aux modèles théoriques.

Preterminfants frequently suffer frompulmonary complications due to a physiological and structural lung immaturity resulting in significant morbidity and mortality. Novel in vitro and in vivo models are required to study the underlying mechanisms of late lung maturation and to facilitate the development of new therapeutic strategies. Organoids recapitulate essential aspects of structural organization and possibly organ function, and can be used to model developmental and disease processes. We aimed at generating fetal lung organoids (LOs) and to functionally characterize this in vitro model in comparison to primary lung epithelial cells and lung explants ex vivo. LOs were generated with alveolar and endothelial cells from fetal rat lung tissue, using a Matrigel-gradient and air-liquid-interface culture conditions. Immunocytochemical analysis showed that the LOs consisted of polarized epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)-positive cells with the apical membrane compartment facing the organoid lumen. Expression of the alveolar type 2 cell marker, RT2-70, and the Club cell marker, CC-10, were observed. Na+ transporter and surfactant protein mRNA expression were detected in the LOs. First time patch clamp analyses demonstrated the presence of several ion channels with specific electrophysiological properties, comparable to vital lung slices. Furthermore, the responsiveness of LOs to glucocorticoids was demonstrated. Finally, maturation of LOs induced by mesenchymal stem cells confirmed the convenience of the model to test and establish novel therapeutic strategies. The results showed that fetal LOs replicate key biological lung functions essential for lung maturation and therefore constitute a suitable in vitro model system to study lung development and related diseases.

Les neurones sont des cellules excitables capables de coder et transmettre l’information sous forme d’oscillations du potentiel membranaire. Cette activité électrique est produite par une modification des flux ioniques transmembranaires. Les neurones constituent un exemple d’oscillateur cellulaire dont la dynamique non linéaire permet l’apparition d’une activité électrique complexe. Dans ce système, les ions calciques sont des messagers intracellulaires importants. Ils servent de médiateur entre un signal électrique et un signal chimique, par une modulation de l’activité enzymatique de certaines protéines. Ils interviennent dans de nombreuses fonctions neuronales, dont l’excitabilité électrique. Un des mécanismes mis en place par les neurones pour contrôler l’homéostasie du calcium intracellulaire provient de protéines cytoplasmiques capables de lier les ions calciques. Ces protéines jouent un rôle de « tampon » du calcium. Cependant, toutes leurs fonctions n’ont pas encore été mises en évidence. C’est l’objectif de notre travail. Nous avons voulu comprendre le rôle joué par une protéine « tampon » particulière, la calrétinine, sur le mode de décharge électrique d’un neurone où elle est exprimée en abondance, le grain cérébelleux. Pour cela, nous avons utilisé une approche théorique et expérimentale. Au niveau théorique, nous avons élaboré un modèle mathématique de l’activité électrique du grain cérébelleux, prenant en compte la chélation du calcium intracellulaire. Il permet de clarifier le rôle de la chélation du calcium intracellulaire sur les oscillations du potentiel membranaire. La modélisation de l’activité électrique du grain cérébelleux repose sur le formalisme développé par Hodgkin et Huxley pour l’axone géant de calmar. Dans ce contexte, l’application de la conservation de la charge au circuit équivalent de la membrane cellulaire fournit un système d’équations différentielles ordinaires, non linéaires. Dès lors, notre modèle nous a permis d’étudier l’impact des variations de la concentration de chélateur calcique sur les oscillations du potentiel membranaire. Nous avons ainsi pu constater qu’une diminution de la concentration en chélateur calcique induisait une augmentation de l’excitabilité électrique du grain cérébelleux, sans altérer le régime d’oscillations. Par contre, en augmentant fortement la concentration en chélateur calcique, nous avons montré que le grain cérébelleux changeait de dynamique oscillatoire, montrant des transitions d’un mode de décharge périodique régulier vers des oscillations en salve du potentiel membranaire. Au niveau expérimental, nous avons vérifié les résultats prévus par le modèle théorique. Nous avons ainsi montré que des grains de souris transgéniques déficientes en calrétinine présentaient une excitabilité électrique accrue par rapport aux grains contrôles. Puis, en restaurant un niveau de chélation calcique normal dans ces grains, par perfusion intracellulaire de chélateur calcique, nous montrons qu’ils retrouvent un niveau d’excitabilité normal. Ensuite, nous avons introduit dans des grains cérébelleux de souris sauvages, une forte concentration en chélateur calcique exogène. Conformément aux résultats théoriques, nous avons pu observer des transitions vers des oscillations en salve du potentiel membranaire. Enfin, nous avons montré que l’absence de calrétinine affecte les paramètres morphologiques du grain cérébelleux des souris transgéniques déficientes en calrétinine. En conclusion, ces résultats suggèrent que le mode de décharge des cellules excitables peut être modulé d’une façon importante par les protéines liant le calcium. De ce fait, des changements dans le niveau d’expression et/ou dans la localisation subcellulaire des protéines liant le calcium pourraient aussi jouer un rôle critique dans la régulation de processus physiologiques contrôlés par l’excitabilité membranaire. De plus, les mécanismes que nous avons mis en évidence pourraient être à l’origine d’un nouveau principe de régulation de la signalisation dans les circuits neuronaux et pourraient jouer un rôle fonctionnel dans le contrôle du codage de l’information et de son stockage dans le système nerveux central.