Le virus Nipah (NiV) est un paramyxovirus zoonotique du genre Henipavirus, qui a émergé en 1998. NiV infecte l'homme et cause des troubles respiratoires et des encéphalites avec une forte létalité. A l’inverse, chez les hôtes naturels de NiV, les chauves-souris de la famille des Pteropodidae, l’infection est asymptomatique. Cependant, les mécanismes permettant aux Pteropodidae de contrôler l’infection sont inconnus à ce jour. NiV produit des protéines non structurales, V, W et C, qui sont des facteurs de virulence. V, W et C inhibent les voies de l’interféron de type 1. De plus, la protéine W inhibe la production de chimiokines in vitro et module la réponse inflammatoire in vivo, mais son mécanisme d’action reste inconnu. La voie NF-κB étant le principal régulateur de la réponse inflammatoire, nous avons émis l’hypothèse que W pourrait moduler la voie NF-κB. Nous avons démontré que la protéine W inhibe l'activation de la voie canonique de NF-κB induite par TNFα et IL-1β, effet pour lequel sa région C-terminale spécifique est nécessaire. Nous avons également identifié quels signaux d’import et d’export nucléaires de W sont nécessaires à son effet inhibiteur et ainsi mis en évidence l’importance du trafic nucléo-cytoplasmique de W pour l’inhibition de NF-κB. L’étude des interactions de W avec les protéines cellulaires nous a permis d’identifier un partenaire prometteur connu pour son rôle dans le rétrocontrôle négatif de NF-κB. Enfin, le rôle de W dans l'inhibition de la voie NF-κB a été démontré pendant l'infection par NiV. Les résultats obtenus ouvrent la voie à la compréhension du mécanisme par lequel W module la réponse inflammatoire. Finalement, afin de mieux comprendre le contrôle de l’infection de NiV par son hôte naturel, nous avons généré des lignées cellulaires primaires et immortalisées de chauve-souris Pteropus giganteus. Ces cellules devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes par lesquels ces chauves-souris contrôlent l’infection virale. / Nipah virus (NiV), from Henipavirus genus, is a zoonotic paramyxovirus, which emerged in 1998. In humans, it causes acute respiratory distress and encephalitis with a high lethality. Conversely, the natural hosts of NiV, bats from the Pteropodidae family, are asymptomatic. The mechanisms by which the Pteropodidae control infection are unknown to date. NiV produces non-structural proteins, V, W and C, which are virulence factors. V, W and C inhibit the type 1 interferon pathways. Moreover, W inhibits the production of chemokines in vitro and modulates the inflammatory response in vivo, but its mechanism remains unknown. The NF-κB pathway being the main regulator of the inflammatory response, we hypothesized that W could modulate the NF-κB pathway. We demonstrated that protein W inhibits the activation of the NF-κB canonical pathway induced by TNFα and IL-1β. The specific C-terminal region of W is necessary for this effect. We have also identified which nuclear import and export signals of W are necessary for its inhibitory effect and thus highlight the importance of the nucleo-cytoplasmic trafficking of W for the inhibition of NF-κB. The study of the interactions of W with the cellular proteins allowed us to identify a promising partner known for its role in the negative feedback of NF-κB. Finally, the role of W in the inhibition of the NF-κB pathway was demonstrated during the infection with NiV. The results obtained open the way to understanding the mechanism by which W modulates the inflammatory response. Finally, to better understand the control of the infection of NiV by its natural host, we generated primary and immortalized cell lines of Pteropus giganteus bat. These cells should provide a better understanding of the mechanisms by which these bats control viral infection.

Darwin a révélé au monde que les espèces vivantes ne cessent jamais d’évoluer, mais les mécanismes moléculaires de cette évolution restent le sujet de recherches intenses. La biologie systémique propose que les relations entre génotype, environnement et phénotype soient sous-tendues par un ensemble de réseaux moléculaires dynamiques au sein de la cellule, mais l’organisation de ces réseaux demeure mystérieuse. En combinant des concepts établis en biologie évolutive et systémique avec la cartographie d’interactions protéiques et l’étude des méthodologies d’annotation de génomes, j’ai développé de nouvelles approches bioinformatiques qui ont en partie dévoilé la composition et l’organisation des systèmes cellulaires de trois organismes eucaryotes : la levure de boulanger, le nématode Caenorhabditis elegans et la plante Arabidopsis thaliana. L’analyse de ces systèmes m’a conduit à proposer des hypothèses sur les principes évolutifs des systèmes biologiques. En premier lieu, je propose une théorie selon laquelle la traduction fortuite de régions intergéniques produirait des peptides sur lesquels la sélection naturelle agirait pour aboutir occasionnellement à la création de protéines de novo. De plus, je montre que l’évolution de protéines apparues par duplication de gènes est corrélée avec celle de leurs profils d’interactions. Enfin, j’ai mis en évidence des signatures de la co-évolution ancestrale hôte-pathogène dans l’organisation topologique du réseau d‘interactions entre protéines de l’hôte. Mes travaux confortent l’hypothèse que les systèmes moléculaires évoluent, eux aussi, de manière darwinienne. / Darwin exposed to the world that living species continuously evolve. Yet the molecular mechanisms of evolution remain under intense research. Systems biology proposes that dynamic molecular networks underlie relationships between genotype, environment and phenotype, but the organization of these networks is mysterious. Combining established concepts from evolutionary and systems biology with protein interaction mapping and the study of genome annotation methodologies, I have developed new bioinformatics approaches that partially unveiled the composition and organization of cellular systems for three eukaryotic organisms: the baker’s yeast, the nematode Caenorhabditis elegans and the plant Arabidopsis thaliana. My analyses led to insights into the evolution of biological systems. First, I propose that the translation of peptides from intergenic regions could lead to de novo birth of new protein-coding genes. Second, I show that the evolution of proteins originating from gene duplications and of their physical interaction repertoires are tightly interrelated. Lastly, I uncover signatures of the ancestral host-pathogen co-evolution in the topology of a host protein interaction network. My PhD work supports the thesis that molecular systems also evolve in a Darwinian fashion.

Détection et quantification de bactéries à faible taux par SPRi Résumé: Le protocole standard pour le diagnostic des bactéries dans le domaine médical et agro-alimentaire reste la culture microbienne, qui prend plusieurs jours pour identifier l'agent pathogène. Cependant, ces temps de latence ne sont pas compatibles avec l'urgence d'analyser rapidement la présence de bactéries pathogènes. Il ya un besoin croissant de vouloir développer de nouveaux outils pour identifier les bactéries pathogènes en un temps plus court. Afin atteindre cet objectif, la technologie de l'imagerie par Résonance des Plasmons de Surface (SPRi) a été utilisée avec succès pour la détection spécifique durant leur croissance des populations bactériennes en utilisant des protéines et/ou des anticorps comme molécule de bio reconnaissance des surfaces bactériennes. Ainsi, la détection spécifique de un à plusieurs milliers de pathogènes/ml peut être réalisé en quelques heures seulement. Dans le présent travail, plusieurs souches bactériennes ont été utilisées comme modèle : Streptococcus pneumoniae R6, Escherichia coli K12 ; ainsi que des agents pathogènes réels (Salmonella enteritidis) apportant la preuve que cette méthode peut être élargie à d'autres souches. Les résultats peuvent être quantitatifs par l'établissement d'une courbe d'étalonnage, permettant ainsi de remonter à la concentration initiale d'un échantillon contaminé. La stratégie développée au cours de ce travail se base sur le couplage simultané de la culture bactérienne et de la détection/identification spécifique, en utilisant l'imagerie SPR. Mots clés en français : Imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi), Streptococcus pneumoniae, E.coli K12, Salmonella enteritidis, croissance bactérienne, interactions, détection, capture, diagnostic, agro-alimentaire, pathogènes. / Low Level Bacteria Detection and Quantification using SPRi Abstract: The standard protocol for bacterial diagnosis in the medical and agronomic fields remains microbial culture, which takes several days to identify the pathogen. However, these time lags are not compatible with the urgency to rapidly analyse the presence of pathogenic bacteria. There is a strong need to develop new tools for identifying pathogenic bacteria in a shorter time. To achieve this goal, Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) technology has been successfully used for the specific detection of bacterial populations during their growth, using proteins and/or antibodies as bio-recognition molecules targeting bacterial surfaces. Thus, the specific detection of one to thousand pathogens/ml could be achieved within few hours. Several bacterial strains were used as models in this work: Streptococcus pneumoniae R6, Escherichia coli K12, as well as a real pathogen (Salmonella enteritidis) providing the proof that this method can be enlarged to other strains. The results can be quantitative by establishing a calibration curve, allowing extrapolation of the initial concentration of a contaminated sample. The strategy developed in this work, is based on the simultaneous coupling of the bacterial enrichment with the specific detection and identification, using the SPR imaging technique. Mots clés en anglais : Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi), Streptococcus pneumoniae, E.coli K12, Salmonella enteritidis, bacterial growth, interactions, detection, capture, diagnosis, agri-food, pathogens.

Pseudomonas aeruginosa, une bactérie à Gram négatif responsable d'infections nosocomiales, possède de nombreux facteurs de virulence lui permettant d'infecter ses hôtes. En particulier, le Système de Sécrétion de Type III (SST3) lui permet d'injecter des effecteurs directement dans le cytoplasme de la cellule cible eucaryote. Durant cette thèse, deux protéines du SST3 de P. aeruginosa ont été étudiées : l'ATPase PscN et la protéine ExsB. Plusieurs approches ont été utilisées afin d'étudier l'ATPase PscN, indispensable à l'activité du SST3. Des mutations ponctuelles réalisées dans PscN conduisent à des souches de P. aeruginosa non cytotoxiques, et cet effet est dominant négatif. Une autre approche a permis l'obtention de fractions partiellement purifiées de l'ATPase PscN active, sous forme de grands complexes visualisés en microscopie électronique. Ces fractions contiennent également d'autres protéines du SST3, qui pourraient être des partenaires de PscN. La protéine ExsB a été caractérisée pour la première fois. Après avoir vérifié son expression chez P. aeruginosa, son association à la membrane externe de la bactérie a été démontrée. Son rôle a ensuite été étudié par une analyse du phénotype d'une souche de P. aeruginosa dépourvue du gène exsB. Nous n'avons pas identifié d'activité de ExsB dans la régulation du SST3. Après avoir constaté l'implication de ExsB dans la virulence de la bactérie dans des modèles d'infections aiguës chez les animaux, son rôle dans l'activité du SST3 a été établi. Nous avons enfin pu montrer que ExsB a une activité de pilotine, car elle participe à l'assemblage de la sécrétine, le composant de la membrane externe du SST3. / Pseudomonas aeruginosa, a Gram negative bacterium responsible for nosocomial infections, exhibits numerous virulence factors to infect its hosts. In particular, the Type III Secretion System (T3SS) allows the injection of effectors directly into the host cell cytoplasm. This work focuses on the study of two proteins from the T3SS of P. aeruginosa: the ATPase PscN and the ExsB protein. Several approaches were used to study the ATPase PscN, an enzyme essential for T3SS activity. Site-directed mutations, made on PscN, lead to non cytotoxic strains, and this effect is dominant negative. Another approach allowed the partial purification of active PscN, visualized as large complexes by electron microscopy. These partially purified samples also contain other T3SS proteins, which could interact with PscN. The ExsB protein was characterized for the first time. After checking its expression in P. aeruginosa, its association with the outer membrane was shown. The phenotypic analysis of a strain lacking exsB gene gave insights into the role of this protein. We did not identified any function of ExsB in the T3SS regulation. After showing the involvement of ExsB in the bacterial virulence during acute animal infections, ExsB role in T3SS activity was established. Finally, we showed that ExsB has a pilotin activity as it participates in the assembly of the secretin, the outer membrane component of T3SS.

La culture de l’aubergine est confrontée au flétrissement bactérien, maladie causée par le complexe d’espèces Ralstonia solanacearum. La résistance variétale est la méthode la plus efficace pour contrôler cette maladie. Un QTL majeur (ERs1) a précédemment été cartographié dans une population de lignées recombinantes (RIL) issue du croisement aubergine sensible (S) MM738 × aubergine résistante (R) AG91-25. Initialement, ERs1 a été détecté avec 3 souches du phylotype I, alors qu’il est contourné par la souche PSS4 de ce même phylotype. Les objectifs de cette thèse étaient (i) de préciser la position d’ERs1 et de définir son spectre d’action, (ii) d’identifier d’autres QTLs contrôlant les souches virulentes sur AG91-25, et (iii) d’introgresser certains de ces QTLs dans des cultivars S. Pour cela, 2 populations d'haploïdes doublés (HD), MM152 (R) × MM738 (S) et EG203 (R) × MM738 (S), ont été créées. La population RIL a été phénotypée avec 4 souches supplémentaires appartenant aux phylotypes I, IIA, IIB et III, tandis que les populations HD l’ont été avec les souches virulentes PSS4 et R3598. Les analyses de cartographie génétique ont confirmé l’existence d’ERs1 (renommé EBWR9), défini sa position sur le chromosome (chr) 9 et validé son contrôle spécifique de 3 souches du phylotype I. EBWR2 et EBWR14, 2 autres QTLs à large spectre, ont été détectés sur les chr 2 et 5. Les analyses QTL ont mis en évidence un système de résistance de type polygénique chez EG203. Le transfert de la résistance dans 2 cultivars locaux a été initié et a permis l’introgression d’EBWR9 et d’EBWR2. Ces résultats ouvrent des perspectives quant à la création de variétés à large spectre de résistance. / Eggplant cultivation is confronted by the bacterial wilt disease caused by the Ralstonia solanacearum species complex. Breeding resistant cultivars is the most effective strategy to control the disease but is limited by the pathogen’s extensive genetic diversity. A major QTL (ERs1) was previously mapped in a recombinant inbred lines (RIL) population from the cross of susceptible (S) MM738 × resistant (R) AG91-25 lines. ERs1 was originally found to control 3 strains from phylotype I, while being ineffective against the strain PSS4 from the same phylotype. The objectives of this thesis was to (i) clarify the position of ERs1 and define its spectrum of action, (ii) found other QTLs, promptly to control virulent strains on AG91-25 and (iii) introgress some of the QTLs into two S cultivars. For this purpose, the new doubled haploid (DH) populations MM152 (R) × MM738 (S) and EG203 (R) × MM738 (S) were created. The RIL population was phenotyped with 4 additional RSSC strains belonging to phylotypes I, IIA, IIB and III and the DH populations were phenotyped with virulent strains PSS4 and R3598. QTL mapping confirmed the existence of ERs1 (renamed EBWR9), defined its position on chromosome (chr) 9 and validated its specific control of 3 phylotype I strains. EBWR2 and EBWR14, 2 broad-spectrum resistance QTLs, were detected on chr 2 and 5. QTL analysis reveals a polygenic system of resistance in EG203. The transfer of resistance into 2 local cultivars was initiated and allowed the introgression of EBWR9 and EBWR2 QTLs through a backcross scheme. These results offer perspectives to breed broad-spectrum R cultivars.

Afin de déjouer les défenses immunitaires de l’hôte et créer les niches nécessaires à leur survie, les bactéries pathogènes mettent on œuvre de nombreux mécanismes ciblant les voies de signalisation de la cellule hôte. L’un de ces mécanismes repose sur la sécrétion de protéines bactériennes dans les cellules cibles afin de moduler directement leurs réseaux de signalisation. Cependant, les signaux, les senseurs et les effecteurs impliqués dans ces régulations sont encore peu ou mal connus. La détection de l’environnement dans la cellule hôte lors de l'infection est l’élément clé d’une réponse adaptée, et les systèmes de signalisation basés sur les mécanismes de phosphorylation sont indispensables à l'adaptation hôte-pathogène. L’aspect innovant de ce projet repose sur l’étude du rôle des Ser/Thr kinases et phosphatases sécrétées lors des interactions hôte-pathogène, modifiant ainsi la réponse globale de l’hôte durant l’infection. Pendant ma thèse, j’ai tout d’abord étudié le rôle d’une nouvelle protéine kinase bactérienne identifiée chez Coxiella burnetii, nommée CstK (Coxiella serine threonine Kinase). C. burnetii, l’agent étiologique de la zoonose appelée fièvre Q, modifie les défenses de la cellule hôte, permettant sa réplication dans des vacuoles spécifiques à l’intérieur de la cellule hôte. Par ailleurs, la sécrétion d’un grand nombre d’effecteurs bactériens est indispensable au détournement du phagosome par Coxiella. Nous ainsi avons démontré que cette potentielle protéine kinase, identifiée in silico dans le génome de C. burnetii, est capable de s’autophosphoryler et par conséquent possède une activité kinase. De plus, nous avons identifié différentes protéines spécifiques de la cellule hôte interagissant avec CstK à l'aide du modèle amibe Dictyostelium discoideum, un phagocyte professionnel eucaryote, permettant des études génétiques et biochimiques. Dans la deuxième partie de mon projet, je me suis intéressée au rôle d’une probable protéine sécrétée, la tyrosine phosphatase PtpA, durant l’infection par Staphylococcus aureus. Bien connue dans les hôpitaux, où elle est responsable de nombreuses maladies nosocomiales, cette bactérie possède un grand nombre de facteurs de virulence, responsables d’infections variées, et l’apparition exponentielle de souches multi-résistantes en font un problème majeur. Ce pathogène est capable d’envahir et de persister dans un grand nombre de types cellulaires différents chez l’Homme, en sécrétant des protéines effectrices qui vont moduler les réponses cellulaires. Nous avons démontré que PtpA était sécrétée durant la phase de croissance bactérienne, et pu déterminer que PtpA possédait une activité tyrosine phosphatase, régulée par la tyrosine kinase CapA1B2 de S. aureus. Enfin, en utilisant le modèle D. discoideum, nous avons pu identifier des protéines de l’hôte qui interagissent avec PtpA, mais leur rôle dans l’infection n’est pas encore connu. / Bacterial pathogens have developed diverse strategies towards host signalling pathways, in order to subvert the immune response and/or create permissive niches for their survival. One such strategy is based on the secretion of bacterial signalling proteins into the target host cells, thereby directly modulating the status of host signalling networks. Because the mechanisms involved are largely intractable to most in vivo analyses, very little is known about the signals, sensors, and effectors mediating these adaptations. Sensing the host environment is a key component to execute appropriate developmental programs, and the eukaryotic-like phosphosignaling systems in prokaryotes are emerging as equally important regulatory systems as the well-known eukaryotic systems, but the study of their functions is still in its infancy. The innovative aspect of this project resides in the study of the emerging role of secreted Ser/Thr kinases and phosphatases in the control of host-pathogen interactions thus modifying the global host response during infection. During my thesis, I first investigated the role of a novel bacterial protein kinase identified in Coxiella burnetii that we named CstK (Coxiella serine threonine Kinase). C. burnetii, the etiological agent of the emerging zoonosis Q fever, subverts host cell defenses, permitting its intracellular replication in specialized vacuoles within host cells. Secretion of a large number of bacterial effectors into host cell is absolutely required for rerouting the Coxiella phagosome. We demonstrated that this putative protein kinase identified by in silico analysis of the C. burnetii genome is able to autophosphorylate and undergoes in vitro phosphorylation. Moreover, we identified specific host cell proteins interacting with CstK, by the use of the model amoeba Dictyostelium discoideum, an eukaryotic professional phagocyte amenable to genetic and biochemical studies. In the second part of my project, I was interested in the role of a putative secreted protein tyrosine phosphatase (PtpA) during Staphylococcus aureus infection. Well-known in hospital-acquired diseases, this bacteria produces multiple virulence factors that lead to various severe diseases, and the increase of multi-resistant strains is a major concern. This pathogen has the ability to invade and persist in a number of different human host cell types, secreting effector proteins to modulate cellular responses. Here we demonstrated that PtpA is secreted during the bacterial growth. We also determined that PtpA presents a tyrosine phosphatase activity that is regulated by the tyrosine protein kinase CapA1B2 of S. aureus. At last, using the D. discoideum model, we identified some host proteins that interact with PtpA, but their link with infection still remain to be studied.

Les gibbérellines (GA) sont des phytohormones qui régulent divers aspects du développement en réponse aux signaux endogènes et exogènes à la plante. Ainsi face à un stress, les niveaux de GA sont finement contrôlés, permettant une croissance adaptée aux contraintes environnementales. Au niveau moléculaire, les GA stimulent la croissance de la plante en s’opposant aux protéines DELLAs (DELLAs), facteurs nucléaires qui inhibent la croissance. Les DELLAs présentent plusieurs caractéristiques fonctionnelles notables, une activité transactivatrice et la capacité d’interagir avec d’autres protéines régulatrices, comme les répresseurs de la signalisation Jasmonate (JA), JA ZIM-domain (JAZ). Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour cinq DELLAs possédant des fonctions redondantes et spécifiques. Le but de mon travail de thèse a été la caractérisation de la fonction biologique d’une DELLA, RGA-LIKE3 (RGL3). J’ai pu montrer que RGL3 modifie la défense de la plante face à des stresses biotiques. / The phytohormones gibberellins (GA) regulate major aspects of plant growth in response to endogenous and environmental signals. Upon the perception of stress, the levels of bioactive GA are adjusted, hence allowing a flexible growth response to environmental variability. At a molecular level, GA promote growth by stimulating the degradation of the growth repressing DELLA proteins. DELLAs are versatile nuclear proteins with several remarkable features, such as transactivation activity and protein–protein interaction capacities. Thus DELLAs interact with a series of highly divergent proteins, including different transcription factor families, but also the Jasmonate (JA) ZIM-domain (JAZ) proteins, repressors of JA signaling. The aim of this thesis work consisted in the characterization of the biological function of the DELLA RGA-LIKE3. I could show that RGL3 modulates plant defense responses against biotic stresses.

Un mini-transposon qui permet une mutagénèse stable et non marquée a été modifié pour permettre l’expression de gènes chez les mycoplasmes. Cet outil a tout d’abord été utilisé pour le développement de mycoplasmes fluorescents. Pour ce faire, les protéines mCherry, mKO2 et mNeonGreen ont été insérées dans le chromosome de deux espèces de mycoplasmes phylogénétiquement distants : Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) et Mycoplasma bovis (M. bovis). Cette insertion a permis l’observation sans précédent de colonies fluorescentes vertes et rouges chez les deux espèces et ce, sans toxicité apparente. De plus, des niveaux de fluorescence équivalents ont été quantifiés par cytométrie en flux chez les deux espèces, ce qui suggère que l’outil développé peut être largement utilisé chez les mycoplasmes. Ces mycoplasmes fluorescents ont ensuite été utilisés pour effectuer des études d’adhésion, d’invasion et de persistance de ces deux espèces de mycoplasmes avec différents types cellulaires bovins. Ces analyses ont confirmé que M. bovis présente de meilleures capacités d’adhésion et prolifération au support de culture, ainsi qu’aux cellules embryonnaires épithéliales qu’il envahi. Il présente aussi une meilleure résistance à la l’élimination par les macrophages. Néanmoins, Mmm a aussi été détecté à l’intérieur des macrophages après 72 heures d’infection, et ce, même à des MOI faibles et en présence de concentrations bactériostatiques d’antibiotique. Ensuite, le système d’expression a été utilisé pour tester la possibilité d’utiliser les mycoplasmes en tant que vecteurs vaccinaux. Le gène de la protéine H du virus de la peste des petits ruminants, utilisé avec succès dans des vaccins recombinants, a été inséré dans un mycoplasme caprin comme preuve de concept d’un vaccin multivalent. Cependant, malgré la détection d’ARNm spécifique, l’expression de la protéine virale n’a pas été mise en évidence, et ce, malgré le recours à une technique très sensible de détection par spectrométrie de masse. La preuve de concept n’a donc pas pu être réalisée. Pour conclure, les systèmes d’expression de gènes de fluorescences développés dans ces travaux sont bien adaptés aux études d’interaction hôte-pathogène et offrent une multitude de perspectives pour l’analyses fonctionnelle chez les mycoplasmes in vitro et in vivo.. / A mini-transposon affording unmarked, stable mutagenesis in mycoplasmas was modified to allow gene expression. This tool was first used for the development of fluorescence expression for stable and innocuous whole mycoplasma cell labelling. For this purpose, the fluorescent proteins GFP2, mCherry, mKO2 and mNeonGreen were introduced as chromosomal tags in the phylogenetically distant species Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) and Mycoplasma bovis (M. bovis), resulting in the unprecedented observation of red and green fluorescent mycoplasma colonies in the two species, with no apparent cytotoxicity. Equivalent fluorescence expression levels were quantified by flow cytometry in both species, suggesting that these tools can be broadly applied in mycoplasmas. These fluorescent mycoplasmas were then used to compare the adhesion, invasion and persistence of the two species in different bovine cells. They notably confirmed that M. bovis shows a higher adhesion and proliferation capacity to the inert culture surface and higher adhesion to embryonic lung epithelial cells, which it invades. It also shows an increased resistance to elimination by macrophages. However, fluorescent Mmm were also detected inside the phagocytes 72h post-infection, even at a low MOI. Finally, the expression vector was used to assess the possible use of mycoplasmas as vaccine vectors. For this purpose, we introduced the H gene of the “peste des petits ruminants” virus, already used in effective recombinant vaccines, in a caprine mycoplasma as proof-of-concept of a mycoplasma-based multivalent vaccine. However, despite the detection of specific mRNA, the expression of the viral protein could not be evidenced using a highly a sensitive peptide detection technique by mass spectrometry, so this prove of concept could not be delivered. Still, the fluorescence expression tools developed in this study are suitable for host-pathogen interaction studies and offer innumerable perspectives for the functional analysis of mycoplasmas both in vitro and in vivo.

Porteur redox intervenant dans nombre de processus métaboliques, le NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) est central pour les cellules vivantes. Outre son importance dans le métabolisme oxydoréductif, des données récentes suggèrent fortement d’autres rôles importants pour le NAD dans la signalisation cellulaire. Un système inductible d’enrichissement en NAD en surproduisant la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPT) d’Escherichia coli chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence l’implication du NAD dans les mécanismes spécifiques de défenses qui régissent les interactions plante-pathogène. Par ailleurs, une dérégulation de la synthèse de NAD sur l’étape enzymatique catalysée par la QPT endogène d’Arabidopsis thaliana souligne le rôle critique du NAD dans la balance C/N des plantes, en particulier en bouleversant l’assimilation de l’azote en conditions photorespiratoires. Ces travaux nous ouvrent à une nouvelle compréhension des mécanismes de signalisation impliquant le NAD dans les grandes fonctions métaboliques des plantes. / Plant development and functions are underpinned by redox reactions which depend on cofactors such as pyridine nucleotides as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Beside its redox properties, NAD has recently been implicated in cellular signalling. An inducible system based on Escherichia coli quinolinate phosphoribosyltransferase (QPT) overproduction in transgenic Arabidopsis thaliana was set up as a convenient experimental technique to raise NAD content. This build-up highlights the involvement of NAD in plant-pathogen specific defense mechanisms. Furthermore, manipulating endogenous Arabidopsis thaliana QPT levels was used to deregulate NAD production. Such an approach points out the critical role of NAD in C/N interactions by shaking up nitrogen assimilation upon photorespiratory conditions. These results pave the way for a new understanding of signalling mechanisms involving NAD in plants major metabolic functions.

La dérégulation de l’expression des microARN peut induire des cancers. De plus, ils jouent un rôle crucial dans la pathogénèse et la survie des virus. L’herpès virus humain de type 8 (HHV-8 ou KSHV) est l’agent étiologique du sarcome de Kaposi et est impliqué dans la génération de lymphomes agressifs de type B. De manière intéressante, le génome ce virus code 12 pré-miARN localisés dans la région de latence et exprimés sur un même pri-miARN. Les miARN du KSHV sont importants pour le maintien de la latence, l’inhibition de l’apoptose ou encore la régulation du cycle cellulaire de l’hôte. Nous nous intéressons à leur expression et leur régulation durant l’infection virale. Nous avons résolu la structure secondaire de l’ARN codant ces miARN afin d’identifier les critères structuraux responsables de leur accumulation différentielle. Nous avons initié une analyse cinétique de la première étape de maturation et enfin nous essayons d’identifier des co-facteurs modulant leur expression. / It is now well known that modulation of microRNAs expression is linked to the development of cancers. Moreover, they play a crucial role in the pathogenesis and the survival of some viruses. Kaposi’s sarcoma associated herpes virus (KSHV) is the etiologic agent of Kaposi’s sarcoma and is involved in human aggressive B lymphomas generation. Its genome encodes 12 precursor miRNAs that are clustered in a latency region and expressed on a single long primary transcript. KSHV miRNAs are important to maintain the virus latency and to regulate or inhibit the host cell cycle or apoptosis, respectively. Therefore, understanding the regulation of KSHV miRNA accumulation is of prime importance. In this respect, we resolved the secondary structure of them iRNA cluster to identify structural criteria responsible of their differential accumulation. In addition, we started to analyse the mechanism of their maturation by kinetics studies. Finally we tried to identify some cofactors of miRNA expression.