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Lipopolysaccharide Prolongs Action Potential Duration in HL-1 Mouse CardiomyocytesWondergem, Robert, Graves, Bridget M., Li, Chuanfu, Williams, David L. 15 October 2012 (has links)
Sepsis has deleterious effects on cardiac function including reduced contractility. We have shown previously that lipopolysaccharides (LPS) directly affect HL-1 cardiac myocytes by inhibiting Ca2+ regulation and by impairing pacemaker "funny" current, If. We now explore further cellular mechanisms whereby LPS inhibits excitability in HL-1 cells. LPS (1 jxg/ml) derived from Salmonella enteritidis decreased rate of firing of spontaneous action potentials in HL-1 cells, and it increased their pacemaker potential durations and decreased their rates of depolarization, all measured by whole cell current clamp. LPS also increased action potential durations and decreased their amplitude in cells paced at 1 Hz with 0.1 nA, and 20 min were necessary for maximal effect. LPS decreased the amplitude of a rapidly inactivating inward current attributed to Na+ and of an outward current attributed to K+; both were measured by whole cell voltage clamp. The K+ currents displayed a resurgent outward tail current, which is characteristic of the rapid delayed-rectifier K+ current, Ikr. LPS accordingly reduced outward currents measured with pipette Cs+ substituted for K+ to isolate Ikr. E-4031 (1 (xM) markedly inhibited Ikr in HL-1 cells and also increased action potential duration; however, the direct effects of E-4031 occurred minutes faster than the slow effects of LPS. We conclude that LPS increases action potential duration in HL-1 mouse cardiomyocytes by inhibition of Ikr and decreases their rate of firing by inhibition of Ina. This protracted time course points toward an intermediary metabolic event, which either decreases available mouse ether-a-go-go (mERG) and Na+ channels or potentiates their inactivation.
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Lipopolysaccharides Directly Decrease Ca<sup>2+</sup> Oscillations and the Hyperpolarization-Activated Nonselective Cation Current I<sub>F</sub> in Immortalized HL-1 CardiomyocytesWondergem, Robert, Graves, Bridget M., Ozment-Skelton, Tammy R., Li, Chuanfu, Williams, David L. 01 September 2010 (has links)
Lipopolysaccharide (LPS) has been implicated in sepsis-mediated heart failure and chronic cardiac myopathies. We determined that LPS directly and reversibly affects cardiac myocyte function by altering regulation of intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) in immortalized cardiomyocytes, HL-1 cells. [Ca2+]i oscillated (<0.4 Hz), displaying slow and transient components. LPS (1 μg/ml), derived either from Escherichia coli or from Salmonella enteritidis, reversibly abolished Ca2+ oscillations and decreased basal [Ca 2+]i by 30-40 nM. HL-1 cells expressed Toll-like receptors, i.e., TLR-2 and TLR-4. Thus, we differentiated effects of LPS on [Ca2+]i and Ca2+ oscillations by addition of utlrapure LPS, a TLR-4 ligand. Ultrapure LPS had no effect on basal [Ca 2+]i, but it reduced the rate of Ca2+ oscillations. Interestingly, Pam3CSK4, a TLR-2 ligand, affected neither Ca 2+ parameter, and the effect of ultrapure LPS and Pam3CSK4 combined was similar to that of utlrapure LPS alone. Thus, unpurified LPS directly inhibits HL-1 calcium metabolism via TLR-4 and non-TLR-4-dependent mechanisms. Since others have shown that endotoxin impairs the hyperpolarization-activated, nonselective cationic pacemaker current (If), which is expressed in HL-1 cells, we utilized whole cell voltage-clamp techniques to demonstrate that LPS (1 μg/ml) reduced If in HL-1 cells. This inhibition was marginal at physiologic membrane potentials and significant at very negative potentials (P < 0.05 at -140, -150, and -160 mV). So, we also evaluated effects of LPS on tail currents of fully activated If. LPS reduced the slope conductance of the tail currents from 498 ± 140 pS/pF to 223 ± 65 pS/pF (P < 0.05) without affecting reversal potential of -11 mV. Ultrapure LPS had similar effect on If, whereas Pam3CSK4 had no effect on If. We conclude that LPS inhibits activation of I f, enhances its deactivation, and impairs regulation of [Ca 2+]i in HL-1 cardiomyocytes via TLR-4 and other mechanisms.
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Optical recording of action potentials in human induced pluripotent stem cell-derived cardiac single cells and monolayers generated from long QT syndrome type 1 patients / 1型QT延長症候群患者より作成したヒトiPS細胞由来心臓単細胞及び単層における光学的な活動電位記録Takaki, Tadashi 25 March 2019 (has links)
京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13232号 / 論医博第2172号 / 新制||医||1036(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 山下 潤, 教授 江藤 浩之, 教授 木村 剛 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM
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Mnemonic Representations of Transient Stimuli and Temporal Sequences in the Rodent Dentate Gyrus In VitroHyde, Robert A. 08 March 2013 (has links)
No description available.
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Expression and Function of Alpha3 and Beta2 Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunits in HEK-293 CellsSteinhafel, Nathan W. 08 December 2006 (has links) (PDF)
Single-cell real-time quantitative RT-PCR was used to characterize the mRNA expression of rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) subunits α3 and β2 in CA1 hippocampus stratum radiatum and stratum oriens interneurons. α3β2 co-expression was detected in 43% of interneurons analyzed. The nAChR subtype α3β2 was transiently expressed in cells derived from the human embryonic kidney cell line 293 at mRNA levels found in the CA1. The functional properties of α3β2 in HEK-293 cells were characterized by whole-cell patch clamping using acetylcholine (ACh) as an agonist. The kinetics of α3β2 channels were further analyzed by altering the level of α3 DNA transfected into HEK-293 cells. Varying the α3 concentration by more than 100,000 fold did not significantly alter the majority of the kinetics; the 10%-90% rise-time was the main characteristic found to be significantly different. A decrease in α3 concentration illustrated a significant increase in rise time. This and future studies will further our understanding of the extensive role neuronal nAChRs play in modulating hippocampal activity and consequently influencing cognition and memory.
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Modulación de las funciones ionotrópica y metabotrópica del receptor nicotínico de acetilcolina α7 humanoChrestia, Juan Facundo 10 July 2023 (has links)
La supervivencia de los organismos superiores depende de que sus células se
organicen y actúen de manera sincronizada para cumplir funciones específicas, para lo
cual es fundamental la comunicación intercelular. Este proceso es básico para la vida de
todas las células, pero es la razón de ser en las neuronas que están especializadas en
recibir información, procesarla y comunicarla a otras células. En el sistema nervioso, la
principal forma de comunicación se realiza a través de la sinapsis química, en la que una
neurona libera un mensajero químico, el neurotransmisor, que es reconocido por un
receptor presente en otra célula permitiéndole responder al mensaje.
La acetilcolina es uno de los principales neurotransmisores utilizados por las
neuronas, y sus receptores, tanto metabotrópicos como ionotrópicos, están expresados
en muchos tipos celulares. Los receptores ionotrópicos de acetilcolina, llamados
receptores nicotínicos, son canales catiónicos pentaméricos que pertenecen a la familia
de receptores Cys-loop.
El receptor nicotínico de acetilcolina α7 es un homopentámero que exhibe
propiedades funcionales particulares fundamentales para su rol neuromodulador,
incluyendo la elevada permeabilidad al Ca2+ y la capacidad para transformar respuestas
ionotrópicas transitorias en eventos más sostenidos de señalización metabotrópica. Es
uno de los receptores nicotínicos más abundantes en el sistema nervioso, aunque también
se encuentra presente en otros tejidos. En el sistema nervioso central cumple un rol
importante en procesos de cognición, atención y memoria, al regular la liberación de
neurotransmisores, mediar la transmisión sináptica rápida y modular la excitabilidad
neuronal. Una disminución de su actividad se ha asociado con diversos desórdenes
neurológicos y neurodegenerativos, incluyendo esquizofrenia, autismo y enfermedad de
Alzheimer. El receptor α7 también se expresa en células no neuronales, tales como -entre
otras-, los astrocitos, la microglía, los linfocitos B y T, las células epiteliales, los
macrófagos, cumpliendo un rol importante en inmunidad, inflamación y neuroprotección.
Las acciones neuromoduladoras, neuroprotectoras y antinflamatorias sistémicas
del receptor nicotínico de acetilcolina α7 junto a sus propiedades únicas de activación,
desensibilización, permeabilidad al Ca2+ y rol dual ionotrópico-metabotrópico, lo han
convertido en un blanco farmacológico emergente muy importante en diversos
desórdenes neurológicos, neurodegenerativos e inflamatorios.
Este trabajo de tesis se basó en el estudio de los aspectos moleculares relacionados
a diferentes tipos de modulación de las funciones ionotrópicas y metabotrópicas del
receptor nicotínico de acetilcolina α7 humano. Para ello se utilizaron principalmente
técnicas electrofisiológicas a nivel de canal único y de corrientes macroscópicas, en
conjunto con análisis de proteínas por western blot y ensayos de movimiento de Ca2+
intracelular.
El capítulo I se centró en el estudio de la modulación de las funciones ionotrópicas y
metabotrópicas del receptor α7 por eventos de fosforilación/desfosforilación. Se
demostró que favorecer el estado desfosforilado de las tirosinas del dominio intracelular
de α7 potencia la actividad ionotrópica del receptor. A nivel de corrientes unitarias, el
efecto potenciador involucró un aumento en la frecuencia y duración de los episodios de
activación, mientras que a nivel de corrientes macroscópicas se manifestó por una
disminución en la velocidad de decaimiento de la corriente, y un aumento en la tasa de
recuperación desde el estado desensibilizado. Por el contrario, la desfosforilación de las
tirosinas tuvo un efecto negativo en la actividad metabotrópica del receptor, estudiada
por western blot a partir de la vía de ERK 1/2. Además, a diferencia de lo observado para
las tirosinas, las alteraciones en el estado de fosforilación de serinas y treoninas del
dominio intracelular no ocasionaron cambios importantes en la actividad ionotrópica de
α7 en las condiciones experimentales aquí utilizadas. En síntesis, los resultados
presentados en este capítulo ponen en evidencia que la fosforilación de las tirosinas, si
bien es absolutamente necesaria para la actividad metabotrópica de α7 mediada por la
vía ERK 1/2, actúa como un modulador negativo de la actividad ionotrópica del receptor.
El capítulo II abordó el estudio de la asociación funcional entre un fragmento
peptídico de la glicoproteína S del SARS-CoV-2 (Y674-R685) y el receptor nicotínico de
acetilcolina α7 humano. La asociación entre SARS-CoV-2 y los receptores nicotínicos fue
propuesta en forma de hipótesis al comienzo de la pandemia. Más adelante, simulaciones
de dinámica molecular mostraron que el fragmento Y674-R685 no solo tiene afinidad por
α7, sino que penetra profundamente en el bolsillo de unión a agonista del receptor. En
este capítulo, en primer lugar, se demostró que el fragmento Y674-R685 actúa como un
agonista silente de α7, ya que es capaz de provocar corrientes unitarias y macroscópicas
del receptor, pero solo en presencia de un modulador alostérico positivo. Por otro lado,
se demostró que Y674-R685 también ejerce una modulación negativa de α7, que se
evidenció por una profunda disminución, dependiente de la concentración, en la duración
de los episodios de activación de los canales potenciados y en la amplitud de las
respuestas macroscópicas provocadas por la acetilcolina. De esta manera, utilizando
distintos enfoques electrofisiológicos, se develó la existencia de una interacción funcional
entre el fragmento Y674-R685 de la glicoproteína S del SARS-CoV-2 y el receptor α7 que
proporciona las bases moleculares para seguir explorando la participación de los
receptores nicotínicos en la fisiopatología de la COVID-19.
El capítulo III se basó en el estudio del receptor α7 como blanco del cannabidiol, lo
cual resulta de gran interés debido al uso expandido de este fitocannabinoide para tratar
diferentes condiciones patológicas gracias a sus propiedades terapéuticas y a la ausencia
de efectos psicoactivos. Para ello se exploró el efecto del cannabidiol en las funciones
ionotrópicas y metabotrópicas de α7 mediante técnicas electrofisiológicas y ensayos de
movimiento de Ca2+ intracelular. En lo que respecta a las funciones ionotrópicas, se
demostró que el cannabidiol produce una rápida disminución de la actividad del canal a
nivel de corrientes unitarias evidenciada por la reducción en la frecuencia de los episodios
de activación. Este efecto fue dependiente de la concentración y se dio con una CI50 en el
rango submicromolar, lo que indica una potente modulación negativa. Por otra parte, el
cannabidiol también produjo una modulación negativa en la función metabotrópica de α7
que se evidenció por una marcada disminución en las respuestas de Ca2+ intracelular tras
la activación del receptor. Estos resultados demuestran que el cannabidiol ejerce una
modulación negativa de α7 de relevancia farmacológica que debe tenerse en cuenta a la
hora de evaluar los posibles usos terapéuticos del fitocannabinoide.
En conjunto, los resultados presentados en esta tesis amplían el entendimiento de
los aspectos moleculares relacionados con la modulación de las funciones ionotrópicas y
metabotrópicas del receptor nicotínico de acetilcolina α7 en distintas condiciones, a
saber, fisiológicas (eventos de fosforilación/desfosforilación), patológicas (fragmento
peptídico derivado de la glicoproteína S del SARS-CoV-2) y terapéuticas (cannabidiol). / The survival of higher organisms depends on the ability of their cells to be well
organized and to behave in a synchronized manner to fulfill specific functions for which
intercellular communication is of pivotal importance. This process is basic for the life of
all cells, but it is the raison d'être in neurons that are specialized in receiving information,
processing it, and communicating it to other cells. In the nervous system, the main form
of communication is carried out via the chemical synapse, in which a neuron releases a
chemical messenger, the neurotransmitter, which is identified by a receptor present in
another cell, allowing it to respond to the message.
Acetylcholine is one of the main neurotransmitters used by neurons, and its
receptors, both metabotropic and ionotropic, are expressed in many cell types. Ionotropic
acetylcholine receptors, called nicotinic receptors, are pentameric cation channels
belonging to the Cys-loop receptor family.
The α7 nicotinic acetylcholine receptor is a homopentamer with particular
functional properties critical to its neuromodulatory role, including high Ca2+
permeability and the ability to transform transient ionotropic responses into more
sustained metabotropic signaling events. It is one of the most abundant nicotinic
receptors in the nervous system, although it is also present in other tissues. In the central
nervous system, it plays an important role in cognition, attention, and memory, by
regulating the release of neurotransmitters, mediating rapid synaptic transmission, and
modulating neuronal excitability. A decrease in α7 activity has been associated with
various neurological and neurodegenerative disorders, such as schizophrenia, autism,
and Alzheimer's disease. The α7 receptor is also expressed in non-neuronal cells; namely,
astrocytes, microglia, B and T lymphocytes, epithelial cells, and macrophages, and plays
an important role in immunity, inflammation, and neuroprotection.
The neuromodulatory, neuroprotective, and systemic anti-inflammatory actions of
α7, together with its unique activating, desensitizing, Ca2+ permeability, and dual
ionotropic-metabotropic properties, have made the receptor a very important emerging
drug target in various neurological, neurodegenerative, and inflammatory disorders.
This P.D. thesis work was based on the study of molecular aspects related to
different types of modulation of the ionotropic and metabotropic functions of the human
α7 nicotinic acetylcholine receptor. To this end, electrophysiological techniques at the
single channel and macroscopic current levels were mainly used, as well as protein
analysis by western blot and intracellular Ca2+ movement assays.
Chapter I focused on the study of α7 receptor ionotropic and metabotropic function
modulation by phosphorylation/dephosphorylation events. It was shown that favoring
the dephosphorylated state of α7 intracellular domain tyrosine residues potentiates its
ionotropic activity. At the single-channel level, this potentiating effect involved an
increase in the frequency and duration of activation episodes, while at the macroscopic
level it was manifested by a decrease in the rate of current decay and by an increase in the
rate of recovery from the desensitized state. In contrast, tyrosine dephosphorylation had
a negative effect on receptor metabotropic activity, studied by western blot from ERK 1/2
pathway. In addition, unlike what was observed for tyrosine residues, alterations in the
phosphorylation status of serine and threonine residues present in the intracellular
domain did not cause any significant changes in α7 ionotropic activity under the
experimental conditions used. Summing up, the results collected in this chapter show that
tyrosine phosphorylation, although it is absolutely necessary for α7 metabotropic activity
mediated by ERK 1/2 pathway, acts as a negative modulator of receptor ionotropic
activity.
Chapter II focused on the study of the functional association between a peptide
fragment of SARS-CoV-2 S glycoprotein (Y674-R685) and human α7 nicotinic
acetylcholine receptor. The association between SARS-CoV-2 and nicotinic receptors was
hypothesized at the beginning of the pandemic. Later, molecular dynamics simulations
showed that the Y674-R685 fragment not only has affinity for α7 but also penetrates deep
into its agonist-binding pocket. In this chapter, it was firstly stated that the Y674-R685
fragment acts as a silent α7 agonist, since it is capable of triggering single-channel and
macroscopic currents, but only in the presence of a positive allosteric modulator. On the
other hand, it was shown that Y674-R685 also exerts α7 negative modulation, which was
evidenced by a profound concentration-dependent decrease in the duration of
acetylcholine-induced activation episodes from potentiated channels and macroscopic
responses. In this way, using different electrophysiological approaches, the existence of
functional interaction between SARS-CoV-2 S glycoprotein Y674-R685 fragment and α7
receptor was revealed, which provides the molecular bases to further explore nicotinic
receptor participation in COVID-19 pathophysiology.
Chapter III was based on the study of the α7 receptor as a target of cannabidiol,
which is of great interest due to the expanded use of this phytocannabinoid to treat
different pathological conditions thanks to its therapeutic properties and the absence of
psychoactive effects. To this end, the effect of cannabidiol on α7 ionotropic and
metabotropic functions was explored using electrophysiological techniques and
intracellular Ca2+ movement assays. Regarding ionotropic functions, it was shown that
cannabidiol produces a rapid decrease in single-channel activity evidenced by the
reduction in activation episodes frequency. This concentration-dependent effect occurred
with an IC50 in the submicromolar range, indicating a potent negative modulation. On the
other hand, cannabidiol also produced a negative modulation in α7 metabotropic function
that was evidenced by a marked decrease in intracellular Ca2+ responses after receptor
activation. These results demonstrate that cannabidiol exerts α7 negative modulation of
pharmacological relevance that must be taken into account when evaluating possible
therapeutic uses of the phytocannabinoid.
Taken together, the results presented in this thesis broaden the understanding of
molecular aspects related to the modulation of α7 nicotinic acetylcholine receptor
ionotropic and metabotropic functions under different conditions, namely physiological
(phosphorylation/dephosphorylation events), pathological (SARS-CoV-2 S glycoprotein
fragment) and therapeutic (cannabidiol).
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Étude électrophysiologique de trois polymorphismes (R87Q, A251T et P307S) identifiés dans le canal potassique hKv1.5 chez l'humain et évaluation de leur rôle potentiel dans la fibrillation auriculaire post-opératoirePlante, Isabelle 11 April 2018 (has links)
La fibrillation auriculaire peut, entre autre, apparaître suite à une chirurgie cardiaque telle un pontage coronarien ou encore être de type familial. Il est connu depuis longtemps que cette maladie est multigénique, mais ses bases génétiques sont encore mal comprises. La fibrillation auriculaire est caractérisée par une activité électrique anarchique et à haute fréquence entraînant un remodelage de l'oreillette. L'étude présentée dans cette thèse avait pour but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de cette pathologie. Étant donné que le canal potassique hKvl.5 (codé par le gène hKvl.5) produit un courant principal de la repolarisation de l'oreillette humaine (Ifcur), nous avons amplifié et séquence le gène hKvl.5 de 96 Canadiens-Français afin de déterminer si des mutations ou polymorphismes dans ce gène pourraient être à l'origine de la fibrillation auriculaire. Nous avons retrouvé, au niveau de la séquence peptidique, les polymorphismes R87Q, A251T et P307S à l'état hétérozygote chez certains patients. Ces derniers sont situés respectivement dans l'extrémité NFb-terminale, le segment transmembranaire SI et la première boucle extra-cellulaire du canal. Les polymorphismes ont été reproduits par mutagenèse dirigée, exprimés dans une lignée de cellules CHO et caractérisés sur le plan électrophysiologique par la technique de patch-clamp. Le polymorphisme A251T n'entrave pas les fonctions du canal hKvl.5, mais R87Q et P307S diminuent la densité du courant et l'amplitude de l'inactivation. R87Q accélère également la vitesse d'ouverture du canal. La co-expression de ces polymorphismes avec le canal sauvage, qui a été effectuée dans le but de reproduire leur caractère hétérozygote, a démontré que R87Q a un effet plutôt dominant contrairement à P307S. Afin de déterminer si les polymorphismes identifiés interfèrent avec la liaison du canal aux sous-unités p, chacun d'eux a été exprimé dans des cellules HEK293; ces dernières n'expriment pas de sous-unité P, contrairement aux cellules CHO qui expriment Kvp2.1. Les caractéristiques électrophysiologiques observées dans les cellules CHO pour R87Q et P307S n'ont pas été reproduites dans les cellules HEK293, suggérant que ces polymorphismes modulent la liaison à la sous-unité p et que les effets observés dans les cellules CHO pourraient également s'exprimer dans le myocarde. Comme les polymorphismes R87Q et P307S tendent à augmenter la vitesse de la repolarisation de l'oreillette, nous avons tenté de savoir s'ils pourraient être impliqués dans le développement de la fibrillation auriculaire. Nous avons recherché leur présence parmi une population de 135 patients ayant eu un pontage coronarien et desquels 46 ont fait de la fibrillation auriculaire post-opératoire. Bien qu'aucun d'eux n'ait pu être relié de façon significative à cette pathologie, nous avons observé une plus forte prévalence des polymorphismes R87Q et P307S chez les patients qui ont fait de la fibrillation auriculaire post-opératoire (fréquences alléliques respectives de 1,09 et 3,26% comparativement à 0 et 0,56% chez les patients demeurés en rythme sinusal). La présence des trois polymorphismes que nous avons identifiés et caractérisés lors de la présente étude a aussi été recherchée chez des patients atteints de fibrillation auriculaire familiale parmi quatre familles Canadiennes-Françaises. Cependant, seul A251T a été retrouvé chez une mère de famille présentant de la fibrillation auriculaire et chez sa fille non atteinte. Comme ce polymorphisme ne modifie pas les propriétés électrophysiologiques de hKvl.5, nos résultats démontrent que, du moins pour les quatre familles étudiées, des gènes autres que hKvl.5 seraient en cause dans le développement de la maladie, qui est d'ailleurs multigénique. Compte tenu de leurs effets sur les fonctions du canal hKvl.5, nos travaux démontrent que les polymorphismes R87Q et P307S pourraient être impliqués, en combinaison avec d'autres facteurs tel le stress oxydatif causé par un pontage coronarien, dans le développement de la fibrillation auriculaire.
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Intrinsic and Synaptic Properties of Olfactory Bulb Neurons and Their Relation to Olfactory Sensory ProcessingBalu, Ramani 20 March 2007 (has links)
No description available.
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INVESTIGATION OF THE ELECTROPHYSIOLOGICAL PROPERTIES OF THE MAJOR CELL TYPES IN THE RAT OLFACTORY TUBERCLEChiang, Elizabeth C. January 2008 (has links)
No description available.
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"Mechanisms of Adrenal Medullary Excitation Under the Acute Sympathetic Stress Response"Hill, Jacqueline Suzanne 27 August 2012 (has links)
No description available.
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