La production hétérologue des protéines membranaires reste difficile, peut-être parce que l’insertion dans la membrane de la cellule hôte constitue une étape limitante de la production. Afin de tourner cette difficulté, deux modes de synthèse ont été envisagés: la synthèse de protéines dans un système a-cellulaire, en l’absence de membrane mais en présence de détergent, ou l’adressage forcé de la protéine vers les corps d’inclusion dans le cas d’une expression plus classique en bactérie entière. La réalisation des deux stratégies repose sur l’utilisation de protéines de fusion possédant une séquence d’entraînement en amont du gène d’intérêt, soit qu’elles améliorent la traduction du transcrit en limitant le repliement spatial de ce dernier, soit qu’elles favorisent la production de la protéine d’intérêt en corps d’inclusion. La porine OmpX et le peptide T7 ont été choisis en cas d’expression dans les systèmes bactériens. La protéine SUMO est utilisée pour la production dans un lysat eucaryote. Les différentes approches ont été testées sur la production de la pannexine1 humaine (Px1).Si les séquences d’entraînement OmpX et le peptide T7 sont correctement produites in vitro, aucune des deux, en revanche, ne favorise la production de la Px1. Seul l’entraîneur SUMO est efficace. En effet, nous avons observé que cette protéine augmente la production de la Px1 dans un lysat eucaryote de germe de blé. Par ailleurs OmpX, connue pour être largement produite in vivo dans les corps d’inclusion, n’entraîne pas la localisation de la Px1 dans ces structures. Contre toute attente, l’étiquette T7 dirige la Px1 dans les corps d’inclusion. L’étude électrophysiologique de la Px1 a donc été effectuée à partir de la protéine produite in vivo (T7his-Px1) après renaturation, ou produite sous forme soluble in vitro (his6-Px1) dans le lysat eucaryote. Dans le cas de la protéine T7his-Px1 renaturée, une activité canal qui rappelle celle qui est observée après expression dans l’ovocyte de Xénope, a été détectée en patch-clamp, mais dans trois cas seulement. Dans le cas de la protéine his6-Px1, aucune activité canal n’est clairement détectée. Dans une deuxième partie de ce travail on examine le rôle de la boucle périplasmique dans la sensibilité à la pression du MscL, un canal mécanosensible bactérien devenu un système modèle dans l’étude de la mécanosensibilité. Presque toutes les études fonctionnelles sur ce canal ont été réalisées sur le canal de E.coli, alors que la structure a été obtenue à partir de l’homologue de M. tuberculosis. Une étude fonctionnelle a montré que le MscL de M. tuberculosis est difficile à ouvrir : son ouverture requiert l’application d’une pression double de celle qui est nécessaire chez E.coli. Les deux homologues diffèrent principalement par la longueur de leur unique boucle périplasmique. De manière à examiner le rôle de la boucle, on a comparé l’activité du canal MscL de E.coli, celle du canal de M. tuberculosis et celle d’une protéine chimère constituée de la protéine de M. tuberculosis dans laquelle la boucle a été changée pour celle de la protéine de E.coli. De manière inattendue, nous avons constaté que les canaux de E.coli et de M. tuberculosis ont la même sensibilité à la pression. La protéine chimère n’avait pas d’activité canal. Si ce travail ne permet pas de conclure quant au rôle de la boucle, il montre sans ambigüité que contrairement à ce qui a été rapporté les canaux MscL de E.coli et de M. tuberculosis ne diffèrent pas sensiblement sur le plan fonctionnel / The production of heterologous membrane protein is notoriously difficult; this might be due to the fact that insertion of the protein in the membrane host is a limiting step. To by-pass this difficulty, two modes of synthesis were tested: 1) production in a cell-free system devoid of biological membrane but supplemented with detergent or liposomes, 2) production in bacteria, with targeting of the membrane protein to inclusion bodies. Both strategies were tested for the production of the human pannexin 1 channel (Px1). The gene coding the protein was fused with an “enhancer” sequence resulting in the addition of a peptide or short protein at the N terminus of the protein of interest. This enhancer sequence which is well produced in vitro or in vivo is supposed to facilitate the translation of the protein of interest. Three enhancer sequences were chosen: 1) the small porin OmpX of E. coli, which, in addition, should target the protein to inclusion bodies when the protein is expressed in bacteria 2) a peptide of phage T7 for expression in E.coli lysate or E.coli cells 3) the small protein SUMO for production in a wheat germ cell-free system. In a bacterial cell-free system, neither OmpX nor T7 promoted Px1 production. Px1 is only produced when the SUMO enhancer sequence is used in the wheat germ system. In bacteria, OmpX, known to form inclusions bodies did not promote the targeting of the fusion protein to inclusion bodies. Unexpectedly, the peptide T7 was able to do it.Px1 obtained from inclusion bodies (T7his-Px1) was renatured and reconstituted in liposomes. Similarly his6-Px1 produced in wheat germ system was reconstituted in liposomes. Both preparations were used for electrophysiological studies (patch-clamp and planar bilayers). With the refolded T7his-Px1, channel activity reminiscent of that observed with Px1 expressed in Xenope oocyte (Bao et al., 2004) could be detected, but only in three cases. In the case of his6-Px1, no clear channel activity could be observed. The second part of this work deals with the involvement of the periplasmic loop of the bacterial mechanosensitive channel MscL in its sensitivity to pressure. Mscl has become a model system for the investigation of mechanosensisity. Nearly all functional studies have been performed on MscL from E.coli while the structure of the protein has been obtained from the Mycobacterium tuberculosis homologue. In one functional study it was shown that MscL from M. tuberculosis is extremely difficult to open, gating at twice the pressure needed for E.coli MscL The periplasmic loop is the most variable sequence between the two homologues, being longer in E.coli than in M. tuberculosis. In order to assess the role of the periplamic loop in the sensitivity to pressure, we compared the activity of the E.coli and M. tuberculosis MscL and of a chimeric protein made of the M. tuberculosis protein in which the periplasmic loop has been exchanged for that of the E. coli channel. Unexpectedly, M. tuberculosis and E .coli MscL were observed to gate at a similar applied pressure. The chimeric protein had no functional activity. In conclusion, this study does not allow any conclusion as to the role of the loop in the sensitivity to pressure, but it shows clearly that, in contrast to the results of a previous study, there is no functional difference between E. coli and M. tuberculosis MscL.

Les ganglions de la base (GB) sont un ensemble de noyaux sous-corticaux impliqués dans les fonctions motrices, mnésiques et cognitives. Le globus pallidus externe (GPe) est un noyau GABAergique, qui tient la place de structure relais entre le striatum et le noyau sous-thalamique au sein du réseau des GB. Les changements de mode et de fréquence de décharge des neurones du GPe sont connus pour être les signatures électro-physiologiques des maladies de Parkinson (MP) et de Huntington (MH). Dans la MP, où les concentrations de GABA extracellulaires sont anormalement élevées dans le GPe, il est admis que la voie striato-pallidale (STR-GPe) est hyperactive, ce qui contribue à l’hypoactivité des neurones pallidaux. A l’inverse dans la MH, il est admis que l’hyperactivité des neurones du GPe est due à la dégénérescence de la voie STR-GPe levant la principale influence inhibitrice du GPe. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces changements d’activité pallidale sont encore peu connus. Nous avons donc entrepris des expériences de biologie moléculaire, d’immunohistochimie et d’électrophysiologie sur tranches, afin de mieux caractériser l’origine des modifications de transmission GABAergique conduisant aux changements d’activité électro-physiologique des neurones du GPe dans ces deux pathologies à l’aide de modèles animaux. Mes principaux résultats montrent l’apparition d’une inhibition tonique dans les neurones du GPe due à un déficit de recapture du GABA dans la MP et une réduction précoce de la transmission synaptique GABAergique dans la MH. Ces résultats suggèrent que les altérations de la transmission GABAergique contribuent à la physiopathologie de la MP et la MH. / The basal ganglia (BG) are a group of sub-cortical nuclei involved in motor, memory and cognitive functions. In the BG, the GABAergic external globus pallidus (GPe) holds a position of relay nucleus between the striatum (STR) and the sub thalamic nucleus within the indirect pathway of the BG. Modifications of rate and pattern of activity of this nucleus are known to be the electrophysiological signatures of Parkinson’s (PD) and Huntington’s diseases (HD). In PD, hyperactivity of the striato-pallidal (STR-GPe) pathway is thought to be responsible for the increase of the extracellular GABAergic concentrations in the GPe and participate to the hypoactivity of pallidal neurons observed in experimental Parkinsonism. In contrast, during HD, it is recognized that the hyperactivity of GPe neurons is due to the degeneration of striato-pallidal neurons and thus to the reduction of the main source of pallidal GABAergic inhibition. However, the molecular mechanisms involved in these modifications of pallidal activity are not well characterized. Therefore, using PD and HD animal models, the 6-OHDA rodents and the R6-1 transgenic mice respectively, we have performed molecular biology, immunohistochemistry and electrophysiological in vitro experiments in order to better understand the origin of GABAergic transmission alterations leading to changes in electrophysiological activity of GPe neurons into these two pathologies. My main results show the apparition of a tonic GABAergic inhibition due to a deficit of GABA uptake in PD and a early stage reduction of GABAergic synaptic transmission in HD. Altogether, these results suggest that alterations of GABAergic transmission contribute to the pathophysiology of PD and HD.

Le neurone est une cellule polarisée qui se divise en deux compartiments spécialisés : le compartiment somato-dendritique et le compartiment axonal. Généralement, le premier reçoit l'information en provenance d'autres neurones et le second génère un message en sortie lorsque la somme des entrées dépasse une valeur seuil au segment initial de l'axone. Ce signal de nature discrète appelé potentiel d'action (PA) est propagé activement jusqu'à la terminaison synaptique où il déclenche la transmission chimique de l'information. Cependant, la fonction axonale ne se résume pas à la simple transmission des séquences de PA à l'image d'un câble de télégraphe. L'axone est également capable de transmettre des variations continues de signaux électriques infraliminaires dit analogues et les combiner avec l'information digitale véhiculée par le PA. J'ai consacré la majorité de mon travail de thèse à l'étude de ce nouvel aspect de la fonction axonale dans le cadre de la transmission synaptique entre les neurones pyramidaux au sein du réseau excitateur CA3 de l'hippocampe de rat. Les résultats obtenus à partir d'enregistrements de paires de neurones pendant ma thèse mettent en évidence deux sortes de signalisation analogue et digitale qui aboutissent à la facilitation de la transmission synaptique. La facilitation analogue-digitale (FAD) a été observée lors d'une dépolarisation prolongée, mais également à la suite d'une hyperpolarisation transitoire au niveau du corps cellulaire. Ce sont deux versants d'une même plasticité à court-terme qui découle de l'état biophysique des canaux ioniques sensibles au voltage étant à l'origine du PA. / The neuron is a polarised cell divided into two specialized compartments: the somato-dendritic and the axonal compartment. Generally, the first one receives information arriving from other neurones and the second generates an output message, when the sum of inputs exceeds a threshold value at the axon initial segment. This all-or-none signal, called the action potential (AP) is propagated actively to the synaptic terminal where it triggers chemical transmission of information. However, axonal function is not limited to transmission of AP sequences like a telegraph cable. The axon is also capable of transmitting continuously changing sub-threshold electric signals called analogue signals and to combine them with the digital information carried by the AP. I devoted the majority of my thesis work to the study of these novel aspects of axonal function in the framework of synaptic transmission between pyramidal neurons in the CA3 excitatory network of the rat hippocampus. The results obtained through paired recordings brought to light two kinds of analogue and digital signalling that lead to a facilitation of synaptic transmission. Analogue-digital facilitation (ADF) was observed during prolonged presynaptic depolarization and also after a transient hyperpolarization of the neuronal cell body. These are two sides of the same form of short-term synaptic plasticity depending on the biophysical state of voltage gated ion channels responsible for AP generation. The first variant of ADF induced by depolarization (ADFD) is due to AP broadening and involves Kv1 potassium channels.

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Le cervelet est une structure cérébrale impliquée dans la régulation motrice. Dans le cortex cerebelleux, les informations sensorimotrices sont transmises par les cellules en grain. Mon travail de thèse démontre que les connections synaptiques de ces neurones ont des propriétés hétérogènes. D’une synapse à l’autre, j’ai pu observer des variations d’ultrastructure, de composition moléculaire et de fonctionnement au cours de trains de potentiels d’action à haute fréquence. Plus particulièrement, j’ai caractérisé les propriétés de « plasticité à court terme » des synapses unitaires des cellules en grain : 1) Elles sont très différentes d’une synapse à l’autre et peuvent être classées en différentes sous-catégories. 2) Certaines catégories de fonctionnement synaptique reposent sur l’expression de molécules telles que la Synapsine2. 3) La réponse d’un neurone post-synaptique à de hautes fréquences de stimulation dépend de la nature de la synapse activée. / Cerebellum is a brain structure involved in motor regulation and motor learning. In the cerebellar cortex, sensorimotor information is transmitted by granule cells. During my PhD, I demonstrated that the properties of individual granule cell synaptic connections are highly heterogeneous. From one synapse to another, I observed ultrastructural, molecular and functional variability at unitary contacts. More precisely, I assessed the properties of short term plasticity at individual synapses during high frequency trains of stimulation :1) Short term plasticities are highly heterogeneous from one synapse to another and can be classified in sub-categories.2) Some categories of short-term plasticity profiles relie on the expression of molecules such as Synapsin2.3) The response of post-synaptic neuron to high-frequency inputs is dependent on the nature of the activated synaptic contact.

Le cervelet est un petit cerveau dans le cerveau. Il contient plus de la moitié du nombre total de neurones du cerveau. Sa structure très régulière est bien connue, toutefois son rôle demeure mystérieux. Le développement essentiellement postnatal du cervelet chez les rongeurs permet d’y étudier la formation activité-dépendante du réseau de neurones. C’est aussi le siège où s’opèrent diverses formes de plasticité synaptique, ce qui en fait un modèle d’étude idéal pour la plasticité synaptique développementale et adulte. Au cours de cette thèse, à l’aide d’enregistrements électophysiologiques en patch-clamp et en extracellulaire sur des tranches aigües de cervelet de souris et grâce aux techniques immunohistochimiques, j’ai étudié trois acteurs importants de la plasticité synaptique et du développement des cellules de Purkinje, les neurones centraux du cortex cérébelleux. Nous avons démontré que l’activation du récepteur métabotropique glutamatergique de type 1 (mGlu1) déclenche l’activation et l’ouverture de GluD2, un récepteur nécessaire au développement et à la plasticité des synapse des cellules de Purkinje (CPs). Nous avons également mis en évidence que les Pannexines 1, des canaux potentiellement impliqué dans la synchronisation neuronale récemment découverts et encore mal caractérisés, sont exprimées par les cellules de Purkinje Zebrine II –immunopositives, suivant les bandes parasagittales que délimitent les microdomaines du cervelet. Enfin, nous avons étudié la physiologie du cortex cérébelleux des souris néonatales, cherchant à caractériser les différents acteurs essentiels à l’activité neuronale de ce cortex en développement très particulier et peu étudié. L’activation du récepteur GluD2 médiée par mGlu1 dans la synapse entre Fibre Parallèle et cellule de Purkinje (synapse PF-PC). GluD2 est classifié parmi les récepteurs ionotropiques glutamatergique, pourtant aucun ligand n’est capable d’induire l’ouverture de son canal. Nous avons identifié pour la première fois un mécanisme physiologique d’ouverture du canal de GluD2 en démontrant que l’activation de mGlu1 déclenche l’ouverture du canal de GluD2 pour une voie intracellulaire, aussi bien dans un système d’expression en culture que dans les tranches aigues de cervelet murin. Cela nous permettra d’étudier la contribution du courant médié à travers GluD2 dans la plasticité à long terme, avec des perspectives totalement nouvelles. L’expression de Pannexine 1 par les CPs se superpose aux stries Zebrine II- immunopositives du cervelet. Les CPs adultes constituent une population hétérogènes, les différents sous-types étant organisés sur le plan parasagittal. Nous avons montré que l’expression des protéines Pannexine 1 (Panx1) We have shown that Pannexin1 (Panx1) déssine un gradient rostrocaudal discontinu dans les lobules de tranches parasagittales. Sur les coupes coronales, leur distribution forme une série de bandes parasagittales. Les canaux Panx1 médient la libération d’ATP en réponse à divers stimuli et pourrais de cette façon contribuer à une activité neuronale orientée sur le plan parasagittal en réponse aux signaux des fibres parallèles. Caractérisation de l’activité GABAergique des CPs immatures dans les souris néonatales. Le cortex cérébelleux entre les jours postnataux P0 et P4 consistent principalement en une multicouche dense de CPs fortement interconnectées. A cet âge, les CPs sont remplies de GABA extrasynapstique qui est libéré dans le milieu extracellulaire par un mécanisme qui n’est pas clairement identifié. Nos recherches préliminaires sur la première semaine de développment postnatal, nous montrons que l’activation de récepteur au GABA de type A induit une réponse excitatrice chez les CPs. Avec notre préparation, cet effet est indépendant de la présence de corps cétoniques ou de lactate comme substrats énergétiques dans le milieu extracellulaire. (...) / The cerebellum is a little brain in the brain. It houses more than half the total number of neurons in the brain. Its crystalline structure is very well known but, still, its function remain unclear to date. Its mainly postnatal development in rodents allows the study of the physiology of activity-dependent neuronal wiring. It is also the place of many types of neuronal plasticity, making it an ideal model to study both developmental and adult synaptic plasticity. In this thesis, using mainly patch-clamp and extracellular recordings in cerebellar slices as well as immunohistochemistry in mice, I have studied three important actors of synaptic plasticity and development in the Purkinje cells, the principal neurons of the cerebellar cortex. We have established that the type 1metabotropic glutamate receptor (mGlu1) triggers the gating of GluD2, a receptor necessary for Purkinje cells (PCs) synapses development and synaptic plasticity. We have also shown that the Pannexins 1, some channels likely involved in neuronal synchronization that have been recently discovered but yet remain poorly characterized, are expressed by Zebrin II immmunopositive Purkinje cells in the classical Zebra stripes formed by microdomains of the cerebellum. Last, we have studied the physiology of the primitive cerebellar cortex in neonatal mice, establishing the first elements of the neuronal activity of this very particular developing cortex at a stage still very poorly characterized. The mGlu1-mediated gating of Glu2D receptors at Parallel Fiber to PC (PF-PC) synapse. GluD2 are classified among ionotropic glutamate receptors, but no ligand has proved capable of gating their channel. We have identified for the first time a physiological mechanism of gating GluD2 channels by demonstrating that the activation of mGlu1 triggers the opening of GluD2 channels through intracellular pathways, both in expression systems and in acute murine cerebellar slices. This will allow us to study the contribution of GluD2-mediated current in long-term plasticity in a totally new way. Expression of Pannexin1 by PCs matches with adult Zebrin II immunopositive cerebellar stripes. Adult PCs constitute an heterogeneous population, the different subtypes being parasagittaly organized. We have shown that Pannexin1 (Panx1) proteins expression by PCs, draw a rostrocaudal discontinuous gradient in lobules of parasagittal slices. In transverse slices, their distribution forms an array of parasagittal stripes. Panx1 channels mediate ATP release in response to various stimuli and may in this way contribute to parasagittally oriented response to PF inputs. Characterization of GABAergic activity of immature Purkinje cells of newborn mice. The cerebellar cortex during postnatal days P0 to P4 essentially consists in a dense multilayer and highly interconnected network of PCs. At this age, PCs are filled with extrasynaptic GABA which is released in the extracellular space by a mechanism that is not clear. In our preliminary investigation of first week postnatal development, we show that activation of GABA-A receptors leads to excitatory responses in PCs. In our preparation, this effect is independent of the presence of keton bodies or lactate as energetic substrates in the extracellular medium. The complete inhibition of spontaneous discharge of PCs by Panx1 channel blockers, suggests that they mediate ion fluxes or release of neuromediators, such as ATP or GABA.

The canonical Wnt/β-catenin signalling pathway plays an important role in proliferation and differentiation of neural progenitors during embryogenesis as well as postnatally. In the present study, the effect of the Wnt signalling pathway on the differentiation potential of neonatal and adult neural stem cells (NS/PCs) isolated from subventricular zone (SVZ) of lateral ventricles and their membrane properties were studied eight days after the onset of in vitro differentiation. To manipulate Wnt signalling at different cellular levels, three transgenic mouse strains were used, which enabled inhibition or activation of the pathway using the Cre- loxP system. We showed that the activation of the Wnt signalling pathway leads to higher expression of β-catenin in both postnatal as well as adult NS/PCs, while Wnt signalling inhibition results in the opposite effect. To follow the fate of NS/PCs, the patch-clamp technique, immunocytochemistry, and Western blot were employed. After eight days of NS/PCs differentiation we identified three electrophysiologically and immunocytochemically distinct cell types of which incidence was significantly affected by the canonical Wnt signalling pathway, only in differentiated neonatal NS/PCs. Activation of this pathway suppressed gliogenesis, and promoted neurogenesis,...

In the field of drug addiction, relapse back to drug seeking and taking is the major unmet clinical need. The rate of relapse back to drug-taking is ~70-80% within a year of drug abstinence. Gaining a better understanding of the prolonged neuronal changes that have taken place during drug addiction may lead to the design of better anti-relapse therapies. It is now widely believed that one component of drug addiction is by aberrant learning and memory processes. To study this, we investigated synaptic changes caused by the development of drug-seeking behaviour in C57BL/6J mice. Mice were treated either with non-contingent morphine or trained to exhibit drug-seeking behaviour following morphine-induced conditioned place preference (CPP) training, hippocampal slices were taken from these animals and synaptic changes examined at the CA3-CA1 synapse using electrophysiological methods. Mice that underwent morphine CPP were demonstrated to exhibit a significant preference for the morphine paired compartment before ex vivo electrophysiological analysis. Using field recordings, both non-contingent morphine and morphine CPP treatments resulted in a reduced ability to undergo stimulus-induced LTP compared to their respective controls. Whole cell patch clamp was then utilised to further investigate these effects. Non-contingent morphine treatment resulted in both pre- and post-synaptic changes with an increased AMPA:NMDA receptor ratio, concurrent increases in cell size, and reductions in the release probability of both glutamate and GABA. Morphine CPP treatment resulted in a more variable increase in AMPA:NMDA receptor ratio (presumably by the same mechanism but in a more specific group of neurones) and GABA release probability was also decreased. There were no detected increases in cell size however, or any detected changes in glutamate release probability. These findings therefore reveal a set of synaptic adaptations in the hippocampus unique to morphine-induced behavioural change, and may provide targets for future intervention in drug addiction.