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This thesis focuses on elucidating the electrical mechanisms underlying excitation of small intestinal and colonic smooth muscle initiated by interstitial cells of Cajal (ICC). All the ICC subtypes are involved in the orchestration, generation, and/or transmission of electrical signals to smooth muscle to pace gut motor patterns. Some ICC types have intrinsic activity leading to omnipresent rhythmic changes in smooth muscle excitability; others respond to stimuli, inducing pacemaker activity as required. Together they orchestrate motor patterns such as propulsion and segmentation, essential functions of the gut. To study ICC electrophysiology, I utilized patch clamping to record ion channel currents from single intestinal ICC and sharp microelectrodes to record colonic smooth muscle membrane potentials. I have made several discoveries contributing to our understanding of ICC electrophysiology. Firstly, my research increased our understanding of the properties of intrinsic pace-maker activity. I showed that maxi Cl– channels from small intestinal ICC make a significant contribution to slow wave depolarization triggered by intracellular calcium. Secondly, I showed that colonic intramuscular ICC (ICC-IM) selectively express KV7.5 channels, which are suppressed by cholinergic agonists, meaning that excitatory stimuli triggering acetylcholine release deactivate KV7.5 channels, leading to increased excitability. Thirdly, I have shown that the bile acid chenodeoxycholic acid and the nitric oxide donor sodium ni-troprusside both induce pacemaker activity, rhythmic transient depolarisations in mouse colonic muscle, which led to the hypothesis that nitrergic nerves are involved in generating inducible myenteric plexus ICC (ICC-MP) pacemaker activity. It is only when ICC are suitably stimulated by intracellular processes such as rhythmic Ca2+ transients or extracellular signalling from neurotransmitters or small molecules, that ICC produce membrane potential rhythmicity, required for generation of intrinsic slow waves, low-frequency rhythmic transient depolarisations and transmission of excitation into the muscle. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / The gut is essential for digestion and absorption of food. The gut has special cells called interstitial cells of Cajal (ICC), which control the contractions of the gut muscle. ICC are pacemaker cells, like those that pace heart beats. To pace gut muscle contractions, ICC generate electrical signals which cause the muscle to contract in an organized rhythmic manner, which promotes mixing or propulsion of gut contents, called motility. I used tiny electrodes to record electrical activity from ICC or gut muscle, to improve our understanding of how ICC pacemaker activity controls motility. My research characterised ion channels, which are microscopic protein pores that allow cells to make electrical currents, that enable generation of pacemaker signals by ICC. I also investigated activation of ICC electrical activity that causes propulsive colonic motility. This will hopefully lead to treatment improvements for patients with motility disorders in the future.

Los receptores cys-loop pertenecen a la familia de canales iónicos pentaméricos activados por ligandos (pLGICs). Se expresan ampliamente en el sistema nervioso, donde ejercen un rol vital en la comunicación neuronal. Están involucrados en los procesos de aprendizaje, memoria, movimiento, entre otros. Se han asociado alteraciones en la funcionalidad de estos receptores con una gran variedad de desórdenes neurológicos, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, síndromes miasténicos, esquizofrenia y depresión. Por ello, los receptores cys-loop son importantes blancos farmacológicos. En consecuencia, consideramos que el conocimiento de los mecanismos moleculares que conducen a su activación y disfunción es de suma relevancia. Los receptores Cys-loop están formados por un dominio extracelular, que contiene los sitios de unión de agonista, y un dominio transmembrana, que forma el poro iónico. La interfase entre ambos dominios, llamada región de acoplamiento, desempeña un rol clave en la propagación de los cambios conformacionales que se inician con la unión del agonista en la región extracelular y culminan con la apertura del poro iónico a nivel transmembranal. En este trabajo de Tesis Doctoral estudiamos dos regiones claves en el proceso de activación de los receptores Cys-loop: el sitio de unión de agonista, donde comienza la respuesta, y la interfase entre los dominios extracelular y transmembrana o región de acoplamiento. Utilizamos receptores homopentaméricos que por estar compuestos por cinco subunidades iguales, poseen cinco sitios de unión de agonista y cinco regiones de acoplamiento idénticas. Los receptores homoméricos surgieron más tempranamente en la escala evolutiva por lo que presentan características estructurales y funcionales comunes a todos los miembros Cys-loop, y son, por lo tanto, modelos útiles para el estudio de los receptores de esta familia. En el Capítulo I de esta Tesis determinamos el número de regiones de acoplamiento necesario para la activación de los receptores Cys-loop y su relación con los sitios de unión de agonista. Para ello, utilizamos como modelo de receptor homopentamérico al receptor quimérico a7-5HT3A, compuesto por secuencias del receptor a7 en su dominio extracelular y secuencias del receptor 5-HT3A en su dominio transmembrana, el que ha sido ampliamente utilizado como modelo de a7. Para conocer la contribución de cada una de las cinco regiones de acoplamiento a la estabilidad de canal abierto del receptor a7-5HT3A, empleamos nuestra estrategia experimental denominada electrical fingerprinting. Según esta estrategia, co-transfectamos células con una subunidad conteniendo la región de acoplamiento activa y otra subunidad conteniendo la región de acoplamiento inactiva, una de ellas conteniendo además mutaciones reporteras de conductancia. De esta forma, logramos expresar en membrana receptores con distinto número de regiones de acoplamiento funcionales que son identificados mediante registros de patch-clamp de canal único. Gracias a la presencia de las mutaciones reporteras de conductancia, la medición de la amplitud de cada apertura nos permitió conocer la estequiometria del receptor, es decir, el número de subunidades con región de acoplamiento funcional que tiene el receptor pentamérico que dio origen a esa apertura. Determinamos la duración de los eventos de apertura provenientes de receptores con distinto número de regiones de acoplamiento funcionales, que constituye una medida de la estabilidad de canal abierto. Encontramos que cada región de acoplamiento contribuye en forma independiente y simétrica a la estabilidad del canal abierto y que son necesarias las cinco regiones de acoplamiento funcionales para lograr la óptima activación del receptor. Demostramos además que la presencia de una sola región de acoplamiento funcional en el pentámero es suficiente para lograr la activación pero no permite mantener el canal abierto en su tiempo óptimo. Además generamos receptores a7-5HT3A mutantes, que contenían distinto número de sitios de unión de agonista y regiones de acoplamiento funcionales. Esta estrategia nos permitió establecer los requisitos estructurales mínimos que logran la activación del receptor, así como también los requerimientos estructurales que conducen a la máxima estabilidad del estado abierto. Encontramos que el receptor es capaz de responder al agonista mediante la ocupación de un único sitio si este se encuentra formado por dos subunidades con regiones de acoplamiento funcionales. Sin embargo, para lograr la óptima activación y duración máxima del canal abierto, el receptor modelo utilizado requiere de tres sitios de unión de agonista funcionales y sus cinco regiones de acoplamiento intactas. En el Capítulo II, estudiamos la activación del receptor neuronal a7 en condiciones de sub-ocupación de sus cinco sitios de unión de agonista. Este receptor se localiza principalmente en sitios distantes a los sitios de síntesis y liberación de acetilcolina (ACh), por lo que la ACh, o su producto colina, deben difundir y unirse a receptores a7 distantes. Este mecanismo colinérgico no sináptico predice que el grado de ocupación de los receptores a7 sería bajo en condiciones fisiológicas. Para estudiar la activación del receptor a7 en condiciones de sub-ocupación de sus sitios de agonista, realizamos ensayos electrofisiológicos y medimos la duración del canal abierto de receptores individuales que presentan un único sitio de unión de agonista funcional, y la comparamos con la de receptores que tienen sus cinco sitios funcionales. Para conocer el número de sitios de unión de agonista funcionales empleamos nuevamente la estrategia electrical fingerprinting. Esta estrategia requiere la medición exacta de la amplitud. Teniendo en cuenta que los receptores a7 presentan aperturas de duración breve que no permiten la resolución de su máxima amplitud, los estudios electrofisiológicos se realizaron sobre receptores a7 mutados o en presencia de potenciadores que aumentan la duración del canal abierto. En este trabajo, demostramos que la estabilidad del canal abierto de receptores a7 que presentan un único sitio de unión de agonista funcional es la misma que la de los receptores que presentan sus cinco sitios disponibles. Por otro lado, cuando reemplazamos el dominio transmembrana del receptor a7 por el del receptor 5-HT3A, encontramos que la duración del canal abierto se incrementa al aumentar el número de sitios ocupados por agonista. Este resultado demuestra por primera vez que el dominio extracelular no es el único determinante de la relación entre ocupación y estabilidad del canal abierto. Por lo tanto, en este trabajo demostramos la capacidad del receptor a7 de activarse y producir respuestas máximas con la ocupación de un solo sitio de unión de agonista, propiedad que es única y exclusiva de este receptor dentro de todos los miembros de la familia de receptores Cys-loop. Este resultado posee además relevancia fisiológica dado que esta propiedad le permitiría al receptor adaptarse al mecanismo de transmisión no sináptico. En su conjunto, los resultados que surgen de esta Tesis revelan una novedosa relación funcional entre dos dominios estructurales de estos receptores, el sitio de unión de agonista y la región de acoplamiento, y, además, contribuyen al conocimiento general del mecanismo de activación de los receptores de la familia Cys-loop. / Cys-loop receptors belong to the family of pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs). They are widely expressed in the nervous system, where they exert a vital role in neuronal communication. They are involved in learning, memory, movement processes, among others. Functional disorders of these receptors have been associated with several neurological disorders, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, myasthenic syndromes, schizophrenia and depression. Because Cys-loop receptors are important pharmacological targets for the development of therapies, the knowledge of the molecular mechanisms leading to activation and dysfunction of these receptors is of great importance. Cys-loop receptors contain an extracellular domain that carries the agonist binding sites and a transmembrane region that forms the ion pore. The interface between both domains, named as the coupling region, plays a key role in the propagation of the conformational changes from the binding site at the extracellular domain to the pore, located at the transmembrane region. In this Thesis, we studied two key regions that are essential for the activation process of Cys-loop receptors: the agonist binding site, where the response begins, and the interface between the extracellular and transmembrane domains or coupling region. We used homopentameric receptors that contain five identical subunits, and therefore five identical agonist binding sites and coupling regions. Because homomeric receptors appeared earlier on the evolutionary scale, they present structural and functional features that are common to all Cys-loop members, and are therefore useful models for the study of this receptor family. In Chapter I of this Thesis we studied the number of coupling regions necessary for Cys-loop receptor activation and evaluated the functional relationship of this domain with the agonist binding sites. To this end, we used a model of homopentameric receptor, the a7-5HT3A chimeric receptor, which contains a7 sequences in the extracellular domain and 5-HT3A sequences in the transmembrane domain. To determine the contribution of each of the five coupling regions to the stability of the open channel, we used our experimental strategy which is called electrical fingerprinting. For this strategy, cells were co-transfected with a subunit with an active coupling region and another subunit with an inactive coupling region, one of which carrying reporter conductance mutations, to generate receptors with different number of functional coupling regions. Next, we performed single-channel recordings to identify functional receptors using the patch-clamp technique. Due to the introduction of reporter conductance mutations, the measurement of the amplitude of each opening event allowed us to know receptor stoichiometry, i.e., the number of subunits with functional coupling region present in the pentameric receptor which originated the event. We measured open channel duration of receptors with different numbers of functional coupling regions, which indicates the open channel stability. We found that each coupling region contributes independently and symmetrically to open channel stability. We showed that five coupling regions are necessary to achieve optimal receptor activation and that the presence of only one functional coupling region is sufficient for receptor activation, but with reduced open channel duration. Furthermore, we constructed a7-5HT3A mutant receptors, containing different number of agonist binding sites and functional coupling regions. This strategy allowed us to establish the minimum structural requirements for receptor activation as well as the structural requirements for maximal open channel stability. We found that a7-5HT3A receptors are capable of responding to agonist by occupying a single agonist binding site, only if this site is formed by two subunits carrying functional coupling regions. However, to achieve optimal activation and maximal open channel duration, the model receptor requires three functional agonist binding sites and five functional coupling regions. In Chapter II, we studied a7 neuronal receptor activation under sub-occupancy conditions of its five agonist binding sites. In the brain, this receptor is mainly located at distant sites from the sites of synthesis and release of acetylcholine (ACh), so ACh, or its product choline, diffuse to bind distant a7 receptors. This non-synaptic cholinergic mechanism predicts that the degree of a7 receptor occupancy is low under physiological conditions. To study a7 activation under sub-occupancy conditions we performed single-channel recordings and measured open channel duration of receptors with only one functional agonist binding site, and compared it with that of receptors containing their five intact agonist binding sites. To know the number of agonist binding sites, we employed again the electrical fingerprinting strategy. This strategy requires accurate measurement of open channel amplitude. Because the brief duration of a7 opening events do not allow full amplitude resolution, single-channel recordings were performed in either a7 mutant receptors or in the presence of potentiators that increase open channel duration. In this work, we demonstrated that open channel stability of receptors with a single agonist binding site is the same as that of receptors containing five functional sites. Moreover, when we replaced the transmembrane domain of a7 receptors by that of 5-HT3A receptor, we found that open channel lifetime increases as the number of sites occupied by agonist increases. This result shows for the first time that the extracellular domain is not the only determinant of the relationship between occupancy and open channel stability. Therefore, in this work we demonstrated the ability of a7 receptor for activation and eliciting maximal responses with occupancy of only one agonist binding site, a property that is unique for a7 among all members of the Cys-loop family. This result has a physiological relevance since this property would allow a7 receptors to adapt to their non-synaptic mechanism. Taken together, the results that emerge from this Thesis reveal a novel functional relationship between two structural domains, the agonist binding site and the coupling region, and contribute to the general knowledge of the activation mechanism of Cys-loop receptors.

La fibrillation auriculaire peut, entre autre, apparaître suite à une chirurgie cardiaque telle un pontage coronarien ou encore être de type familial. Il est connu depuis longtemps que cette maladie est multigénique, mais ses bases génétiques sont encore mal comprises. La fibrillation auriculaire est caractérisée par une activité électrique anarchique et à haute fréquence entraînant un remodelage de l'oreillette. L'étude présentée dans cette thèse avait pour but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de cette pathologie. Étant donné que le canal potassique hKvl.5 (codé par le gène hKvl.5) produit un courant principal de la repolarisation de l'oreillette humaine (Ifcur), nous avons amplifié et séquence le gène hKvl.5 de 96 Canadiens-Français afin de déterminer si des mutations ou polymorphismes dans ce gène pourraient être à l'origine de la fibrillation auriculaire. Nous avons retrouvé, au niveau de la séquence peptidique, les polymorphismes R87Q, A251T et P307S à l'état hétérozygote chez certains patients. Ces derniers sont situés respectivement dans l'extrémité NFb-terminale, le segment transmembranaire SI et la première boucle extra-cellulaire du canal. Les polymorphismes ont été reproduits par mutagenèse dirigée, exprimés dans une lignée de cellules CHO et caractérisés sur le plan électrophysiologique par la technique de patch-clamp. Le polymorphisme A251T n'entrave pas les fonctions du canal hKvl.5, mais R87Q et P307S diminuent la densité du courant et l'amplitude de l'inactivation. R87Q accélère également la vitesse d'ouverture du canal. La co-expression de ces polymorphismes avec le canal sauvage, qui a été effectuée dans le but de reproduire leur caractère hétérozygote, a démontré que R87Q a un effet plutôt dominant contrairement à P307S. Afin de déterminer si les polymorphismes identifiés interfèrent avec la liaison du canal aux sous-unités p, chacun d'eux a été exprimé dans des cellules HEK293; ces dernières n'expriment pas de sous-unité P, contrairement aux cellules CHO qui expriment Kvp2.1. Les caractéristiques électrophysiologiques observées dans les cellules CHO pour R87Q et P307S n'ont pas été reproduites dans les cellules HEK293, suggérant que ces polymorphismes modulent la liaison à la sous-unité p et que les effets observés dans les cellules CHO pourraient également s'exprimer dans le myocarde. Comme les polymorphismes R87Q et P307S tendent à augmenter la vitesse de la repolarisation de l'oreillette, nous avons tenté de savoir s'ils pourraient être impliqués dans le développement de la fibrillation auriculaire. Nous avons recherché leur présence parmi une population de 135 patients ayant eu un pontage coronarien et desquels 46 ont fait de la fibrillation auriculaire post-opératoire. Bien qu'aucun d'eux n'ait pu être relié de façon significative à cette pathologie, nous avons observé une plus forte prévalence des polymorphismes R87Q et P307S chez les patients qui ont fait de la fibrillation auriculaire post-opératoire (fréquences alléliques respectives de 1,09 et 3,26% comparativement à 0 et 0,56% chez les patients demeurés en rythme sinusal). La présence des trois polymorphismes que nous avons identifiés et caractérisés lors de la présente étude a aussi été recherchée chez des patients atteints de fibrillation auriculaire familiale parmi quatre familles Canadiennes-Françaises. Cependant, seul A251T a été retrouvé chez une mère de famille présentant de la fibrillation auriculaire et chez sa fille non atteinte. Comme ce polymorphisme ne modifie pas les propriétés électrophysiologiques de hKvl.5, nos résultats démontrent que, du moins pour les quatre familles étudiées, des gènes autres que hKvl.5 seraient en cause dans le développement de la maladie, qui est d'ailleurs multigénique. Compte tenu de leurs effets sur les fonctions du canal hKvl.5, nos travaux démontrent que les polymorphismes R87Q et P307S pourraient être impliqués, en combinaison avec d'autres facteurs tel le stress oxydatif causé par un pontage coronarien, dans le développement de la fibrillation auriculaire.

Yes / Sublethal carbon monoxide (CO) exposure is frequently associated with myocardial arrhythmias, and our recent studies have demonstrated that these may be attributable to modulation of cardiac Na+ channels, causing an increase in the late current and an inhibition of the peak current. Using a recombinant expression system, we demonstrate that CO inhibits peak human Nav1.5 current amplitude without activation of the late Na+ current observed in native tissue. Inhibition was associated with a hyperpolarizing shift in the steady-state inactivation properties of the channels and was unaffected by modification of channel gating induced by anemone toxin (rATX-II). Systematic pharmacological assessment indicated that no recognized CO-sensitive intracellular signaling pathways appeared to mediate CO inhibition of Nav1.5. Inhibition was, however, markedly suppressed by inhibition of NO formation, but NO donors did not mimic or occlude channel inhibition by CO, indicating that NO alone did not account for the actions of CO. Exposure of cells to DTT immediately before CO exposure also dramatically reduced the magnitude of current inhibition. Similarly, L-cysteine and N-ethylmaleimide significantly attenuated the inhibition caused by CO. In the presence of DTT and the NO inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, the ability of CO to inhibit Nav1.5 was almost fully prevented. Our data indicate that inhibition of peak Na+ current (which can lead to Brugada syndrome-like arrhythmias) occurs via a mechanism distinct from induction of the late current, requires NO formation, and is dependent on channel redox state. / This work was supported by the British Heart Foundation

No / T-type Ca2+ channels are a distinct family of low voltage-activated Ca2+ channels which serve many roles in different tissues. Several studies have implicated them, for example, in the adaptive responses to chronic hypoxia in the cardiovascular and endocrine systems. Hydrogen sulfide (H2S) was more recently discovered as an important signalling molecule involved in many functions, including O2 sensing. Since ion channels are emerging as an important family of target proteins for modulation by H2S, and both T-type Ca2+ channels and H2S are involved in cellular responses to hypoxia, we have investigated whether recombinant and native T-type Ca2+ channels are a target for modulation by H2S. Using patch-clamp electrophysiology, we demonstrate that the H2S donor, NaHS, selectively inhibits Cav3.2 T-type Ca2+ channels heterologously expressed in HEK293 cells, whilst Cav3.1 and Cav3.3 channels were unaffected. Sensitivity of Cav3.2 channels to H2S required the presence of the redox-sensitive extracellular residue H191, which is also required for tonic binding of Zn2+ to this channel. Chelation of Zn2+ using TPEN prevented channel inhibition by H2S. H2S also selectively inhibited native T-type channels (primarily Cav3.2) in sensory dorsal root ganglion neurons. Our data demonstrate a novel target for H2S regulation, the T-type Ca2+ channel Cav3.2. Results have important implications for the proposed pro-nociceptive effects of this gasotransmitter. Implications for the control of cellular responses to hypoxia await further study.

Chez les abeilles domestiques, les neurones à récepteurs olfactifs hébergés dans les antennes sont des neurones sensoriels primaires responsables de la détection des odeurs et des phéromones. L'information olfactive est ensuite acheminée par les nerfs antennaires jusqu'aux lobes antennaires qui constituent le premier étage d'intégration de l'information olfactive. Les abeilles butineuses sont exposées aux insecticides, notamment ceux de la classe des pyréthrinoïdes, qui sont utilisés pour la protection des plantes et la lutte contre les insectes considérés comme étant nuisibles.Nous avons caractérisé l'effet des pyréthrinoïdes sur les canaux sodiques activés par le potentiel (responsables des potentiels d'action) dans les deux premiers étages du système olfactif de l'abeille. Nos enregistrements électrophysiologiques en mode potentiel imposé dans les neurones à récepteurs olfactifs mis en culture révèlent que l'effet des pyréthrinoïdes de type I et II (notamment la tétraméthrine et la deltaméthrine) est amplifié par une intensification de l'activité électrique neuronale. Cette amplification survient notamment via le démasquage de canaux sodiques silencieux que nous avons également mis en évidence avec la toxine d'anémone de mer ATX-II. Le niveau maximal de canaux sodiques modifiés est atteint en quelques centaines de millisecondes. Dans les neurones centraux des lobes antennaires, cette amplification apparait très limitée voire absente avec les pyréthrinoïdes mais elle peut toutefois survenir en présence de l'alcaloïde végétal vératridine. Par ailleurs, dans ces neurones centraux, les pyréthrinoïdes semblent être à l’origine d’une accélération de l'inactivation lente des canaux sodiques auparavant décrite en présence de certains anesthésiques locaux. Les modifications différentielles observées dans les neurones périphériques et centraux pourraient être responsables des effets délétères des pyréthrinoïdes sur les capacités de perception, d'orientation et d'apprentissage de l'abeille domestique. / In domestic honeybees, the olfactory receptor neurons localized in the antennae are primary sensory neurons responsible for the detection of odor and pheromone compounds. The olfactory information is further conveyed to the antennal lobes by the antennal nerves. The antennal lobes are the first stage of integration of the olfactory information. Forager bees are exposed to insecticides, especially pyrethroids that are used for plant protection and eradication of pests.In the honeybee olfactory pathway, we investigated the effects of pyrethroids on the voltage-gated sodium channels (which underlie action potentials). Our patch-clamp recordings in the antennal olfactory receptor neurons maintained in cell culture reveal that the effects of type I and type II pyrethroids (e.g. tetramethrin and deltamethrin) are increased by an augmentation of neuronal electrical activity. The amplification of the effects of pyrethroids occurs as a result of the unmasking of silent sodium channels that we have also shown evidence for, with sea anemone toxin ATX-II. The maximal sodium channels modification takes place within few hundreds of milliseconds. In the central antennal lobe neurons, that amplification is rather limited or absent with pyrethroids but the plant alkaloid veratridine is able to induce such an amplification. Furthermore, in the latter cell type, pyrethroids cause an acceleration of the sodium channels slow inactivation. Such an effect has been previously reported for some local anesthetics. The differential actions of pyrethroids that we have observed in the peripheral and central neurons may be responsible for the impairment of learning performance, perception and disorientation exhibited by pyrethroid-exposed honeybees.

Wir haben im Hippocampus von transgenen Mäusen, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines Promotors für Nestin exprimieren, mutmaßliche Neuronale Vorläuferzellen identifiziert. Wir haben bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass Nestin-GFP exprimierende Vorläuferzellen in der subgranularen Zone des adulten Gyrus Dentatus sich in zwei Subpopulationen entsprechend ihrer morphologischen Eigenschaften einteilen lassen. Eine kleine, morphologisch unterscheidbare Population von Vorläuferzellen mit neuronalen Eigenschaften erhielt GABAergen, aber keinen glutamatergen Input, dies widerspiegelt die Situation während der Entwicklung des Gehirns. Außerdem haben wir ecto-nucleotidase NTPDase2 und functionelle P2X Rezeptoren in hippocampalen Vorläuferzellen identifiziert. Wir haben auch das Verhalten Nestin exprimierender Zellen bis zu 8 Wochen nach 30 minütiger Occlusion der mittleren cerebralen Arterie (MCAo)/reperfusion und im murinen experimentellen Glioblastom Modell untersucht. Neben den bereits publizierten Ergebnissen, die ich auch in meiner Doktorarbeit vorgestellt habe, habe ich die elektrophysiologischen Eigenschaften der Nestin-GFP-exprimierenden Zellen in der Amygdala und im CA 1 des Hippocampus untersucht. / Using transgenic mice that express green fluorescent protein (GFP) under control of the nestin promoter, the putative precursor cells were identified. We have previously shown that nestin-GFP expressing precursor cells in the adult subgranular zone of hippocampal dentate gyrus could be divided into two distinct subpopulations based on morphological criteria. A small, morphological distinct population of precursor cells with neuronal properties received GABAergic, but not glutamatergic input similar as in brain development. We identified ecto-nucleotidase NTPDase2 and functional P2X receptors at hippocampal progenitor cells. We also studied the fate of nestin-GFP-expressing cells up to 8 weeks after 30 mins occlusion of the middle cerebral artery (MCAo)/reperfusion and in murine experimental glioblastoma model. Except for the published results which was included in this PhD dissertation, I also studied the electrophysiology properties of nestin-GFP-expression cells in amygdala and in Ca1 of hippocampus.

La production hétérologue des protéines membranaires reste difficile, peut-être parce que l’insertion dans la membrane de la cellule hôte constitue une étape limitante de la production. Afin de tourner cette difficulté, deux modes de synthèse ont été envisagés: la synthèse de protéines dans un système a-cellulaire, en l’absence de membrane mais en présence de détergent, ou l’adressage forcé de la protéine vers les corps d’inclusion dans le cas d’une expression plus classique en bactérie entière. La réalisation des deux stratégies repose sur l’utilisation de protéines de fusion possédant une séquence d’entraînement en amont du gène d’intérêt, soit qu’elles améliorent la traduction du transcrit en limitant le repliement spatial de ce dernier, soit qu’elles favorisent la production de la protéine d’intérêt en corps d’inclusion. La porine OmpX et le peptide T7 ont été choisis en cas d’expression dans les systèmes bactériens. La protéine SUMO est utilisée pour la production dans un lysat eucaryote. Les différentes approches ont été testées sur la production de la pannexine1 humaine (Px1).Si les séquences d’entraînement OmpX et le peptide T7 sont correctement produites in vitro, aucune des deux, en revanche, ne favorise la production de la Px1. Seul l’entraîneur SUMO est efficace. En effet, nous avons observé que cette protéine augmente la production de la Px1 dans un lysat eucaryote de germe de blé. Par ailleurs OmpX, connue pour être largement produite in vivo dans les corps d’inclusion, n’entraîne pas la localisation de la Px1 dans ces structures. Contre toute attente, l’étiquette T7 dirige la Px1 dans les corps d’inclusion. L’étude électrophysiologique de la Px1 a donc été effectuée à partir de la protéine produite in vivo (T7his-Px1) après renaturation, ou produite sous forme soluble in vitro (his6-Px1) dans le lysat eucaryote. Dans le cas de la protéine T7his-Px1 renaturée, une activité canal qui rappelle celle qui est observée après expression dans l’ovocyte de Xénope, a été détectée en patch-clamp, mais dans trois cas seulement. Dans le cas de la protéine his6-Px1, aucune activité canal n’est clairement détectée. Dans une deuxième partie de ce travail on examine le rôle de la boucle périplasmique dans la sensibilité à la pression du MscL, un canal mécanosensible bactérien devenu un système modèle dans l’étude de la mécanosensibilité. Presque toutes les études fonctionnelles sur ce canal ont été réalisées sur le canal de E.coli, alors que la structure a été obtenue à partir de l’homologue de M. tuberculosis. Une étude fonctionnelle a montré que le MscL de M. tuberculosis est difficile à ouvrir : son ouverture requiert l’application d’une pression double de celle qui est nécessaire chez E.coli. Les deux homologues diffèrent principalement par la longueur de leur unique boucle périplasmique. De manière à examiner le rôle de la boucle, on a comparé l’activité du canal MscL de E.coli, celle du canal de M. tuberculosis et celle d’une protéine chimère constituée de la protéine de M. tuberculosis dans laquelle la boucle a été changée pour celle de la protéine de E.coli. De manière inattendue, nous avons constaté que les canaux de E.coli et de M. tuberculosis ont la même sensibilité à la pression. La protéine chimère n’avait pas d’activité canal. Si ce travail ne permet pas de conclure quant au rôle de la boucle, il montre sans ambigüité que contrairement à ce qui a été rapporté les canaux MscL de E.coli et de M. tuberculosis ne diffèrent pas sensiblement sur le plan fonctionnel / The production of heterologous membrane protein is notoriously difficult; this might be due to the fact that insertion of the protein in the membrane host is a limiting step. To by-pass this difficulty, two modes of synthesis were tested: 1) production in a cell-free system devoid of biological membrane but supplemented with detergent or liposomes, 2) production in bacteria, with targeting of the membrane protein to inclusion bodies. Both strategies were tested for the production of the human pannexin 1 channel (Px1). The gene coding the protein was fused with an “enhancer” sequence resulting in the addition of a peptide or short protein at the N terminus of the protein of interest. This enhancer sequence which is well produced in vitro or in vivo is supposed to facilitate the translation of the protein of interest. Three enhancer sequences were chosen: 1) the small porin OmpX of E. coli, which, in addition, should target the protein to inclusion bodies when the protein is expressed in bacteria 2) a peptide of phage T7 for expression in E.coli lysate or E.coli cells 3) the small protein SUMO for production in a wheat germ cell-free system. In a bacterial cell-free system, neither OmpX nor T7 promoted Px1 production. Px1 is only produced when the SUMO enhancer sequence is used in the wheat germ system. In bacteria, OmpX, known to form inclusions bodies did not promote the targeting of the fusion protein to inclusion bodies. Unexpectedly, the peptide T7 was able to do it.Px1 obtained from inclusion bodies (T7his-Px1) was renatured and reconstituted in liposomes. Similarly his6-Px1 produced in wheat germ system was reconstituted in liposomes. Both preparations were used for electrophysiological studies (patch-clamp and planar bilayers). With the refolded T7his-Px1, channel activity reminiscent of that observed with Px1 expressed in Xenope oocyte (Bao et al., 2004) could be detected, but only in three cases. In the case of his6-Px1, no clear channel activity could be observed. The second part of this work deals with the involvement of the periplasmic loop of the bacterial mechanosensitive channel MscL in its sensitivity to pressure. Mscl has become a model system for the investigation of mechanosensisity. Nearly all functional studies have been performed on MscL from E.coli while the structure of the protein has been obtained from the Mycobacterium tuberculosis homologue. In one functional study it was shown that MscL from M. tuberculosis is extremely difficult to open, gating at twice the pressure needed for E.coli MscL The periplasmic loop is the most variable sequence between the two homologues, being longer in E.coli than in M. tuberculosis. In order to assess the role of the periplamic loop in the sensitivity to pressure, we compared the activity of the E.coli and M. tuberculosis MscL and of a chimeric protein made of the M. tuberculosis protein in which the periplasmic loop has been exchanged for that of the E. coli channel. Unexpectedly, M. tuberculosis and E .coli MscL were observed to gate at a similar applied pressure. The chimeric protein had no functional activity. In conclusion, this study does not allow any conclusion as to the role of the loop in the sensitivity to pressure, but it shows clearly that, in contrast to the results of a previous study, there is no functional difference between E. coli and M. tuberculosis MscL.