Le traitement de l'information sensorielle par le cortex cérébral requiert l'activation harmonieuse de micro-circuits neuronaux excitateurs et inhibiteurs interconnectés, ciblant les neurones pyramidaux de couche 5. Ces derniers élaborent les signaux de sortie corticaux et reçoivent un ratio de 20% d'excitation (E) et 80% d'inhibition (I). La dérégulation de cette balance E-I ou du système sérotoninergique conduit à des neuropathologies telles la dépression et la schizophrénie mais les interrelations entre la sérotonine et la balance E-I sont inconnues. Nous avons montré que la 5-HT endogène module la balance E-I en fonction du type de récepteur 5-HT recruté (1A, 2A, 3, 4, 7) et de sa localisation spécifique dans la colonne corticale. Ces données électrophysiologiques constituent la première évidence pour une action modulatrice fine de la sérotonine corticale sur la balance E-I et révèle la ségrégation fonctionnelle des récepteurs 5-HT dans les réseaux de neurones sensoriels.

Les canaux sensibles à l'ATP (KATP) résultent de l'association unique d'une protéine ABC (le récepteur des sulfonylurées, SUR) et d'un canal potassique rectifiant entrant (Kir6.x). Suite à la liaison de divers effecteurs (nucléotides, molécules pharmacologiques), SUR module l'activité de Kir6.x. Dans l'organisme, les canaux KATP lient le niveau énergétique de la cellule au potentiel membranaire. De ce fait, leur implication dans diverses fonctions physiologiques telles que la sécrétion pancréatique d'insuline ou le contrôle du tonus vasculaire en fait des cibles thérapeutiques. Ainsi, dans le cadre d'une collaboration, nous avons testé des composés (dérivés benzothiazine) sur le canal KATP. Quatre d'entre eux se sont avérés être des ouvreurs des canaux KATP. Nous avons également exploré l'effet de deux insecticides, l'amitraz et le diflubenzuron sur le canal KATP. En outre, dans une optique de généralisation du concept d'Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR) mis au point par l'équipe, nous avons élaboré des biocapteurs reposant sur l'assemblage de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et Kir6.2. Cette association, inspirée par le canal KATP, est réalisée de telle manière que la fixation d'un ligand sur le GPCR entraîne la modulation de l'activité de Kir6.2. L'ingénierie moléculaire nous a permis de fusionner Kir6.2 aux récepteurs β2 adrénergique, dopaminergique D3, cannabinoïde 1 (CB1), des CC-chimiokines 2 et à l'opsine. La méthode de double-microélectrodes nous a permis d'identifier trois ICCR fonctionnels basés sur les récepteurs β2, D3 et CB1. Ces biocapteurs présentent des applications dans le cadre du criblage haut débit, la caractérisation fonctionnelle des GPCR ou la compréhension de la régulation de l'activité de Kir6.2.

Les érythrocytes sont un modèle pour l'étude du transport des ions, des nutriments et de divers solutés au travers de la membrane cellulaire. L'identité moléculaire, la régulation et rôle physiologique des canaux ioniques sont pas clairement établis malgré leur implication évidente dans des processus physiologiques comme la sénescence ou pathologiques comme la drépanocytose ou le paludisme. Le présent travail de thèse a fait appel à la technique du 'patch-clamp' et à diverses méthodes biochimiques pour démontrer que: 1/ La diversité des courants anioniques enregistrés au travers de la membrane de l'érythrocyte humain sain, ou infecté par P. falciparum, correspond à différents états d'activité d'un type unique de canal 'maxi-anionique' comportant des niveaux de conductance, des modes d'activation et des propriétés pharmacologiques variables selon les conditions physico-chimiques. 2/ L'identité moléculaire de ce canal anionique est de type 'voltage dependent anion channel (VDAC)'. Il est l'une des trois composantes d'un récepteur 'peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR)' présent dans la membrane érythrocytaire. 3/ Le canal VDAC, généralement peu actif correspond, lorsqu'il est activé, à la nouvelle voie de perméation 'new permeability pathway' décrite dans la membrane de l'érythrocyte infecté par P. falciparum. L'activation résulte alors en partie de l'insertion dans la membrane érythrocytaire de protéines plasmodiales de type 'Ring-infected Erythrocyte Surface Antigen (RESA). Ce travail contribue à l'élucidation de la nature exacte des canaux ioniques présents dans la membrane érythrocytaire et avance une hypothèse unificatrice quant au rôle joué par ces canaux.

Le patch-clamp planaire, technique utilisant des microtrous structurés sur un substrat plan, permet d'envisager la parallélisation des mesures de courants ioniques sur cellules individualisées, répondant ainsi à une demande des industries pharmaceutiques. Dans un premier temps, nous avons élaboré un démonstrateur de laboratoire permettant de tester des puces en silicium et démontrer leur potentiel pour l'enregistrement des courants ioniques. Nous avons ensuite procédé à l'amélioration de la sensibilité et des performances de la puce en optimisant l'interaction de la cellule avec les paramètres géométriques et physico-chimiques de la puce et en réduisant la capacité de la puce. Cette démarche a permis de concevoir une puce offrant 80 % de scellements exploitables et les validations électrophysiologiques présentées témoignent de la robustesse, de la fiabilité et de la sensibilité du système.

No description available.

No description available.

Le but de ce mémoire est de valider la microscopie électro-optique Pockels comme méthode de mesure et de cartographie de champ électrique aux échelles micro et nanométriques. Une première partie est dédiée à la description de l'instrumentation d'imagerie mise en jeu. Nous développons ensuite son application en physique et biophysique. Une étude de couches minces monocristallines de 2-methyl-4-nitroaniline (MNA) a permis de sonder localement la variation de champ électrique appliqué, mais aussi d'étudier l'orientation des axes optiques de ce cristal dans l'espace. A l'échelle sub-longueur d'onde nous avons pu isoler la modulation électro-optique de la diffusion de lumière associée à une nanoparticule isolée de KTiOPO4 (KTP) d'une taille de 150nm. La dépendance polaire du signal Pockels sur la polarisation lumineuse incidente a permis de prédire l'orientation de la maille cristalline du KTP dans l'espace. De telles sondes de champs électriques nanométriques peuvent avoir de nombreuses applications en nano-photonique. Dans le cas d'entité biologiques comme des neurones, la propagation de l'information est assurée par celle d'un champ électrique dans les membranes plasmiques. Dans une première étape, nous nous sommes intéressés à l'étude de bicouches artificielles dopées par un colorant non-linéaire, le DI-8-ANEPPS. Un signal électro-optique Pockels y a été mesuré pour la première fois. La caractérisation de l'insertion du colorant dans la membrane a été aussi discutée. La grande sensibilité à la mesure d'un champ électrique assurée par l'interféromètre permet d'envisager des possibilités d'applications dans des cellules vivantes. Des expériences menées sur des cellules de type PC12 ont montré l'existence d'un signal optique qui est associé à la distribution spatiale du champ électrique. L'ensemble de ces travaux montrent que la microscopie électro-optique s'avère constituer un outil important pour la physique et biophysique.

Le DEET (N, N-diéthyl-m-toluamide), est connu comme le répulsif le plus utilisé au monde. Bien qu'il soit efficace contre un large groupe d'arthropodes, son mode d'action exact et sa cible moléculaire ne sont pas encore connus précisément. Grâce à l'utilisation des techniques d'électrophysiologie (patch-clamp et oil-gap), d'imagerie calcique et biochimique, nous avons étudié le mode d'action du DEET sur des cellules neurosécrétrices identifiées, les DUM neurones de la blatte Periplaneta americana. Le DEET, à forte concentration, inhibe l'activité de l'acétylcholinestérase (AChE) au niveau du DUM neurone. A faible concentration, il induit une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire via l'activation des récepteurs cholinergiques de type muscariniques (mAChRs). Dans un deuxième temps, les interactions synergiques entre le DEET et le propoxur, un carbamate connu pour inhiber l'AChE, ont été étudiées. Les résultats ont révélé que les mAChRs, correspondent bien à une nouvelle cible potentielle pour le DEET et qu'ils sont impliqués dans l'effet synergique. Le DEET, à faible et à forte concentration, agit sur des sites allostériques positifs et négatifs des mAChRs respectivement. L'action du DEET sur le site allostérique positif des mAChRs est responsable de l'effet synergique via une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire qui potentialise l'effet anti-AChE du propoxur. L'utilisation d'outils pharmacologiques sélectifs a permis l'identification de la voie de signalisation intracellulaire (PLC, PI-PLC, CaMKinase II, récepteurs IP3) impliquée dans l'effet synergique du propoxur. Les résultats présentés dans ce mémoire vont contribuer au développement de nouvelles stratégies basées sur l'utilisation de combinaisons d'insecticides de familles chimiques différentes afin de réduire les doses des traitements tout en augmentant l'efficacité.

Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années, plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les mécanismes. Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette v molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur l’interaction CaM-KCa3.1. Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces. / Airway epithelial cells are the site of Cl- secretion through CFTR. Cystic fibrosis is a fatal genetic disease caused by mutations in CFTR. The most frequent mutation in North America (∆F508) results in impaired maturation and altered channel gating of the protein. In the last years, several small molecules were identified by high throughput screening that could restore mutated CFTR function. Compounds addressing CFTR gating defects are referred to as potentiators. The basolateral K+ channel KCa3.1 has been documented to play a prominent role in establishing a suitable driving force for CFTR-mediated Clsecretion in airway epithelial cells. It has been shown, for example, that the application of 1-EBIO on T84 monolayers results in a sustained increase of Clsecretion and that this current can be reversed by application of CTX, a KCa3.1 inhibitor (Devor et al., 1996). Thus, in a global approach of transepithelial transport, the research for physiologically relevant CFTR potentiators should also consider their effects on the KCa3.1 channel. Electrophysiological patch clamp measurements and channel structural modification by site directed mutagenesis were used to characterize the action of CFTR potentiators on KCa3.1 and study their molecular mode of action. In this work we present results on the effects on KCa3.1 of several CFTR potentiators of different structures. We observed that the CFTR potentiators genistein, curcumin, SF-03 and VRT-532 could inhibit KCa3.1 activity at concentrations known to activate CFTR. Our results suggest that SF- 03 could act indirectly on KCa3.1 through a mechanism involving an accessory protein. Curcumin would also have an indirect inhibitory effect, probably mediated by the plasma membrane, as documented for other ion channels. A detailed study of VRT-532 revealed that this molecule has access to its binding site in a state independent manner, and is poorly effective on the V282G mutant of KCa3.1, which is constitutively active. These results suggest that VRT-532 could act through the CaM/KCa3.1 complex and require the presence of Ca2+ to inhibit channel activity. In contrast, CBIQ, another CFTR potentiator, succeeded to activate KCa3.1. Our results in single channel show that CBIQ vii destabilizes a non conducting state of the channel. We also showed that this molecule increases the apparent Ca2+ affinity as well as the channel open probability, even in saturating Ca2+ conditions. Experiences in which Ba2+ was used as a probe were also performed to determine if the action mechanism of CBIQ involves an effect on the selectivity filter. Our results showed that Ba2+ could displace CBIQ from its interacting site, suggesting that the increases in channel activity induced by CBIQ could result from a change in the energetics of the channel at the level of the selectivity filter. On the basis of our results, we conclude that CBIQ, a CFTR potentiator, could activate KCa3.1 by destabilizing a non conducting state of the channel, probably through an action near the selectivity filter region. Also, CFTR potentiators having an inhibitory effect on KCa3.1 are likely to act through the plasmic membrane, the CaM/KCa3.1 interaction or an accessory protein of the channel. In a perspective of future treatments for CF, our results indicate that CBIQ could be an efficient potentiator since this product stimulates KCa3.1 as well as CFTR. Conversly, the VRT-532 and SF-03 could be less efficient than on CFTR alone, due to their inhibition of KCa3.1.

Les canaux potassiques dépendants du voltage sont formés de quatre sous-unités, chacune possédant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquième et le sixième segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est nécessaire de transférer l'énergie du senseur du voltage (généré par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mécanisme exact de ce couplage électromécanique est encore sous étude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette étude est de déterminer l'influence de la flexibilité du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribuées dans des positions différentes. Elles sont responsables de la flexibilité des hélices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conservées pour tous les canaux potassiques dépendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagènes dirigé, la glycine a été remplacée dans chacune de ces différentes positions par une alanine et dans une deuxième étape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hélice). Pour étudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqué la technique de « patch clamp » pour déterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le « cut-open oocyte voltage-clamp », nous avons étudié les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant “gating”) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les données ont montré qu’en réduisant la flexibilité dans le S45L, il faut avoir plus d'énergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggère que le mouvement du senseur est indépendant du pore pendant l'ouverture du canal. / Voltage-gated potassium channels are formed of four subunits, each one with six transmembrane segments (S1-S6) and a loop (p-loop) between S5 and S6 at the level of the pore. It is known that the voltage sensitive segment (S1-S4) undergoes a movement upon membrane potential changes. To open the channel, it is necessary to transfer the energy of the voltage sensor (generated by the displacement of the positive charges of S4) to the pore. The exact mechanism of this “electromechanical coupling” is still under investigation. The voltage sensor and pore are physically linked by the S4-S5 linker (S45L). The aim of this study is to determine the influence of S45L flexibility on the coupling process. In the S45L, three glycines are distributed at different positions and are responsible for the flexibility of the alpha-helix. These glycines (but not their exact position) are conserved within the potassium voltage-gated ion channels. The glycines were each replaced by an alanine using point mutagenesis. In a second step, a proline was introduced at the position in order to introduce a break in the helix. To study the behaviour of channels in this new conformation, we used the patch clamp technique to determine the effects during the pore opening (ionic current). With the cut-open voltage-clamp we determined the effects on voltage sensor movement (gating current) as well as the temporal correlation with the pore opening (ionic current). The data showed that when the flexibility of the S45L is reduced, the channel needs more energy to open. Exchange with proline suggests that the movement of the sensor is independent of pore opening.