Les mouvements stomatiques en réponse aux stimuli environnementaux sont cruciaux pour le contrôle du statut hydrique de la plante et sa protection contre les pathogènes. L'acide abscissique (ABA) et les Motifs Moléculaires Associés aux Pathogènes (PAMPs), comme le peptide flg22, déclenchent, via le peroxyde d'hydrogène (H2O2), des processus de signalisation qui conduisent à la fermeture stomatique. Bien que les mouvements stomatiques impliquent d'importants flux membranaires d'eau et changements de volume cellulaire, le rôle des canaux hydriques membranaires (aquaporines, AQP) est resté hypothétique. Des expérimentations sur épidermes isolés montrent que les plantes pip2;1 d'Arabidopsis thaliana invalidées pour le gène codant pour PIP2;1, une AQP de la membrane plasmique, présentent un défaut de fermeture stomatique en réponse à l'ABA et au flg22, mais des réponses normales à l'obscurité, la lumière ou le dioxyde de carbone. Les protoplastes de cellules de garde de plantes sauvages présentent, contrairement aux protoplastes de plantes pip2;1, une augmentation de perméabilité hydrique (Pf) de deux fois en réponse à l'ABA. Une sonde génétique sensible à l'H2O2 (HyPer) a permis de révéler une accumulation d'H2O2 dans les cellules de garde de plantes sauvages en réponse à l'ABA et au flg22, accumulation qui est abolie chez les plantes pip2;1. SnRK2;6 (OST1), une protéine kinase étroitement liée aux récepteurs de l'ABA, est capable de phosphoryler in vitro un peptide cytoplasmique de PIP2;1, au niveau du résidu Ser121. SnRK2;6 augmente aussi l'activité de transport d'eau de PIP2;1 après co-expression en ovocytes de xénope. L'expression dans des plantes pip2;1 de formes mutées de PIP2;1 mimant un état phosphorylé (Ser121Asp) ou non phosphorylé (Ser121Ala) a permis de montrer que l'augmentation de Pf en réponse à l'ABA, l'accumulation intracellulaire d'H2O2 et la fermeture stomatique induites par l'ABA ou le flg22, requièrent la phosphorylation de PIP2;1 en Ser121. Ce travail fournit les premières évidences génétiques et physiologiques directes d'un rôle des AQPs dans les mouvements stomatiques. Nous proposons que PIP2;1 joue à la fois un rôle hydraulique et signalétique en facilitant le transport d'eau et H2O2 au travers de la membrane plasmique des cellules de garde. Sa phosphorylation en Ser121, par SnRK2.6 notamment, serait nécessaire à son activation dans ce contexte. / Stomatal movements in response to changing environmental conditions are crucial for controlling the plant water status and protecting plants against pathogens. Abscisic acid (ABA) or Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs) such as the flg22 peptide, induce, via hydrogen peroxide (H2O2), signaling networks that lead to stomatal closure. Although stomatal movements involve marked water fluxes and changes in cell volume, the role of membrane water channels (aquaporins, AQP) has remained hypothetical. Functional assays in epidermal peels showed that Arabidopsis thaliana pip2;1 plants invalidated for plasma membrane AQP PIP2;1 have a defect in stomatal closure in response to ABA and flg22, but normal responses to dark, light or carbon dioxide. Guard cell protoplasts from wild-type plants showed a two-fold increase in osmotic water permeability (Pf) in response to ABA which was fully abrogated in pip2;1 plants. Plants expressing a H2O2 sensitive probe (HyPer) revealed an accumulation of H2O2 in guard cells of wild-type plants in response to ABA and flg22, which was abolished in pip2;1 plants. OST1 (SnRK2.6), a protein kinase closely linked to ABA receptors, was able to phosphorylate, in vitro and at Ser121, a cytosolic peptide of PIP2;1. SnRK2.6 also enhanced PIP2;1 water transport activity after co-expression in Xenopus oocytes. Expression in pip2;1 plants of a phosphomimetic (Ser121Asp) or a phosphodeficient form (Ser121Ala) of PIP2;1 allowed to demonstrate that the increase in guard cell protoplast Pf, the intracellular accumulation of H2O2 and stomatal closure induced by ABA and flg22 require the phosphorylation of PIP2;1 at Ser121. This work provides the first direct genetic and physiological evidence for aquaporin function in guard cells. We propose that PIP2;1 plays both a hydraulic and signaling role in guard cells, by facilitating the transport of water and H2O2 across the guard cell plasma membrane. PIP2;1 phosphorylation at Ser121, by SnRK2.6 in particular, would be required in this context.

La qualité de l'eau est une préoccupation majeure pour la santé publique et la préservation de l'environnement. Nous proposons d’utiliser les phages comme des biosenseurs pour détecter les pathogènes humains ou animaux présents dans les eaux de surface, un outil nommé Phagosensor.La mise au point d’un phagosensor prototype a permis d’optimiser la détection des bactéries par cytométrie en flux. Les résultats montrent que cet outil est extrêmement rapide, sensible, et très spécifique. L’outil phagosensor permet de détecter des bactéries cibles présentes dans un environnement complexe tel que l’eau de mer.Le prototype fonctionnel a servi de base à la construction de phagosensors spécifiques de bactéries pathogènes. Les résultats montrent que la stratégie développée à partir du prototype peut être rapidement transposée à la détection de pathogènes tel que Salmonella. Le séquençage de novo et l’annotation des génomes de trois phages isolés de l’environnement permettront la construction de nouveaux phagosensors spécifiques de souches d’E. coli pathogènes.Cette stratégie a été adaptée à la détection d’un signal luminescent post-infection en utilisant les phages recombinants portant l’opéron luxCDABE. Les bactéries infectées sont rapidement détectables.L’ensemble de ces résultats démontre que la stratégie développée est applicable à la construction de phagosensor sur demande pour une détection rapide, sensible et spécifique des bactéries d’intérêt que ce soit en fluorescence ou en luminescence. La détection dans l’eau de mer suggère, qu’à terme, des outils pourront être conçus pour la détection de bactéries pathogènes dans d’autres matrices telles que le sang ou les aliments. / Water quality is a major concern for public health and natural environment preservation. We propose to use phages to develop biosensor tools able to detect human and animal pathogens present in water. The construction of a phagosensor prototype using an optimized genetic engineering strategy, infection and detection conditions, allowed the specific detection of bacteria. The results show that detection is fast, specific and highly sensitive. Moreover, the phagosensor tool detects target bacteria in a complex environment such as seawater. Phagosensors specific of pathogenic bacteria were constructed following the strategy developed for the prototype. Results show that the strategy we designed can be successfully transposed to detect pathogens such as Salmonella. De novo sequencing and genomes annotation of three phages isolated from the environment were carried out to develop phagosensors that are specific of pathogenic E. coli. This technology was then adapted to detect a luminescent signal arising post-infection using genetically modified phages carrying the entire luxCDABE operon. The bacteria infected with the lux recombinant phages were rapidly detected by luminescence emission. Together, these results demonstrate that our technology can be applied to construct various phagosensors adapted to the detection of different bacterial species of interest and using at least two output signals. These tools allow a rapid, specific and highly sensitive detection that are close to the European guideline. Efficient bacterial detection in seawater suggests that phagosensors could be developed to detect pathogenic bacteria in other matrices such as blood or food.

Nous présentons l’étude de l’interaction entre la bactérie pathogène racinaire Ralstonia solanacearum et la légumineuse modèle Medicago truncatula. Un pathosystème avec les lignées A17 et F83005.5, respectivement sensible et résistante à la souche GMI1000, a été mis en place avec une procédure d’inoculation sur racines intactes. Ce dispositif expérimental nous a permis de suivre le processus infectieux, de la pénétration de la bactérie par l’extrémité racinaire au développement des symptômes foliaires. L’analyse des étapes précoces de l’interaction a permis de décrire l’apparition de symptômes racinaires qui se mettent en place rapidement après l’infection, que les lignées soient résistantes ou sensibles à la bactérie. Un arrêt de croissance de la racine s'observe dès 24 heures post-inoculation, ainsi qu’une mortalité de l’épiderme de l’extrémité racinaire. Ces phénotypes sont notés suite à des inoculations avec de faibles concentrations bactériennes, et ce sur plusieurs espèces hôtes ou non-hôtes testées. La mise en place des symptômes racinaires est dépendante de l’appareil de sécrétion de type III. Un crible de mutants d’effecteurs de type III de la souche GMI1000, basé sur l’apparition des symptômes racinaires, a permis de montrer que des pools différents d’effecteurs interviennent chez A17 et F83005.5. Chez la lignée sensible A17, deux effecteurs sont principalement impliqués, Gala7 et AvrA. L’étude de la colonisation de cette lignée a montré que le mutant gala7 ne pénètre pas la plante et n’induit pas de symptômes de flétrissement. Le mutant avrA s’est révélé capable d’induire la maladie chez la lignée A17 mais de manière nettement réduite par rapport à la souche sauvage. L’analyse des extrémités racinaires des lignées sensible et résistante infectées par la souche GMI1000 a révélé qu’au niveau des parois de l’endoderme, la présence de lignine est induite de manière plus précoce chez la lignée résistante. Des phénomènes de division cellulaire ont été identifiés autour du cylindre central et semblent également liés à une restriction de la propagation bactérienne. Au niveau du contenu cellulaire, une autofluorescence et une production de ROS semblent liés à une phase nécrotrophe de la bactérie lors de sa propagation dans la zone corticale de l’extrémité racinaire. L’étude de la colonisation bactérienne en s’affranchissant de l’étape de pénétration a révélé que des mécanismes de résistances peuvent intervenir au niveau de collet chez la lignée F83005.5 et lors de la colonisation racinaire des vaisseaux conducteurs suite à une inoculation avec le mutant gala7 / Manquant

Les modifications de la chromatine jouent un rôle fondamental dans le contrôle de l’expression des gènes de stress et la mise en place d’une réponse physiologique appropriée en réponse aux signaux environnementaux. Les complexes répressifs polycomb (PRC pour Polycomb Repressive Complexes), PRC1 et PRC2 permettent la répression des gènes via le dépôt des marques H3K27me3 et H2AUb. Ce projet de thèse vise à explorer le rôle de la protéine LHP1, une sous-unité du complexe PRC1 chez Arabidopsis thaliana, dans la régulation de l’homéostasie de la marque H3K27me3 et des voies de signalisation activées par les stress. Nous avons utilisé une approche intégrative pour identifier les réponses immunitaires dé-régulées dans le mutant lhp1 ; mettant ainsi en évidence le rôle de la protéine LHP1 dans la répression de la branche dépendante de MYC2 de la signalisation par l’Acide Jasmonique et l’éthylène. La perte de la protéine LHP1 induit une baisse du niveau de la marque H3K27 me3 dans le corps des gènes ANAC019 et ANAC055, ce qui augmente leur expression et la dérégulation de leurs cible, conduisant ainsi à une résistance accrue aux pucerons, ainsi qu’à une sensibilité plus importante à l’ABA et à une meilleure tolérance à la sècheresse. D’autre part, l’activation de cette voie de signalisation dans le mutant lhp1 induit une baisse d’accumulation de l’Acide Salicylique (SA), due à la dé-régulation des gènes ICS1 et BSMT1, ainsi qu’à une sensibilité accrue au pathogène hémibiotrophe Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Afin de mieux comprendre la fonction moléculaire de LHP1, nous avons étudié son interaction génétique avec l’histone déméthylase REF6. Nous avons analysé des données de ChIP-seq menées dans les mutants lhp1 et ref6 ainsi que dans le double mutant à la lumière des phénotypes développementaux et physiologiques de ces lignées, mettant ainsi en évidence le rôle complexe de LHP1 dans l’homéostasie de la marque H3K27me3. D’après ces résultats, nous proposons que d’une part, LHP1 est requise pour le recrutement d’histone méthyltransférases sur certains gènes afin de permettre le dépôt de la marque, et que d’autre part, LHP1 protège d’autre loci de l’activité de déméthylases telles que REF6. Nous avons aussi étudié les mécanismes conduisant à une augmentation des niveaux de H3K27me3 sur certains gènes dans le mutant lhp1, et montrons que LHP1 réprime le gène MEA. L’expression ectopique de ce gène dans les tissus somatiques du mutant lhp1 est probablement responsable de l’hyper-méthylation de nombreux loci. Ce groupe de gènes hyper-méthylés dans le mutant lhp1 est enrichi en gènes annotés comme étant impliqués dans les réponses immunitaires, affectant ainsi la régulation transcriptionnelle des gènes de défense, ce qui contribue à la sensibilité accrue du mutant lhp1 aux pathogènes nécrotrophes. Ainsi, nous proposons que l’homéostasie de la marque H3K27me3 est essentielle au développement harmonieux ainsi qu’aux réponses immunitaires de la plante, et que LHP1 contribue au maintien de l’équilibre entre diverses voies de réponse au stress et les processus de croissance. / Chromatin modifications and regulation play a major role in the expression of stress-responsive genes and the instauration of appropriate physiological responses to environmental cues in plants. Polycomb Repressive Complexes (PRCs), PRC1 and PRC2,are involved in the repression of protein-coding genes through the deposition of H3K27me3 and H2Aub. This thesis project explores the role of LHP1, an Arabidopsis thaliana PRC1 protein, in the regulation of H3K27me3 homeostasis and stress-responsive signaling pathways. We used an integrative approach for the identification of immune related pathways de-regulated in the lhp1 mutant, finding that LHP1 is required for the repression of the MYC2 branch of jasmonic acid (JA)/ethylene (ET) pathway of immunity. Loss of LHP1 induces the reduction in H3K27me3 levels in the gene bodies of ANAC019 and ANAC055, leading to their up-regulation and the mis-regulation of their downstream targets, increasing aphid resistance, ABA sensitivity and drought tolerance in Arabidopsis.On the other hand, the up-regulation of this pathway in lhp1 reduces Salicylic Acid (SA) content caused by a de-regulation of ICS1 and BSMT1, as well as increased susceptibility to the hemibiotrophic pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.In order to deepen our comprehension of the molecular role of LHP1, we studied the genetic interaction between this histone reader and the REF6 demethylase. We integrated ChIP-seq, developmental and physiological data of the single lhp1 and ref6 mutants, as well as their respective double mutant, finding that LHP1 plays different roles in the regulation of H3K27me3 homeostasis. Based in on our results we propose that on the one hand, LHP1 is necessary for the recruitment of histone methyltransferases to certain genes to promote the deposition of H3K27me3, while in some other targets it protects this histone mark from the demethylase activity of REF6. We also addressed the phenomenon of H3K27me3 gain in lhp1, and we provide evidence for the role of LHP1 in the repression of MEA, a gene that is de-repressed in the lhp1 mutant and may contribute to the ectopic hyper-methylation of several loci. This set of hyper-methylatedloci in lhp1 is enriched in immune-related genes, impacting the transcriptional regulation of immune responses, a process that contributes to the increased lhp1 susceptibility to necrotrophic pathogens. Therefore, we propose that H3K27me3 homeostasis is a key phenomenon behind developmental and innate immune processes in Arabidopsis, and that LHP1 plays a role as a keeper of the trade-off between diverse stress signaling pathways but also between these and developmental programs.

Les bactéries pathogènes intracellulaires manipulent les fonctions de la cellule hôte en sécrétant des facteurs de virulence (qu'on appelle effecteurs) dans le cytoplasme de la cellule infectée. Ce processus permet au pathogène de proliférer dans un environnement autrement hostile. L'identification et la caractérisation des effecteurs spécifiques des divers agents pathogènes est donc d'une importance cruciale pour contrer les infections bactériennes. Coxiella burnetii est un agent pathogène à Gram négatif de classe 3, responsable de la Fièvre Q, une zoonose qui entraîne des épidémies majeures, avec un fort impact sur l'économie et la santé. Les réservoirs naturels de Coxiella sont principalement les animaux d’élevage qui peuvent contaminer l’environnement en excrétant la bactérie principalement dans les produits de parturition, le mucus vaginal et les fèces. L’Homme s’infecte ensuite par inhalation de pseudo-spores disséminées dans l’environnement. La nature intracellulaire obligatoire de Coxiella a jusqu'ici sévèrement limité son étude et par conséquent, les facteurs de virulence bactériens impliqués dans le développement et la progression de l'infection restent encore largement inconnus. Coxiella se réplique à l'intérieur des cellules hôtes dans une grande vacuole présentant des caractéristiques autolysosomales. Le développement de la vacuole et la survie de Coxiella dans la cellule hôte sont dépendants de la translocation des effecteurs bactériens par un système de sécrétion de type 4 (SST4) Dot/Icm et de la manipulation de nombreuses voies de trafic et de signalisation de la cellule hôte par ces derniers. Notre équipe a généré et criblé la première banque de mutants par transposition de Coxiella, menant ainsi à l'identification d'un nombre important de potentiels déterminants de virulence et de protéines effectrices. Mon projet de thèse est basé sur la caractérisation de deux effecteurs de Coxiella, CvpF et AnkA, provenant de la banque de mutants générée par l’équipe. Les mutants de ces effecteurs présentent des phénotypes de défaut de réplication intracellulaire et de développement de vacuole. Ici, nous démontrons que l’effecteur CvpF est un substrat du système de sécrétion de type 4 Dot/Icm qui localise aux vacuoles contenant Coxiella (CCV). CvpF est également capable d'interagir avec Rab26, conduisant au recrutement du marqueur autophagosomal LC3B aux CCV. Les mutants de cvpF présentent un défaut de réplication in vitro et in vivo, suggérant que le détournement de l'autophagie par cet effecteur est crucial pour la virulence de Coxiella. Comme pour les mutants de cvpF, les mutants ankA présentent le même défaut de réplication in vitro et la protéine AnkA est un substrat du SST4. L'effecteur AnkA contient des motifs de répétition Ankyrin localisés sur son domaine N-terminal. La bactérie induit une hyperfusion des mitochondries de manière dépendante du SST4 et spécifique de l’effecteur AnkA. Nos résultats montrent que AnkA interagit avec Drp1, une protéine motrice impliquée dans la fission mitochondriale et que cette interaction ainsi que l’hyperfusion des mitochondries seraient dépendant du domaine contenant les répétitions Ankyrine. Le mécanisme par lequel AnkA agit sur Drp1 reste à déterminer. Cependant, les effets observés sur la mitochondrie suggèrent que la manipulation de l’organelle par la bactérie promeut le développement de la vacuole et la réplication intracellulaire du pathogène. En conclusion, notre recherche suggère fortement que de nombreux effecteurs de Coxiella manipulent les voies des cellules hôtes pour assurer le développement intracellulaire efficace de ce pathogène. / Intracellular pathogenic bacteria manipulate host cell functions by secreting virulence factors (known as effectors) into the cytoplasm of the infected cell. This process allows the pathogen to proliferate in an otherwise hostile environment. The identification and characterization of the specific effectors of the various pathogens is therefore of crucial importance to counteract bacterial infections. Coxiella burnetii is a Class 3 gram-negative pathogen that causes Q fever, a zoonosis that causes major epidemics with a high impact on the economy and health. The natural reservoirs of Coxiella are mainly farm animals that can contaminate the environment by excreting the bacteria mainly in parturition products, vaginal mucus and feces. Human is then infected by inhalation of pseudo-spores disseminated in the environment. The obligate intracellular nature of Coxiella has so far severely limited its study, and as result, bacterial virulence factors involved in the development and progression of infection remain largely unknown. Coxiella replicates within host cells in a large vacuole with autolysosomal characteristics. The development of vacuole and survival of Coxiella in the host cell depend on the translocation of bacterial effectors by the type 4 Dot / Icm secretion system (SST4B) and the manipulation of many trafficking and signaling pathways of the host cell. Our team has generated and screened the first library of Coxiella transposon mutants, leading to the identification of a significant number of candidate virulence determinants and effector proteins. My thesis project is based on the characterization of two effectors of Coxiella, CvpF and AnkA, from the mutant library generated by the team. Mutants of these effectors exhibit defect in intracellular replication and vacuole development phenotypes. Here, we demonstrate that the effector CvpF is a substrate of the SST4B that localizes to vacuoles containing Coxiella (CCV). CvpF is also able to interact with Rab26, leading to the recruitment of the LC3B autophagosomal marker to CCV. cvpF mutants exhibit in vitro and in vivo replication deficiencies, suggesting that diversion of autophagy by this effector is crucial for Coxiella virulence. As for cvpF mutants, ankA mutants show the same in vitro defect of replication and the protein AnkA is a substrate of the SST4. AnkA contains Ankyrin repetition patterns located on its N-terminal domain. The bacterium induces an AnkA-dependent hyperfusion of mitochondria. Our results show that AnkA interacts with Drp1, a motor protein involved in mitochondrial fission, and that this interaction as well as mitochondrial hyperfusion is dependent on the domain containing Ankyrin-repeat motifs. The mechanism by which AnkA acts on Drp1 remains to be determined. However, the observed effects on mitochondria suggest that the organelle's manipulation by the bacterium promotes the development of the vacuole and the intracellular replication of the pathogen. To conclude, our research strongly suggests that multiple Coxiella effectors manipulate host cell pathways to ensure the efficient intracellular development of this pathogen.

Le mildiou de la vigne, causé par le pathogène Plasmopara viticola, est une maladie cryptogamique pouvant causer de sérieux dégâts sur les récoltes. Pour éviter ces pertes, il est nécessaire de recourir à des produits phytosanitaires. Outre leur coût financier, les questions sur la santé des viticulteurs et des populations vivant à proximité des vignobles, ainsi que la protection de l’environnement ne peuvent être ignorées. Cependant, toutes les variétés de vigne ne présentent pas la même sensibilité au pathogène. En effet, bien qu’elles soient moins appréciées pour leurs qualités organoleptiques, les variétés américaines sont résistantes à cette maladie. Les combiner par croisement variétal avec des espèces européennes peut constituer une alternative viable aux traitements antifongiques. Cependant, pour piloter effacement ces problèmes de sélection variétal, il est nécessaire de mieux appréhender la relation « hôte-pathogène ». C’est dans ce but que l’analyse par spectrométrie de masse a été employée sous différents aspects / Downy mildew, caused by the Plasmopara viticola pathogen, is a fungal disease which can induce serious harvest damages. To avoid these losses, it is necessary to use phytosanitary treatments. In addition to their financial cost, winegrower’s health issues and the environment protection cannot be ignored. However, all grapevine varieties do not present the same sensitivity to the pathogen. Indeed, despite of poor organoleptic qualities, American varieties are resistant to this disease. Combining them with European species by varietal crossing may be a viable alternative to these treatments. However, to lead efficiently these cross breeding programs, it is necessary to know more about the relationship "host-pathogen". In this context, analysis by mass spectrometry has been used under different aspects

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène intracellulaire facultative responsable d’une pathologie grave, la listériose. Si de très nombreux travaux ont permis de caractériser les mécanismes de virulence de cette bactérie, il existe peu de données sur les mécanismes conduisant au portage asymptomatique de L. monocytogenes dans les hôtes mammifères. L’un de ces mécanismes pourrait être une phase de persistance intracellulaire. Lors d’infections prolongées de cellules épithéliales humaines en culture, comme des hépatocytes et des cellules de trophoblastes, L. monocytogenes change de mode de vie intracellulaire. Après la phase active de dissémination de cellule en cellule, les bactéries arrêtent de polymériser l’actine et se retrouvent piégées dans des vacuoles à simple membrane marquées par la protéine endosomale LAMP1. L’objectif de ma thèse était de caractériser ces « Listeria-Containing Vacuoles » (LisCVs). Nous avons montré que les LisCVs sont des compartiments acides, partiellement-dégradatifs, marquées par la protéase lysosomale cathépsine D. Leur formation coïncide avec la disparition du facteur de polymérisation d’actine ActA de la surface bactérienne et la capture des bactéries cytosoliques dépourvues d’actine par des membranes cellulaires. Dans ces compartiments, les bactéries entrent en croissance ralentie ; une sous-population résiste aux stress et peut survivre au-delà de trois jours d’infection. L’utilisation de la gentamicine lors du protocole d’infection n’est pas responsable de la formation des LisCVs. Cependant, cet antibiotique permet la sélection des bactéries vacuolaires, en inhibant spécifiquement la croissance des bactéries cytosoliques. La formation des LisCVs n’est pas spécifique des souches de laboratoire. Toutefois l’efficacité du phénomène pourrait diverger selon les séquençotypes des souches de L. monocytogenes. Les bactéries vacuolaires ont la capacité de sortir des vacuoles et de retourner vers un état motile et réplicatif, après le passage des cellules infectées. Lorsque l’expression du gène actA reste inactive, comme dans les mutants ∆actA, des formes de Listeria vacuolaires persistent dans les cellules hôtes dans un état viable mais non cultivable (VBNC). Ces formes VBNC peuvent être transmises au cours des divisions des cellules hôtes. L’ensemble de ces résultats révèle une nouvelle phase de persistance dans le processus infectieux intracellulaire de L. monocytogenes lors des infections prolongées de certaines cellules épithéliales. Cette propriété pourrait contribuer au portage asymptomatique de ce pathogène dans les tissus épithéliaux, allonger la période d'incubation de la listériose, et rendre les bactéries tolérantes à l’antibiothérapie. / Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogenic bacterium responsible for a serious disease, listeriosis. Although much work has been done to characterize the virulence mechanisms of this bacterium, there is little data on the mechanisms leading to the asymptomatic carriage of L. monocytogenes in mammalian hosts. One of these mechanisms could be a phase of intracellular persistence. During prolonged infections of human epithelial cells in culture, such as hepatocytes and trophoblast cells, L. monocytogenes changes its intracellular lifestyle. After the active phase of cell-to-cell spread, the bacteria stop polymerizing actin and become trapped in single-membrane vacuoles labeled with the endosomal protein LAMP1.The aim of my thesis was to characterize these "Listeria-Containing Vacuoles" (LisCVs). We have shown that LisCVs are acidic, partially degradative compartments, labeled by the lysosomal protease cathepsin D. Their formation coincides with the disappearance of actin polymerization factor ActA from the bacterial surface and the capture of actin-free cytosolic bacteria by cell membranes. In these compartments, bacterial growth is slowed; a subpopulation is resistant to stress and can survive beyond three days of infection. The use of gentamicin during the infection protocol is not responsible for the formation of LisCVs. However, this antibiotic allows selection of vacuolar bacteria, by specifically inhibiting the growth of cytosolic bacteria. The formation of LisCVs is not specific to laboratory strains. However, the efficacy of the phenomenon could diverge according to the sequence types of L. monocytogenes strains. Vacuolar bacteria have the ability to exit the vacuoles and return to a motile and replicative state during the subculture of infected cells. When expression of the actA gene remains inactive, as in ΔactA mutants, vacuolar Listeria forms persist in host cells in a viable but non-culturable (VBNC) state. These VBNC forms can be transmitted during host cell divisions. All these results reveal a new phase of persistence in the intracellular infectious process of L. monocytogenes during prolonged infections of a subset of epithelial cells. This property could contribute to asymptomatic carriage of this pathogen in epithelial tissues, extend the incubation period of listeriosis, and make bacteria tolerant to antibiotic therapy.

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire responsable de la toxoplasmose. Lors de l’infection aiguë, le parasite se divise dans une vacuole parasitophore (VP), compartiment d’interactions avec la cellule hôte. La VP se modifie pour former un kyste qui persiste au cours de la phase chronique. Le rôle des protéines de granules denses (GRA) dans ce processus est suggéré par leur abondance dans la VP et la paroi kystique. Par des approches de génétique inverse et de protéomique, le but de ce travail visait à préciser au plan moléculaire, le rôle de la protéine GRA5. En utilisant un modèle de différenciation parasitaire in vitro, l’étude des phénotypes d’un mutant invalidé du gène gra5 a permis de découvrir son rôle clé dans la formation des kystes par le maintien 1/ de l’intégrité de la membrane délimitant la VP en cours de différenciation, 2/ de l’accumulation d’autres composants parasitaires dans la VP et 3/ de son interaction avec le reticulum endoplasmique de l’hôte. / Toxoplasmosis, which is caused by the intracellular parasite Toxoplasma gondii is characterized by a life-long chronic infection. The parasites replicate inside a parasitophorous vacuole (PV), which evolves into a persistent cyst. The molecular mechanisms governing the differentiation process are poorly characterized. It is known that the dense granules proteins (GRA) are major components of both the PV and the cyst wall, enabling their interaction with the host cells. Using a Prugniaud cystogenic type II strain in which the gra5 gene was invalidated and a combination of cellular and proteomic approaches, we discovered that GRA5 regulates i) the molecular content of the PV, ii) the PV interaction with the host endoplasmic reticulum and iii) host cell homeostasis,that is necessary to ensure the formation of a stable cyst wall.

Legionella pneumophila est la bactérie responsable de la légionellose, une pneumonie atypique dans les pays industrialisés. Les souches pathogènes sont issues de notre environnement après multiplication à l’intérieur d’amibes, sont disséminées par la technologie humaine, puis peuvent infecter les macrophages alvéolaires humains. Ce travail vise à caractériser une famille d’effecteurs du système de sécrétion de type IV Dot/Icm transloqués dans le cytoplasme de la cellule hôte, des protéine kinases, et en particulier à établir le rôle de la protéine kinase LegK2 dans la virulence. L’analyse in silico et des tests de phosphorylation in vitro ont permis d’identifier 5 protéine kinases fonctionnelles, LegK1-LegK5, codées par la souche épidémique L. pneumophila Lens. Des tests de translocation ont montré qu’à l’exception de LegK5, les protéine kinases de Legionella sont transloquées dans la cellule hôte de façon Icm/Dot dépendante. LegK2 joue un rôle clé dans la virulence, comme démontré par inactivation de gène. Les vacuoles contenant le mutant legK2 présentent un recrutement moins efficace de reticulum endoplasmique, ce qui entraine une réplication intracellulaire retardée. Un mutant de substitution déficient pour l’activité kinase présente les mêmes défauts de virulence, ce qui démontre le rôle central de la phosphorylation dans le contrôle de ce processus. Les mécanismes moléculaires contrôlés par LegK2 sont actuellement recherchés par identification de partenaires et/ou substrats protéiques / Legionella pneumophila is the most common causative agent of the severe pneumony legionellosis. Legionella pathogenic strains are emerging from the environment after intracellular multiplication in amoeba, are dissiminated by water aerosols technologies, and are able to infect alveolar macrophages of human lungs. This work aims to characterize one family of effectors translocated into the host cytoplasm, namely the protein kinase family, and particularly the role of LegK2 protein kinase in virulence. In silico analysis and in vitro phosphorylation assays allowed the identification of 5 functional protein kinases LegK1-LegK5 encoded by the epidemic L. pneumophila Lens strain. Translocation assays showed that except LegK5, the Legionella protein kinases are translocated. LegK2 plays a key role in bacterial virulence, as demonstrated by gene inactivation. The legK2 mutant containing vacuoles display less efficient recruitment of endoplasmic reticulum markers, which results in delayed intracellular replication. A kinase-dead substitution mutant of legK2 exhibits the same virulence defects. Molecular mechanisms controled by LegK2 have been investigated by searching LegK2 partner and substrate proteins

La multi-résistance aux drogues des bactéries est un problème majeur en clinique. L’un des mécanismes de résistance consiste à effluer les composés toxiques hors de la cellule grâce à des protéines de la membrane interne nommées pompes d’efflux. Ces protéines appartiennent à cinq familles (MFS, RND, MATE, SMR et ABC) et peuvent fonctionner en association avec deux autres types de protéines (protéine du périplasme et protéine de la membrane externe) pour former un canal. Dans le cadre d’une thématique de recherche basée sur l’étude des mécanismes de résistance auxdrogues de la bactérie pathogène Legionella pneumophila, une approche bioinformatique menée sur lesgénomes de trois souches séquencés (souches Lens, Paris et Philadelphia) a permis d’identifier des protéinespouvant participer à l’efflux. Notre but a été de vérifier l’implication de ces protéines dans la résistance auxdrogues et dans la virulence de Legionella en ciblant un ou plusieurs gènes codant pour des composants desystèmes d’efflux. Pour inactiver les gènes, nous avons choisi une stratégie de recombinaison homologue. Lesrecombinants ont été testés pour leur sensibilité à des composés toxiques afin de voir si les gènes ciblés jouentun rôle dans l’efflux d’E. coli. Un de ces mutants, le mutant MF201, altéré pour le gène codant pour une protéinehomologue à TolC chez E. coli s’est avéré être 2 à 16 fois plus sensible aux drogues testées comparé à lasouche sauvage. De plus, ce mutant présente un défaut important de virulence dans Acanthamoeba castellanii,Dictyostelium discoideum et les macrophages U937. Ce premier résultat implique que la protéine TolC-like deLegionella aurait un rôle clef dans la relation hôte pathogène et sous-tend un lien entre multi-résistance auxdrogues et virulence. Par ailleurs une étude de l’expression des gènes codant pour des pompes à efflux a étéinitiée afin de comprendre leur rôle au cours du cycle infectieux de Legionella. / Bacterial multi-drug resistance is of major concern in the case of clinic. One of the resistance mecanisms used by bacteria is the efflux of noxious compounds out of the cell thanks to inner membran proteins called efflux pumps. This proteins belong to five families (MFS, RND, MATE, SMR and ABC) and can function in close association with two partners (periplasmic protein and outer membrane protein) to form a canal. In our new research axis based on the study of the drug resistance of the bacterium Legionella pneumophila, we conducted a bioinformatical approach to identify efflux pumps proteins coded by the sequenced genome of three strains (strains Lens, Paris and Philadelphia). Our goal was to study the role of this proteins in Legionella drug resistance and in its virulence. The bioinformatic approach data allowed us to choose one or several genes coding for potential efflux pump components for genetic invalidation by an homologousrecombination strategy. The bacterial mutants were exposed to different noxious compounds in order to know ifthe target genes invalidated were implicated in the efflux of drugs. One of this mutants, strain MF201, which isdeleted for the gene encoding a protein homologous to E. coli TolC protein, revealed to be 2 to 16 times moresensitive to the drug tested compared to the wild-type strain. Furthermore, this mutant showed an importantvirulence defect in Acanthamoeba castellanii, Dictyostelium discoideum and U937 macrophages. This first resultsmeans that the TolC-like protein of Legionella could be a key factor in host-pathogen interaction and stronglysuggests a link between multi-drug resistance and virulence. We also initiated a transcriptomic approach to studyefflux pump genes expression in order to understand their role during the infectious cycle of Legionella.