La phosphorylation/déphosphorylation des protéines est un mécanisme de signalisation intracellulaire commun. Parmi les kinases végétales, les Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) sont impliquées dans de nombreux processus biologiques importants, comme la réponse aux stress biotiques et abiotiques, le développement et la dynamique du cytosquelette. Chez Arabidopsis thaliana et ce malgré de nombreux efforts, les fonctions des kinases impliquées dans les cascades MAPK restent peu inconnues. L'activation des kinases en utilisant des mutations mimant la phosphorylation des sites normalement phosphorylés est une approchequi a fait ses preuves dans le cas de MAP2Ks et a largement contribué à élucider leurs fonctions. Cette stratégie s’est révélée impossible dans le cas des MAPKs, puisque les résidus à muter restent encore à identifier. Pour contourner ce problème, nous avons adapté un crible basé sur la complémentation fonctionnelle d’un mutant MAPK de levure avec des formes aléatoirement mutées de MPK6d’Arabidopsis dans le but d'identifier des mutants présentant une activité constitutive. Nous en avons identifiés plusieurs et avons montré que ces formes constitutivement actives (CA) de MPK6 sont actives sans phosphorylation par les MAP2Ks. Par ailleurs, les mutations des résidus équivalents dans d'autres MAPKs les rendent également hyperactives, ce qui indique que cette stratégie peut être utilisée comme approche générale pour activer les MAPKs afin d’en comprendre les fonctions. L’étude des interactions protéine-protéine et l’analyse des profils dephosphorylation indiquent que les MAPKs CA conservent leur spécificité envers leurs substrats et interacteurs. Comme preuve de concept, nous avons généré des formes actives du MPK4. La MPK4 CA exprimée sous son propre promoteur a parfaitement complémenté le mutant mpk4. La caractérisation des lignées exprimant MPK4 CA confirme le rôle négatif de cette kinase dans les réponses de défense aux pathogènes des plantes que ce soit dans la PTI (PAMP Triggered Immunity) ou dans la ETI (Effector Triggered Immunity). Globalement, ce travail permettra de fournir des informations directes sur les cibles des MAPKs et devrait contribuer à la compréhension globale de la transduction du signal chez les plantes. / Protein phosphorylations and dephosphorylations are common events occurring duringintracellular signaling processes. Among plant kinases, Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) are involved in signaling of many important biological processes, including biotic and abiotic stresses, development and cytoskeleton organization. Despite an abundant literature on MAPKs, the exact roles and direct targets of many Arabidopsis thaliana MAPKs are not clear yet. The activation of kinases using phospho-mimicking mutations of the phosphorylated residues was a successful approach in the case of MAP2Ks, helping to elucidate their functions. This strategy failed in the case of MAPKs since the necessary residues to mutate remain unclear. To bypass this problem, we adapted a screen based on the functional complementation of a MAPK yeast mutant with randomly mutated Arabidopsis MPK6 in order to identify the ones mutants showing constitutive activity. We identified several clones and showed that these constitutively active (CA) of MPK6 candidates are indeed active without phosphorylation by MAP2Ks. Interestingly, mutations of the equivalent residues in other MAPKs triggered constitutive activity as well, indicating that this strategy may be used as a general approach to activate MAPKs and identify their functions. Interaction and phosphorylation assays indicatedthat CA MAPKs retain their substrate and interactor specificity. As proof-of-concept, we generated active versions of MPK4. CA MPK4 expressed under itsown promoter successfully complements mpk4 mutant plants. Characterization of CA MPK4 lines further confirmed the negative role of MPK4 in plant pathogen defense responses and its implication in both PTI (PAMP Triggered Immunity) and ETI (Effector Triggered Immunity). Overall, the work will help to provide direct information on all MAPK targets and should be an important contribution to the overall understanding of signal transduction in plants.

La PGPR Burkholderia phytofirmans PsJN (Bp) stimule la croissance de diverses plantes et les protège également contre certains stress environnementaux. L’objectif des travaux a été d’approfondir les connaissances sur l’interaction Bp-plante, en se focalisant sur l’aspect physiologique et métabolique des feuilles d’Arabidopsis thaliana. Nous avons également déterminé les mécanismes impliqués dans la réponse des feuilles suite à l’inoculation de cette bactérie lors d’un stress abiotique (froid) ou biotique (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst).Nos résultats montrent que l’induction de la promotion de croissance d’A. thaliana par Bp pourrait être liée à l’accumulation des teneurs en métabolites primaires (acides aminés, glucides solubles et vitamines) et la variation du niveau des hormones dans les feuilles. La physiologie et le métabolisme des feuilles sont modifiés localement et de façon distale par la colonisation épi- et endophytique de Bp. De plus, les modifications des taux de métabolites sont plus marquées après une interaction plante-bactéries relativement longue. Par ailleurs, l’inoculation de Bp peut réduire les dommages sur l’activité photosynthétique dus au froid par une limitation non-stomatique de la photosynthèse et l’accumulation de pigments photosynthétiques. Enfin, la présence de Bp entraîne localement un retard dans le développement initial de Pst. Cependant, l’inoculation par Bp ne protège pas l’appareil photosynthétique lors d’une attaque par Pst. Ces travaux soulignent donc que le temps de présence et la localisation d’une PGPR dans une plante influencent la physiologie, le métabolisme et la tolérance aux stress de cette même plante. / Endophytic PGPR Burkholderia phytofirmans PsJN (Bp) promotes growth of various plants and triggers protection against several environmental stresses. To get more insights into the interaction between plant and Bp, we focused on leaf physiological and metabolic aspects of Arabidopsis thaliana. We also determined the mechanisms involved in the defense of leaves after inoculation of the bacteria followed by an abiotic (cold) or a biotic (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst) stress. Our results show that the induction of growth promotion of A. thaliana by Bp could be related to the accumulation of primary metabolite levels (amino acids, soluble carbohydrates and vitamins) and to the variation of hormone levels in the leaves. Leaf physiology and metabolism are changed locally and distally by Bp epi- and endophytic colonization. In addition, changes in metabolite levels are more pronounced after a relatively long interaction between plant and bacteria.Moreover, Bp inoculation can also reduce cold injury on the photosynthetic activity by a non-stomatal limitation of photosynthesis and accumulation of photosynthetic pigments. Finally, the local presence of Bp causes a delay in the development of Pst, but only in the early stages of the infection. However, the inoculation with Bp does not protect the photosynthetic apparatus during Pst attack.Thus, our results emphasize that the time of presence of a PGPR and his location in the plant could influence the plant physiology and stress tolerance.

Les organismes vivants puisent leurs ressources de l'environnement pour les allouer aux différentes fonctions biologiques assurant leur développement (croissance, survie, reproduction). La quantité de ressources disponibles dans un environnement étant limitante, les individus doivent faire des compromis lors de l'allocation de ces ressources à leurs différentes fonctions biologiques. Ces compromis contraignent le développement des individus et entraînent d'autres compromis entre leurs traits d'histoire de vie (âge et taille à maturité, nombre de descendants), conditionnant ainsi leurs capacités d'adaptation à l'environnement. Au cours de cette thèse, nous avons étudié par modélisation les stratégies d'allocation des ressources entre la croissance intra-hôte et la production de spores au cours d'une infection par un unique génotype pathogène et déterminé les stratégies optimales dans différentes conditions écologiques. Si le pathogène a un accès limité aux ressources de l'hôte, la stratégie optimale est toujours Bang-bang. Si au contraire l'accès aux ressources de l'hôte est illimité, la stratégie optimale est toujours Bang-mixte. Dans un deuxième volet de ces travaux, des éléments de validation empirique de ces modèles ont été recherchés au travers d'expérimentations menés sur un champignon pathogène nécrotrophe, Magnaporthe oryzae, présentant un accès limité aux ressources de l'hôte et sur un champignon biotrophe, Melampsora larici-populina dont l'accès aux ressources de l'hôte semble plutôt illimité. Les observations réalisées sont en adéquation avec les prédictions théoriques et confirment la pertinence des hypothèses et de la démarche de modélisation / Living organisms extract resources from their environment and invest them toward various biological functions (growth, survival, reproduction). Available resources in an environment are usually limited so that organisms have to trade-off the resources invested in different biological functions. These trade-offs in resource investment reverberate in trade-offs between life-history traits (age and size at maturity, number of offspring) and determine pathogen potential to adapt to their environment.During this work, we have studied resource allocation strategy during infection caused by spore-producing pathogen. We have determined optimal resource allocation strategies between intra-host multiplication and spore production in different ecological settings. The main result of this work is that the optimal strategy is defined by the existence of a latent period, a period of time during which all extracted resources are investing toward within-host multiplication and no spore is produced. After latency, when the pathogen has a limited access to host resources, consumed resources are invested toward spore production only (Bang-bang strategy). On the contrary, when the pathogen has an unlimited access to host resources, a fixed proportion of host resources are invested toward maintenance of within-host multiplication forms (Bang-mixte strategy). A second part of this work presents empirical test of these theoretical assumptions, through experimentations on Magnaporthe oryzae and on Melampsora larici-populina. Our observations on these pathogens seem to agree with our theoretical predictions and corroborate the relevance of our modelling assumptions and approach

Les Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) sont le résultat de plusieurs transmissions inter-espèces de SIV (Virus de l'Immunodéficience Simienne) de Primates Non Humains (PNH) à l'Homme. Les SIV les plus proches du VIH-1 sont le SIVcpz et le SIVgor qui infectent naturellement les chimpanzés et les gorilles. Les SIVsmm retrouvés chez les mangabés enfumés d'Afrique de l'Ouest sont les plus proches du VIH-2. Actuellement, au moins 13 transmissions du singe à l'Homme ont été documentées, 4 à l'origine des 4 groupes du VIH-1 (groupe M, N, O et P) et 9 pour le 9 VIH-2 (A-I). La question du réservoir à l'origine du VIH-1 chez l'Homme est partiellement résolue. Les chimpanzés, Pan troglodytes troglodytes, du sud-est et centre sud du Cameroun sont respectivement les réservoirs du VIH-1 M pandémique chez l'Homme ainsi que du VIH-1 groupe N. En ce qui concerne les groupes O et P, il n'y a actuellement pas de réponse définitive. Les SIVgor sont bien les virus les plus proches phylogénétiquement des VIH-1 O et P. Cependant, de plus amples recherches sont nécessaires pour identifier les ancêtres directs des variants O et P. Ces recherches supplémentaires aideront aussi à élucider l'origine du SIVgor chez les gorilles, et à savoir si ce sont les gorilles qui ont transmis les virus O et/ou P à l'Homme, ou s'il existe toujours un réservoir des ancêtres O et P chez les chimpanzés. Des études supplémentaires sont aussi nécessaires afin de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation à un nouvel hôte et l'impact des infections SIV chez les grands singes. Dans ce but, l'étude du récepteur accessoire pour le VIH, l'intégrine α4β7, pourrait aussi jouer un rôle pour l'infection du SIV/VIH. Cette intégrine facilite également la migration du virus vers l'intestin. Une étude récente a montré des substitutions d'acides aminés chez les Primates du Nouveau Monde (PNM) qui empêche l'adhérence du liant. Ainsi, les polymorphismes de cette intégrine et son rôle dans l'infection SIV chez les Primates de l'Ancien Monde (PdAM) sont encore inconnus. L'objectif majeur de cette thèse était de mieux documenter et mieux comprendre l'infection SIV chez les gorilles sauvages en Afrique Centrale. Sur plus de 6.000 échantillons testés, nous avons constaté que seuls les gorilles (Gorilla gorilla gorilla) du sud Cameroun sont infectés par le SIVgor. Parmi eux, nous avons identifié les ancêtres du VIH-1 P chez des populations du sud-ouest Cameroun. Nous avons aussi mis en évidence que les gorilles sont à l'origine du VIH-1 groupe O. Les analyses fonctionnelles du facteur de restriction APOBEC3G ont montré que celui-ci protège les gorilles des infections SIVcpz, expliquant en partie la faible prévalence de SIVgor. Nous avons évalué une nouvelle technologie sérologique, le Luminex®, en utilisant des antigènes spécifiques de la lignée SIVgor. Ces résultats ont été comparés avec ceux que nous pouvons obtenir avec l'INNO-LIATM qui est une technique de référence basée sur des réactions croisées entre anticorps SIV et antigènes VIH-1. Nous avons aussi évalué la faisabilité de la technologie de séquençage de deuxième génération Illumina® pour étudier les viromes de deux gorilles. Nous n'avons pas pu obtenir la séquence du SIVgor dans l'échantillon de l'individu infecté. Cependant, en comparant les résultats obtenus entre les deux gorilles étudiés, nous avons pu constater un probable déséquilibre de la réplication des virus entériques seulement pour le gorille infecté par le SIVgor. Enfin, nous avons décrit la diversité de la sous-unité α4 de l'intégrine α4β7 chez les PdAM. En conclusion, ces travaux de thèse ont apporté de nouvelles connaissances majeures sur l'infection SIV chez les gorilles et ont contribués à élucider l'origine des quatre groupes VIH-1. / Human Immunodeficiency Viruses (HIV) are the result of numerous interspecies transmissions of different SIV (Simian Immunodeficiency Virus) from Non-Human Primates (NHP) to humans. SIVcpz and SIVgor from chimpanzees and gorillas are most closely related to HIV-1, and SIVsmm from sooty mangabeys in West Africa to HIV-2. At least 13 cross-species transmissions from NHP to humans have been reported, 4 leading to the 4 HIV-1 group (M, N, O and P) and 9 for the 9 HIV-2 groups (A-I). Today the origin of HIV-1 group M and N is elucidated and their simian ancestors, have been identified in chimpanzee (Pan troglodytes troglodytes) populations in southeast and south-central Cameroon, respectively. HIV-1 group O and P are most closely related to SIVgor from gorillas but their direct ancestors have not been identified yet. More studies are thus needed to clarify the origin of HIV-1 group O and P in humans as well as on the origin of SIVgor in gorillas. These studies will also elucidate whether HIV-1 group O and P have been transmitted by chimpanzees or gorillas and whether simian ancestors of these HIV groups and the ancestor of SIVgor still circulates in today's chimpanzee populations. More studies are also needed to understand viral and host factors related adaptation in the new host and the impact of SIV infection in general in apes. As such, α4β7 integrin has been recently described as a new HIV-1 receptor that facilitates virus migration to the Gut-Associated Lymphoid Tissue (GALT). In a recent study, amino acid substitutions were observed in the α4 binding site in New World Primates (NWP), that can reduce the activity of this receptor. The impact of the genetic diversity of this integrin in Old World Primates (OWP) and its role in SIV infection is still unknown. Therefore, characterizing the polymorphisms profiles in OWP could bring new insights into progression of the pathogenic and non pathogenic SIV infections. The main objective of this thesis was to better characterize and understand SIV infection in wild gorillas in Central Africa. On more than 6,000 fecal samples from gorillas collected across Central Africa, we showed that only gorillas from southern Cameroon are infected with SIVgor and we identified the ancestors of HIV1 group P in gorilla populations from southwest Cameroon. We also provided evidence that gorillas are at the origin of HIV-1 group O in humans. Functional analysis of the restriction factor APOBEC3G showed that its protects gorillas from SIVcpz infections and can explain the low prevalence in gorillas. We evaluated a new antibody detection approach in faecal samples, based on Luminex® technology that use SIVgor specific antigens, comparing with the actual serological test INNO-LIATM HIV confirmatory assay, based on cross-reactive SIV antibodies with HIV antigens. We also evaluated the feasibility of virus sequencing in faecal samples with the Illumina® technology to study viromes of gorillas. We studied two samples, one of a SIVgor infected individual and one from an uninfected gorilla. Although the SIVgor sequence was not retrieved from the infected individual, we observed a tendency to enteric virus replication disorder in the infected animal that has not been seen in the uninfected one. Finally, we also documented here the genetic diversity of the α4 subunit from OWP. In this thesis we documented more in detail different aspects of SIV infection in gorillas and contributed to elucidate the origin of all HIV-1 groups.

Selon le dernier rapport de l’EFSA-ECDC (EFSA Journal 2014), les parasites se classent en 8ème position des agents étiologiques impliqués dans les épidémies d’origine alimentaire reportées en 2012 en Europe. Par ailleurs, un récent rapport de l’OMS et la FAO (2014) classe Toxoplasma gondii en première position des parasites protozoaires à considérer dans le domaine alimentaire, suivi de Cryptosporidium spp et Giardia duodenalis. Les oocystes de T. gondii et Cryptosporidium spp et les kystes de G. duodenalis sont des formes très résistantes excrétées en très grande quantité dans les selles des individus malades. Lorsqu’ils se retrouvent dans l’environnement, ils peuvent y persister longtemps et contaminer certaines matrices alimentaires (végétaux et mollusques) lors de leur production primaire. A l’heure actuelle, en l’absence de méthodes d’analyse standardisées dans les aliments pour ces 3 parasites, peu de données de prévalence sont disponibles dans la littérature et les épidémies d’origine alimentaire restent négligées. Pour combler ce manque, une norme pour la détection/quantification des kystes de G. duodenalis et des oocystes de Cryptosporidium spp. dans les végétaux à feuilles vertes et fruits rouges à baies par microscopie à fluorescence est en cours de rédaction (ISO 18744). Des approches moléculaires, plus compatibles avec l’analyse de routine ont été développées par ACTALIA et l’équipe PROTAL pour détecter les 3 parasites simultanément sur des matrices végétales (Protofood, ANR-09-ALIA-009). Cependant, quelque soit la méthode de détection utilisée, elle met en évidence les parasites vivants et morts. Or, seul un parasite viable pourra être infectieux et donc potentiellement provoquer une maladie. A l’heure actuelle, les modèles in vivo constituent la méthode de choix pour évaluer l’infectiosité de manière précise, sensible et quantitative. Ils sont en revanche coûteux, lourds à mettre en œuvre et présentent un délai de réponse de plusieurs jours voire semaines qui n’est pas compatible avec les attentes des professionnels de l’agroalimentaire. L’objectif de la thèse est de développer des méthodes moléculaires pour caractériser la viabilité des 3 protozoaires dans des matrices alimentaires et disposer d’un outil permettant l’évaluation du risque lié à la détection de ces dangers dans les aliments. Ces méthodes seront comparées à celles qui permettent de mesurer l’infectiosité. Elles seront ensuite mises en œuvre pour évaluer leur potentiel pour déterminer l’efficacité d’inactivation de traitements technologiques sur des matrices alimentaires. / In the latest report from EFSA-ECDC (EFSA Journal 2014), parasites are ranked in the 8th position of the etiological agents involved in foodborne outbreaks reported in Europe in 2012. Moreover, in a recent report from the WHO and FAO (2014), Toxoplasma gondii is designated as the first protozoan parasite to be considered in the food domain, followed by Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis. Oocysts of T. gondii and Cryptosporidium spp., and cysts of G. duodenalis are excreted in big quantity by infected hosts and are particularly resistant. Consequently they can be found in the environment during long period and contaminate food matrices (vegetables and molluscs) during primary production. For now, since there are no standard methods to detect these 3 parasites in food samples, only few occurrence data are available and foodborne outbreaks remain neglected. To fill this gap, an ISO standard which describes a method for the detection and quantification of Cryptosporidium and Giardia in green leafy vegetables and red berries fruit by fluorescence microscopy is being draft (ISO 18744). Molecular approaches which are more suitable for routine analyses were developed by ACTALIA and PROTAL to simultaneously detect the 3 parasites in vegetable matrices (Protofood, ANR-09-ALIA-009). Nevertheless, whatever the used detection method, it highlights alive and dead parasites. But solely a living parasite can be infectious and induce pathology. For the moment, animal models are the favorite method to quantitatively evaluate infectivity with accuracy and sensitivity. However they are costly, heavy to implement and display a long time-to-result (from days to weeks) which does not fit with the agro-industrial needs. The objective of the thesis is to develop molecular methods to characterize the viability of the three protozoa in food matrices in order to have a tool allowing risk assessment in food safety. These methods will be compared to infectivity measurement methods. Then they will be implemented to evaluate their potential to determine the efficiency of technological treatments to inactivate protozoa in food matrices.

Il y a désormais un consensus autour de l’idée que nous devons réduire l’usage des pesticides (Plan Ecophyto). Il est donc nécessaire de développer des systèmes de cultures réduisants l’utilisation des pesticides au profit d’un système de production dans lequel on stimule les mécanismes de défense «naturels» des plantes. Dans ce contexte, on voit aujourd’hui se développer de nombreuses solutions d’origines chimique ou biologique à base de stimulateurs de défenses des plantes (SDP) mais dont l’efficacité est souvent jugée aléatoire. Dans ce travail, notre choix a porté sur l’utilisation des rayonnements UV-C pour stimuler les défenses de la laitue et de la tomate contre Botrytis cinerea. L’idée d’exploiter les rayonnements UV-C, comme stimulateurs des défenses des plantes à intérêt alimentaire en culture, n’a jamais été testée. Nos résultats démontrent clairement un effet stimulateur des défenses des plantes par des doses faibles et répétées d’UV-C (inférieur à 1,70 kJ/m2). Cette stimulation est associée au renforcement de la paroi cellulaire, à l’augmentation des composés phénoliques et à l’augmentation de l’activité de certaines enzymes antioxydantes. Lorsque le traitement par les rayonnements UV-C est combiné à l’agent biologique Bacillus subtilis aucun effet synergique ou même additif n’a été observé par rapport à un traitement simple UV-C ou B. subtillis. / There is now a consensus around the idea that we must reduce theuse of pesticides (Plan Ecophyto). It is therefore necessary to develop cropsystems that have less need to be protected by pesticides in favor of aproduction system in which the "natural" defense mechanisms arestimulated. In this context, many solutions of chemical or biological originbased on stimulation of plant defense are now being developed but theireffectiveness is often judged to be random. In this work, we chose to useUV-C radiation to stimulate the defenses of lettuce and tomato againstBotrytis cinerea. The idea of exploiting radiation UV-C, as a stimulant ofplant food-borne defenses in culture, has never been tested. Our resultsclearly demonstrate a stimulatory effect of plant defenses by low andrepeated doses of UV-C (less than 1.70 kJ/m2). This stimulation isassociated with a reinforcement of the cell wall, an increase in the phenoliccompounds and the activity of certain antioxidant enzymes. When treatmentwith UV-C radiation is combined with a biological agent Bacillus subtilis, nosynergistic or even additive effect has been observed compared with asimple UV-C or B. subtillis treatment. / Se ha establecido en el mundo entero la importancia sobre el controlde uno de los principales organismos fitopatológicos como lo es Botrytiscinérea, el cual demanda en la actualidad a los productores aplicarcontroles cónsonos con la protección del medio ambiente. Por consiguiente,se evaluó el uso de diferentes dosis de luz ultravioleta sola o encombinación con un agente de biocontrol (Basillus subtilis), con la finalidadde estimular las defensas naturales de dos especies vegetales (lechuga ytomate). Al respecto, los resultados establecieron que dosis menores de1,70 kJ/m2 de UV-C logran disminuir la sensibilidad de las plantas, sinafectar significativamente el desenvolvimiento del aparato fotosintético deambas especies. Así como, se observó un efecto antagónico del biocontrolsobre la UV-C cuando se combinan.

Cette étude a pour objet la mise en évidence de traces d'ADN bactérien pathogène dans des échantillons animaux et humains anciens, et ainsi améliorer les connaissances sur l'évolution des maladies au cours du temps. En parallèle, nous avons étudié les phénomènes de dégradation de l'ADN dans le sol sur des cadavres de souris enterrées après avoir été contaminées par des bactéries non pathogènes. Cette étude des processus taphonomiques s'est étalée sur trois ans et a permis de montrer une disparition rapide des bactéries simulantes, remplacé par l'ADN des bactéries du sol, qui colonisent rapidement la dépouille et dégradent tant l'ADN endogène (murin) qu'exogène (bactérien). Cette disparition rapide explique la grande difficulté à mettre en évidence des pathogènes dans des échantillons anciens, à de rares exceptions près. Notre étude n'a pas permis de détecter d'agents pathogènes particuliers dans les échantillons que nous avons étudié, mais nous avons mis en évidence l'intérêt d'analyser certains types de restes pour accéder à une information génétique préservée. Le tartre dentaire indique est un bon indicateur de la flore buccale de l'hôte et les kystes calcifiés assurent une bonne préservation de l'ADN endogène, moins soumis à contamination et digestion par les bactéries de l'environnement. Les kystes présentent en règle générale une teneur en ADN endogène supérieure à tous les autres tissus étudiés. / The aim of this study was the identification of pathogenic bacterial DNA traces in ancient animal and human samples, and thus improve knowledge of past diseases that affect humankind over time. In parallel, we studied the DNA degradation phenomena in the soil on the buried corpses of mice after being contaminated by non-pathogenic bacteria. This study of taphonomic processes was spread over three years and has shown a rapid disappearance of simulant bacteria, replaced with the DNA of soil bacteria that colonize the body quickly after burial and degrade both the endogenous DNA (murine) that exogenous (bacteria). This quick degradation can explain the high difficulty to detect and identify bacterial pathogens in old samples, with very few exceptions. Despite the fact in our study we were not able to detect specific pathogens in the samples we have studied, we have shown the interest to analyze certain types of remnants to access preserved and informative genetic data. Dental calculus is a good indicator of the oral flora of the host and calcified cysts ensure good preservation of the endogenous DNA, less subject to contamination and digestion by bacteria from the environment. Cysts generally have an endogenous DNA content higher than all other tissues examined.

La détection rapide et sensible des agents pathogènes est d’une très grande importance pour la biosécurité. Les biopuces sont bien adaptées à cet effet, car elles permettent la détection multiplexe des cibles. Une limitation cruciale des biopuces est leur manque de fiabilité et de sensibilité. L’objectif de cette thèse est de développer une architecture reproductible de biopuces à base de couche mince de silicium amorphe carboné (a-SiC:H) déposée sur un réflecteur en aluminium pour une détection fiable et sensible des pathogènes. Nous avons choisi comme système modèle l’interaction de la toxine alimentaire ochratoxine A (OTA) avec son aptamère AntiOTA de longueur 36mer. Les aptamères (simples brins d’ADN) sont de plus en plus utilisés comme sondes en raison de leur grande spécificité et affinité vis-à-vis d’une large gamme de cibles (i.e. protéines, bactéries…). La stratégie de fabrication consiste en un greffage de monocouches organiques d’acides carboxyliques via des liaisons Si-C robustes, suivi de l’accrochage covalent des aptamères par un couplage peptidique. Les processus de greffage ont été mis au point sur silicium cristallin permettant la quantification des couches greffées par spectroscopie infrarouge en mode ATR (Attenuated total reflexion). La quantification IR des interactions OTA – AntiOTA a été montrée pour la première fois sur des surfaces par IR-ATR. La spécificité de l’aptamère a été démontrée en utilisant une molécule chimiquement similaire (warfarin), pour laquelle l’AntiOTA ne montre aucune affinité. Ces protocoles bien contrôlés ont été transférés sur l’architecture de la biopuce a-SiC:H. Les aptamères immobilisés sont hybridés avec des brins complémentaires marqués avec des fluorophores. En présence de l’OTA une déshybridation des brins complémentaires est attendue, conduisant à une diminution du signal fluorescent. Différentes longueurs de brins complémentaires ont été comparées, montrant jusqu’à 13% de diminution due à l’interaction de l’OTA. / Rapid and sensitive detection of pathogenic targets play a crucial role in biosecurity. Biochips are ideal for this, as they allow easy and multiplex detection of targets. A crucial limitation in biochips is that they often suffer from low reliability and sensitivity. The goal of this thesis is to develop a stable and reproducible architecture for biochips based on an amorphous silicon carbon alloy (a-SiC:H) deposited on an aluminium back-reflector for reliable and sensitive detection of pathogens. On these biochips we introduced the interaction of the food and feed toxin ochratoxin A (OTA) with its 36mer aptamer AntiOTA as a model system. Aptamers (single strands of DNA) are ideal as probes for biochips as they display high specificity and affinity towards a wide range of targets (i.e. proteins, bacteria…). The well-controlled multi-step fabrication process consists of the reliable photochemical grafting of acid-terminated organic monolayers on silicon surfaces by robust Si C bonds, which in turn were functionalized with aptamers by stable peptide coupling. Carrying out this process on crystalline silicon allowed monitoring and quantification of every step by infrared spectroscopy (IR-ATR). The interaction OTA – AntiOTA was shown for the first time on surfaces by IR, and an IR in situ calibration allowed the quantification of OTA which was bound by the aptamers on the surface. The specificity of AntiOTA towards OTA was demonstrated by using a chemically similar molecule (warfarin), for which AntiOTA shows no affinity. The well-controlled protocols were transferred to the a-SiC:H biochip. The immobilized aptamers were hybridized with complementary and fluorescent-labeled DNA-strands. In presence of OTA, dehybridization of the complementary strands is expected, resulting in a decrease of fluorescent signal. Different lengths of complementary strands were compared, exhibiting up to 13% signal decrease due to OTA.

Chlamydia trachomatis est une bactérie intracellulaire obligatoire. Ce pathogène de l’Homme est la première cause infectieuse de cécité ainsi que de maladies sexuellement transmissible d’origine bacterienne.Utilisant une souche de C. trachomatis L2 exprimant une protéine fluorescente, nous avons développé des méthodes de microscopie et de cytométrie en flux permettant de suivre les différentes étapes du développement de la bactérie. Ces méthodes faciliteront les futures études de l’infection par Chlamydia.Chlamydia interagit avec différents processus cellulaires, et plus particulièrement via la sécrétion d’effecteurs par le système de sécrétion de type 3 (ST3). Nous avons identifié une famille de protéines possédant un signal de ST3 qui partagent un domaine, le DUF582, présent uniquement chez les Chlamydia pathogènes.Nous avons montré que les 5 protéines DUF582 de C. trachomatis sont exprimées à partir du milieu du cycle infectieux. Nous avons démontré que la protéine Hrs interagit avec le DUF582 et que la protéine DUF582 CT619 interagit avec Tsg101. Hrs et Tsg101 sont d’importants composants de la machinerie ESCRT impliquée dans de nombreux processus de fission membranaire.Utilisant l’interférence ARN, nous avons montré que Hrs et Tsg101 ne sont requis ni pour l’entrée, ni pour le développement de la bactérie. Ceci suggère que les protéines DUF582 bloquent des processus dépendant de Hrs/Tsg101. A l’inverse, la bactérie pourrait utiliser la machinerie ESCRT mais l’existence de mécanismes redondants expliquerait l’absence de phénotype dans les expériences d’interférence. Nous discutons trois hypothèses concernant le rôle des protéines DUF582 dans l’infection. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen. It is the first infectious cause of blindness and the most common cause of sexually transmitted diseases of bacterial origin. Using a strain of C. trachomatis serovar L2 expressing a fluorescent protein we developed microscopy and flow cytometry based methods to quantify several steps of its developmental cycle. These methods will facilitate future studies aimed at testing anti-bacterial compounds or various culture conditions. Chlamydiae interfere with many cellular processes, in particular via the secretion of bacterial proteins through a type 3 secretion (T3S) system. We identified a family of proteins that possess T3S signals. They share a domain designated as DUF582, which is only found in pathogenic chlamydiae. We showed that the five DUF582 proteins of C. trachomatis are expressed from the mid phase of infection. We demonstrated that the protein Hrs is a common interactor for the DUF582. In addition the N-terminal part of the DUF582 protein CT619 interacts with Tsg101. Hrs and Tsg101 are both important components of the ESCRT machinery, which is an ancient machinery required for several processes involving membrane fission.Using RNA interference we showed that Hrs and Tsg101 are dispensable for bacterial entry and growth. This last result suggest that DUF582 proteins actually prevent Hrs and/or Tsg101 driven processes. Alternatively, the bacteria might highjack the ESCRT machinery but redundant mechanisms would explain the absence of phenotype on bacterial development observed in the silencing experiments. We discuss three hypotheses as to the possible role of the DUF582 proteins in infection.

Escherichia coli possède une grande plasticité génomique comme en témoigne la diversité des souches à l’intérieur de cette espèce bactérienne. Bien que la majorité des souches soient inoffensives ou à tout le moins opportunistes, plusieurs ont acquis des facteurs de virulence spécifiques leur procurant un pouvoir pathogénique. Les souches pathogènes comme E. coli O157 :H7 sont responsables de cas de morbidité, mortalité et pertes économiques importantes dans l’industrie agro-alimentaire dans le monde entier. L’évolution bactérienne est un mécanisme continuel qui se fait via l’échange d’éléments génétiques mobiles, de mutations ponctuelles et autres réarrangements génétiques. Ces changements génétiques peuvent procurer des avantages sélectifs permettant une adaptation bactérienne rapide face aux stress et changements environnementaux et favorisant le développement de pathogènes émergents. Dans la première partie de ce projet, nous avons étudié la région intergénique mutS-rpoS, qui est une des plus grandes sources de polymorphisme chromosomique chez les entérobactéries. Notre analyse génomique comparative a permis de confirmer le polymorphisme à l’intérieur même d’un ensemble de souches Escherichia spp., Salmonella spp. et Shigella spp. De plus, nous avons pu confirmer que certains types de polymorphismes dans la région mutS-rpoS étaient fortement associés à certains types de pathogènes chez E. coli. Dans notre analyse, nous avons ressorti un groupe de gènes à l’intérieur de la région mutS-rpoS qui pourraient sevir comme marqueur chromosomique intéressant pour les E. coli extra-intestinaux (ExPEC), un groupe comprennant des souches hautement pathogènes et difficiles à définir par les tests actuelllement disponibles. Dans notre analyse bio-informatique, nous avons isolé ce groupe de gènes associé aux ExPEC et nous l’avons caractérisé in sillico. Nous avons également inclus dans l’analyse deux souches hypermutables du genre Escherichia spp. de notre collection, isolées d’animaux de ferme. L’hypermutabilité ou la capacité d’acquérir des mutations plus rapidement que la normale accélère le processus d’évolution et la capacité d’adaptation de ces souches. La région mutS-rpoS est reliée au système de réparation de l’ADN bactérien (MMRS) et pourrait être impliquée dans l’apparition du phénotype d’hypermutabilité. Durant les dernières années, de plus en plus d’espèces du genre Escherichia ont été isolées de cas cliniques d’animaux et d’humains. Ces souches atypiques ont un potentiel de virulence très élevé, des combinaisons de gènes de virulence et des variants génétiques différents des souches typiques, et certaines souches ont même évolué en tant que pathogènes. Les souches de l’espèce E. albertii ont été isolées récemment et ont un grand potentiel de virulence autant chez les humains que chez les oiseaux. Ces souches sont souvent confondues avec d’autres organismes pathogènes comme E. coli dans les tests biochimiques, et le manque de connaissances sur E. albertii rend son identification difficile. Dans la deuxième partie de ce projet, nous avons identifié des gènes spécifiques aux souches d’E. albertii ainsi que des gènes de virulence présents chez E. albertii par comparaisons génomiques, ce qui a permis de développer et optimiser un test PCR (réaction en chaîne par polymérase) visant l’identification génomique rapide et fiable d’E. albertii.