Epilepsia é um grupo de desordens neurológicas caracterizada por crises epilépticas recorrentes não provocadas, afligindo 50 milhões de pessoas no mundo. Embora grande parte dos casos possa ser controlada através de medicação um número significativo de pacientes torna-se refratários apesar do tratamento com drogas anticonvulsivantes. Apesar do desenvolvimento bemsucedido de várias novas drogas antiepilépticas, a busca por novas terapias com maior eficácia e tolerabilidade ainda permanece um objetivo importante. O modelo de epilepsia induzido por pilocarpina tem sido amplamente utilizado em roedores para o estudo da patogênese da epilepsia do lobo temporal. Embora estes estudos com modelos animais tenham aumentado nossa compreensão das bases patológicas da epilepsia, os complexos mecanismos epileptogênicas e a geração de crises epilépticas ainda não foram completamente elucidados. Ultimamente, foram desenvolvidos estudos avaliando as características comportamentais de peixe-zebra e peixe-zebra (Danio rerio). Esse vertebrado é um modelo experimental que vem se consolidando em áreas da ciência por ter características bastante atrativas como pequeno custo e espaço requerido para manutenção, homologia genética e anatômica tornando-se de grande valia para uma maior compreensão dos mecanismos envolvidos nas crises epilépticas. A partir disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar e caracterizar comportalmentalmente as crises epilépticas induzidas por pilocarpina em peixezebra adulto. Para isso, os animais foram pré-tratados com uma curva de concentrações de pilocarpina nas doses de 150, 200, 300, 350 e 400 mg/Kg e filmados por 30 minutos. Com a maior dose foi observado um perfil claro de crise tônico-clônica. O uso do anticonvulsivo escopolamina na dose de 1mg/Kg, ip, 30 minutos antes da aplicação de PILO na maior concentração 400mg/Kg mostrou-se capaz de prevenir a crise tônico-clônica induzida pela PILO. A avaliação comportamental pós-crise foi realizada no aparato open-tank três dias após a crise quando os animais foram filmados por 6 minutos. Foram analisados distância percorrida, tempo móvel, tempo no topo e tempo no fundo. Os resultados deste estudo permitiram uma caracterização temporal das manifestações comportamentais das crises epliepticas em peixe-zebra adulto induzidas por diferentes concentrações de pilocarpina. / Epilepsy is a group of neurological disorders characterized by recurrent seizures. It affect about 50 million people worldwide, therefore a public health problem of great importance. While most cases can be controlled through medication, a significant number of patients continue to have seizures despite treatment with anticonvulsant drugs. Despite the successful development of several new antiepileptic drugs, the search for new and more effective therapies and greater tolerability remains an important goal. The pilocarpine model has been extensively used in rodents for the study of neural molecular cascades and mechanisms involved in the pathogenesis of temporal lobe epilepsy. Although studies with animal models have increased our understanding of the pathological bases of epilepsy, the epileptogenic complex mechanisms and the generation of epileptic seizures have not yet been fully elucidated. Lately, studies evaluating behavioral characteristics of zebrafish (Danio rerio) were developed. This vertebrate is an experimental model that has been consolidated in various areas of science for having very attractive features as small cost and space requirements for maintenance, rapid development and life cycle, large offspring, translucent embryos and susceptibility to manipulation and microinjection. Hence, the use of new models becomes of huge value to a greater understanding of the mechanisms involved in this pathology and thus the zebrafish emerges as a complementary alternative for the study of seizures and epilepsy. This study aimed to evaluate and characterize the seizures induced by pilocarpine in adult zebrafish. First, animals were treated with a pilocarpine at different concentrations (150, 200, 300 and 400 mg/kg) and filmed for 30 minutes. Tonic-clonic seizures were observed in the higher dose. When scopolamine, an anticholinergic anticonvulsant, was injected 30 minutes before the higher dose treatment, the pilocarpine-induced seizure was prevented. The post seizure behavioral evaluation was performed in the opentank apparatus three days after injection and filmed for 6 minutes. Measures analyzed in open-tank were distance traveled, moving time and time at the top and in the background. Taken together, our results allowed a temporal characterization of the seizures behavioral manifestations induced by different concentrations of pilocarpine in adult zebrafish.

Introdução: Os ovos de Zebrafish que não são fertilizados podem ser uma fonte de alimento para o peixe. O objetivo deste estudo é avaliar a influência do acesso aos ovos de Zebrafish no Índice de Massa Corporal, níveis séricos de colesterol e triglicérides e acúmulo de gordura no hepatócito. Materiais e métodos: Zebrafish adultos de ambos sexos foram divididos em dois grupos: grupo 1 com acesso livre aos próprios ovos e grupo 2 com o fundo do aquário coberto de bolas de vidro para evitar o acesso aos ovos por duas semanas. Para a coleta de sangue, ambos os grupos foram mantidos em jejum pelo período de 24 horas antes da coleta. O IMC foi medido em gramas por centímetro quadrado (g/cm²). Para coletar as amostras sanguíneas, os animais foram anestesiados e uma incisão, anterior a cauda, foi realizada para acessar a veia dorsal. Uma pipeta automática foi utilizada para coletar o sangue que foi centrifugado obtendo soro para análises. Os níveis séricos de triglicérides e colesterol foram analisados com testes colorimétricos. O fígado foi coletado para análise histológica. O n utilizado foi 4 para cada grupo. Para as análises bioquímicas foram utilizados pools de 10 peixes. Resultados: Os resultados estão expressos em média ± erro padrão. Não houve diferença significativa no IMC (grupo 1 0,037 ± 0,009 g/cm² e grupo 2 0,035 ± 0,008 g/cm²) nem nos níveis de colesterol (colesterol total: grupo 1 362 ± 73 mg/dL e grupo 2 357 ± 23 mg/dL; HDL – colesterol: grupo 1 91,22 ± 1,79 grupo 2 72,14 ± 2,89; LDL – colesterol: grupo 1 55,68 ± 10,88 grupo 2 44,18 ± 9,84 ). No entanto, houve diferença significativa nos níveis de triglicérides séricos (grupo 1 457 ± 43 mg/dL e grupo 2 292 ± 111 mg/dL P=0,03). Não foi observado acúmulo de lipídeos nos hepatócitos. Conclusões: O acesso aos próprios ovos alterou os níveis de triglicérides sem modificar os níveis de colesterol, alterar o IMC nem acumular gordura nos hepatócitos. / Introduction: The Zebrafish eggs that are not fertilized can be a food source for the fish. The aim of this study was to measure the influence of accessing eggs in Body Mass Index, cholesterol and triglycerides serum levels and lipid accumulation in hepatocyte of Zebrafish. Material and Methods: Adult Zebrafish of both genders were divided into two groups: group 1 free access to their own eggs and group 2 with the bottom of the aquarium filled with glass balls to prevent them to access their eggs for two weeks. To the blood collection, both groups were kept fasting for 24 hours before the blood collection. The body mass index (BMI) was measure in gram per square centimeter (g/cm²). To collect the blood samples, animals were anesthetized and an incision was made before the tail to access the dorsal vein. We used an automatic pipette to collect the blood. It was centrifuged and serum was obtained for analysis. Triglycerides and cholesterol seric levels were analyzed with colorimetric tests. The liver was collected to histological analysis. The n used was 4 for each group. Pools with serum of 10 animals were used to biochemical analysis. Results: The results are expressed in mean ± standard error. There was no significant difference in BMI (group 1 0,037 ± 0,009 g/cm² and group 2 0,035 ± 0,008 g/cm²) neither in cholesterol levels (total cholesterol: group 1 362 ± 73 mg/dL and group 2 357 ± 23 mg/dL; HDL – cholesterol: group 1 91,22 ± 1,79 group 2 72,14 ± 2,89; LDL – cholesterol: group 1 55,68 ± 10,88 group 2 44,18 ± 9,84 ). However, there was a significant difference in triglycerides levels (group 1 457 ± 43 mg/dL and group 2 292 ± 111 mg/dL P=0,03). Lipid accumulation was not observed in hepatocytes. Conclusion: Having access to eggs seams to influence the Zebrafish´s triglycerides serum levels without modifying the BMI and cholesterol serum levels neither lipid accumulation in hepatocytes.

O pentilenotetrazol (PTZ) é um agente convulsivo amplamente utilizado em modelos animais para investigações envolvendo crises convulsivas. Embora haja um crescente número de estudos envolvendo zebrafish adulto e convulsão, não há até o momento uma caracterização comportamental detalhada do modelo de indução de crises por PTZ neste animal. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização detalhada das manifestações comportamentais no modelo de convulsão induzida por PTZ em zebrafish adulto. Grupos de 12 animais foram submetidos, por imersão, a distintas diferentes concentrações de PTZ (5, 7.5, 10 e 15 mM). O comportamento convulsivo foi observado durante 20 minutos. Os animais apresentaram os seguintes escores comportamentais: (0) nados curtos; (1) aumento na atividade natatória e na abertura opercular; (2) movimentos erráticos e acelerados; (3) movimentos circulares; (4) convulsão clônica; (5) convulsão tônica; (6) morte. Os animais expostos a diferentes distintas concentrações de PTZ apresentaram diferentes distintos perfis convulsivos, intensidades de convulsão e latência para chegar aos escores. Apenas os animais imersos na concentração de 15 mM apresentaram maior tempo para retornar ao comportamento normal após a exposição ao PTZ. A mortalidade foi de 33% e 50% para as concentrações de 10 mM e 15 mM, respectivamente. No intuito de avaliar abordagem perfil comportamental frente ao pré-tratamento de um fármaco anticonvulsivo, 12 animais foram expostos a diazepam (DZP) por 40 min e após expostos ao PTZ (10 mM). O tratamento com DZP atenuou a severidade da convulsão, mas não o tempo necessário para retornar ao comportamento normal. Levando em consideração que este modelo baseia-se na imersão direta do animal a uma solução de PTZ, avaliamos também as concentrações cerebrais deste agente convulsivo. Além disso, investigamos também uma possível correlação entre a concentração cerebral de PTZ, o tempo e a concentração de exposição. Os resultados decorrentes da exposição dos animais a 5 e 10 mM de PTZ, apontam para uma correlação tempo e concentração dependentes. Os resultados deste trabalho demonstram uma caracterização comportamental detalhada ao longo do tempo de exposição ao PTZ, além de avaliar pela primeira vez a intensidade de convulsão, tempo de retorno ao comportamento normal e mortalidade dos animais. Além disso, pela primeira vez foram determinadas as concentrações cerebrais deste composto neste modelo de convulsão em zebrafish adulto. Por fim, espera-se que tais ferramentas comportamentais e de quantificação cerebral deste composto possam ser úteis em futuras investigações translacionais e estudos que tenham como objetivo melhor compreender esta desordem. / Pentylenetetrazole (PTZ) is a common convulsant agent used in animal models to investigate the mechanisms of seizures. Although adult zebrafish have been recently used to study epileptic seizures, a thorough characterization of the PTZ-induced seizures in this animal model is missing. The goal of this study was to perform a detailed temporal behavior profile characterization of PTZ-induced seizure in adult zebrafish. The behavioral profile during 20 min of PTZ immersion (5, 7.5, 10, and 15 mM) was characterized by stages defined as scores: (0) short swim, (1) increased swimming activity and high frequency of opercular movement, (2) erratic movements, (3) circular movements, (4) clonic seizure-like behavior, (5) fall to the bottom of the tank and tonic seizure-like behavior, (6) death. Animals exposed to distinct PTZ concentrations presented different seizure profiles, intensities and latencies to reach all scores. Only animals immersed into 15 mM PTZ showed an increased time to return to the normal behavior (score 0), after exposure. Total mortality rate at 10 and 15 mM were 33% and 50%, respectively. Considering all behavioral parameters, 5, 7.5, 10, and 15 mM PTZ, induced seizures with low, intermediate, and high severity, respectively. Pretreatment with diazepam (DZP) significantly attenuated seizure severity. Finally, the brain PTZ levels in adult zebrafish immersed into the chemoconvulsant solution at 5 and 10 mM were comparable to those described for the rodent model, with a peak after a 20-min of exposure. The PTZ brain levels observed after 2.5-min PTZ exposure and after 60-min removal from exposure were similar. Altogether, our results showed a detailed temporal behavioral characterization of a PTZ epileptic seizure model in adult zebrafish. These behavioral analyses and the simple method for PTZ quantification could be considered as important tools for future investigations and translational researches.

O enriquecimento ambiental oferece estímulos sensoriais, sociais e cognitivos possibilitando ao animal bem-estar e comportamentos mais próximos ao seu natural. Alterações ambientais podem gerar mudanças de expressão gênica, bem como de comportamento. Assim, o primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de diferentes protocolos de enriquecimento ambiental sobre o perfil comportamental do peixe-zebra (Danio rerio) adulto. Utilizando pedras ao fundo do aquário, plantas artificiais e os animais em cardume, foram montados três protocolos de enriquecimento ambiental. O “Protocolo 1” foi desenhado para avaliar se um ambiente enriquecido com os componentes básicos de complexidade por sete dias já induziria alterações no comportamento do peixe-zebra. Os resultados obtidos com o teste de open tank demonstraram que os animais do grupo ambiente enriquecido (AE) apresentaram um perfil locomotor diferenciado, com redução de distância percorrida total e velocidade média, quando comparado com animais do grupo ambiente padrão (AP). Entretanto, esta diferença se deve a uma instabilidade comportamental apresentada pelo grupo AP através do aumento de distância percorrida no fundo do aquário. Não foram observadas alterações no comportamento tipo ansiedade e preferência social entre os grupos. Desse modo, desenhamos o “Protocolo 2” a fim de avaliar se a reposta comportamental se manteria durante uma exposição mais longa (quatorze dias) ao enriquecimento ambiental. Entretanto, a diferença no perfil locomotor entre os grupos não foi apresentada neste protocolo. Com esses resultados, demonstrou-se a intensidade do estresse provocado pela simples troca entre aquários idênticos utilizados normalmente em biotérios, necessitando uma ambientação mínima de duas semanas no aquário moradia antes da realização de testes comportamentais Por último, realizamos a avaliação do “Protocolo 3”, com o intuito de estudar se a renovação de itens da complexidade do enriquecimento ambiental dentro do período quatorze dias teria alteração nos resultados já observados. Os animais do grupo AE não apresentaram diferença no perfil comportamental geral mesmo com a inserção de novos objetos, entretanto, houve uma redução de distância percorrida no fundo do aparato. Em peixe-zebra, estudos já demonstraram a indução da plasticidade neuronal e aumento na proliferação neuronal quando submetidos a protocolos de enriquecimento. No modelo de roedores, muitos dos efeitos do enriquecimento ambiental são relacionados ao aumento de neurogênese adulta e de ramificação dendrítica, bem como alteração da funcionalidade de alguns sistemas de neurotransmissores, como o glutamatérgico. Assim, a segunda parte dessa dissertação teve como objetivo a análise da expressão proteica de um dos transportadores vesiculares de glutamato, o vGluT2, em animais expostos aos protocolos citados anteriormente Os vGluTs são expressos em regiões dendríticas dos neurônios e quanto maior sua expressão proteica, maior é a densidade de vesículas sinápticas presentes. Os dados obtidos demonstram que essa resposta é relacionada a consolidação e habituação dos peixes a essa condição por um período mais prolongado no protocolo de enriquecimento ambiental (Protocolo 2). Neste trabalho, foi demonstrado que o protocolo de enriquecimento ambiental altera a resposta comportamental do peixe-zebra adulto, mantendo-a mais regular do que a dos controles e isso, provavelmente, é decorrente da estimulação de processos direcionados a resposta ao estresse da novidade, bem como de vias relacionadas com a adaptabilidade. Ademais, demonstramos que a habituação por um protocolo mais longo à condição de um ambiente enriquecido é mais importante para desencadear o aumento de expressão proteica de vGluT2 em cérebro de peixe-zebra. / Environmental enrichment offers social, sensory and cognitive stimuli making possible animal welfare and behavior closer to its natural. Environmental alterations can generate changes in gene expression as well as in behavior. Thus, first aim of this study was to evaluate the influence of different environmental enrichment protocols in adult zebrafish’s (Danio rerio) behavioral profile. Considering items more commonly described in the literature (stones at tank bottom, artificial plants and shoal), we designed three enriched environment protocols. “Protocol 1” was developed to evaluate if an enriched environment with basics components of complexity for seven days already induce behavior alterations in zebrafish. Results obtained with open tank test demonstrated that animals submitted to environmental enrichment (EE) presented differentiated locomotor profile by a reduction of total distance travelled and average speed when compared with animals in the standard environment (SE). However, this difference was due to a behavioral instability presented by animals of SE group reflected in an increase of distance travelled in last two minutes of the test. There were not alterations in anxiety-like behavior and social preference between the groups. In this way, the “Protocol 2” was designed to evaluate whether these behavioral responses in open tank test remain in a longer exposure (fourteen days) to environmental enrichment. However, the difference in locomotor profile was not significant between groups. With the results of these two first protocols, the intensity of stress provoked by a simple change of equal tanks, normally utilized in facilities, was demonstrated. This also presented the necessity of a minimum of two weeks of habituation in home tank, before conducting any behavioral test Finally, we realized the evaluation of “Protocol 3” in order to study if a renovation of enriched environment items of complexity within the period of fourteen days would change results already observed. Animals of EE group showed no difference in general behavioral profile even with the insertion of new objects in environment, similarly to that observed in Protocol 2, however a reduction of distance travelled was presented by these animals, reflecting a little of Protocol 1. In zebrafish, some studies have already demonstrated the induction of neuronal plasticity and increase of neuronal proliferation when animals were submitted to enriched environment protocols. In rodent models, many of effects of environmental enrichment are related to increased adult neurogenesis and dendritic branching, as well as alteration of functionality of some neurotransmitter system was known – like glutamatergic. Thus, second part of this dissertation had as objective the analyses of protein expression of one of the vesicular glutamate transporter (vGluT), the vGluT2, in those three enriched environment protocols cited previously by Western Blotting technique The vGluTs were expressed in neuronal dendritic regions and more its expression, more density of synaptic vesicles presents in analyzed region. Data obtained demonstrated that the increase of immunocontent of vGluT2 is related with consolidation and habituation of fish to this condition for a longer period in environmental enrichment (Protocol 2). In this study, there was demonstrated that environmental enrichment alters the adult zebrafish’s behavioral response, keeping it more regular than the control group (SE) and, probably, this is due to stimulation of process directed to stress response of novelty as well as of pathways related to adaptability. In addition, we have demonstrated that habituation to the condition by a longer protocol of enriched environment is more important to trigger the increase of vGluT2 protein expression in total brain of adult zebrafish.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-15T17:11:45Z No. of bitstreams: 1 2017_PaolinRocioCáceresVélez.pdf: 6744794 bytes, checksum: c2635fa46c76e0021861f2ba5269f45c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-05-16T19:32:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_PaolinRocioCáceresVélez.pdf: 6744794 bytes, checksum: c2635fa46c76e0021861f2ba5269f45c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-16T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_PaolinRocioCáceresVélez.pdf: 6744794 bytes, checksum: c2635fa46c76e0021861f2ba5269f45c (MD5) Previous issue date: 2017-05-16 / A produção e o amplo uso de nanomateriais como as nanopartículas de prata (AgNP) resultam no contato inevitável com o meio ambiente. Em ambientes naturais, as AgNP também podem formar sedimentos por adsorção com matéria orgânica, como o ácido húmico (AH), alterando a sua biodisponibilidade e toxicidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento físico-químico das AgNP na presença do AH em diferentes meios aquosos (água ultrapura-MQ, água do sistema de manutenção do zebrafish- SIST e água reconstituída-REC) e avaliar os efeitos toxicológicos, em embriões e peixes adultos de zebrafish (Danio rerio), das AgNP na presença e ausência do AH. As AgNP com sem a presença de AH foram caracterizadas por espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), difração de raios X (DRX), espectroscopia no infravermelho por reflectância total atenuada (FTIR-ATR) e espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS). Embriões (n=20/grupo) com 2 horas pós-fertilização (hpf) foram expostos a AgNP (0; 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4,75; 6,5; 8,5 e 10 mg/L), com e sem a presença de AH (20 mg/L), para determinar a CL50 e avaliar o desenvolvimento embrionário durante 96 horas. Após 96 hpf, as larvas foram coletadas para analisar a incorporação de prata por ICP-MS. Por outro lado, peixes adultos (n=7/grupo) foram expostos a 0, 10, 20, 30, 40 e 60 mg/L de AgNP, com e sem AH (20 mg/L). Após 96h de exposição, foi determinada a CL50, os peixes adultos foram eutanizados a fim de coletar eritrócitos de sangue periférico para o teste de cometa, micronúcleo - MN e anormalidades nucleares - AN. As brânquias, fígado e intestino dos peixes foram coletados para análises histopatológicas por microscopia de luz e para avaliação da biodistribuição da prata por ICP-MS. Na análise por TEM observou-se que as AgNP têm formato variável e irregular, com diâmetro médio 26±16 nm. A complexação do AH com as AgNP (AgNP+AH) foi observada por ATR-FTIR e corroborada por TEM e XPS. As análises de XPS indicaram também que a superfície das AgNP suspendidas em água MQ e SIST não foi oxidada (Ag0) pela presença do AH, mas a superfície das AgNP suspendidas em água REC com a presença do AH foi oxidada para Ag3+. A CL50 calculada para embriões de zebrafish expostos a AgNP foi de 1,19 mg/L AgNP, enquanto que para os expostos a AgNP na presença de AH a CL50 foi de 3,56 mg/L AgNP. As larvas expostas a AgNP apresentam fenótipos com atraso no desenvolvimento (p≤0,05) em concentrações maior ou igual a 1 mg/L de AgNP, incluindo baixa viabilidade, edema generalizado, atraso na eclosão e absorção do saco vitelínico. Alterações no equilíbrio e edema cardíaco foram estatisticamente diferentes em concentrações acima de 0,25 e 0,5 mg/L AgNP, respectivamente. As malformações observadas foram estatisticamente significativas em concentrações de 1 e 1,5 mg/L de AgNP. Em contraste, os embriões expostos a AgNP na presença de AH mostraram uma diminuição significativa na frequência de todas as alterações mencionadas anteriormente. Nos testes in vivo com zebrafish adultos, os valores da LC50 para peixes expostos a AgNP foi de 25,0 mg/L e para os grupos expostos a AgNP com AH foi de 40,56 mg/L. A fragmentação do DNA, avaliada pelo teste de cometa e MN, não foi estatisticamente significativa (p>0,05) para os grupos expostos a 10, 20, 30 mg/L de AgNP, com ou sem a presença de AH, quando comparados com o grupo controle. Em contraste, o teste de AN mostrou diferenças significativas na frequência de células binucleadas. Apesar da presença de algumas alterações histológicas nas brânquias tais como hipertrofia de células de cloro e células epiteliais lamelares, levantamento do epitélio lamelar, hiperplasia de células mucosas, fusão lamelar e aneurismas, não houve diferenças estatisticamente significativas tanto para os peixes expostos às AgNP quanto para os expostos às AgNP+AH, quando comparado com o grupo controle. No fígado e intestino dos peixes expostos a AgNP e AgNP+AH não foram observadas alterações histológicas não obstante a análise por EDX indicou a presença de prata no lúmen intestinal. Embora os biomarcadores genotóxicos e histopatológicos não apresentaram diferenças significativas entre os grupos expostos (AgNP e AgNP+AH), o aumentos nos valores da CL50 do grupo AgNP+AH (quando comparada com a CL50 do grupo exposto a AgNP) pode estar relacionada com a presença do AH na água. Considerando os resultados obtidos no nosso estudo, a toxicidade e biodisponibilidade das AgNP pode diminuir em ambientes aquáticos contendo AH, devido ao AH através dos seus grupos carboxílicos e fenólicos podem formar complexos fortes com as AgNP. Assim, a presença de ácido húmico em ambientes aquáticos aparece como um atenuador/remediador natural da água poluída com nanopartículas de prata. / The extensive production and use of nanomaterials, such as silver nanoparticles (AgNP), result in their inevitable release into the environment which may harm some organisms. Moreover, nanoparticles can also form sediments by adsorption with natural organic matter (NOM), such as humic acid (HA), changing their bioavailability and toxicity. The aim of this work is to evaluate the physical-chemical behavior of AgNP in different aqueous medium (ultrapure water-UPW, zebrafish facility water-ZFW and zebrafish growing media-ZGM) and to assess their toxicological effects in embryos and adult zebrafish (Danio rerio). The study was carried out both in presence (AgNP+HA) and absence of HA in order to investigate the interaction this NOM on the AgNP. All materials were characterized by dynamic light scattering (DLS), transmission electron microscopy (TEM), x-ray diffraction (XRD), attenuated total reflectance infrared spectroscopy (FTIR-ATR) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). In order to calculate the LC50 and to assess the embryo-larval toxicity, two hours post-fertilization (hpf) zebrafish embryos (n=20/group) were exposed during 96 hours to AgNP (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4.75, 6.5, 8.5, and 10 mg/L) both with and without the presence of HA (20mg/L). After 96 hpf, zebrafish larvae were collected to analyze silver uptake. Additionally, adult fish were exposed for 96h to 0, 10, 20, 30, 40 and 60 mg/L of AgNP, with and without HA (20 mg/L). The LC50 was calculated and fish (n=7/group) were euthanized to collect peripheral blood erythrocytes for comet assay, micronucleus (MN), and nuclear abnormalities (NA) tests. Gills, livers, and intestines were collected for biodistribution and histopathological assessment. TEM analysis showed that AgNP have variable and irregular shape, with an average diameter of 26±16 nm. The complexation of HA with AgNP (AgNP+HA) was observed by FTIR-ATR analysis and corroborated by TEM and XPS. XPS assays also indicated that the surface of AgNP suspended in UPW and ZGM was not oxidized (Ag0) by the presence of HA, but the surface of AgNP suspended in ZGM with the presence of HA was oxidized to Ag3+. The calculated LC50 for zebrafish embryos exposed to AgNP was 1.19 mg/L, while the LC50 for AgNP+HA was 3.56 mg/L. The larvae exposed to AgNP displayed developmental delay phenotypes (p≤0.05) with concentrations of at least 1 mg/L AgNP, including lower viability, generalized edema, delays in hatching and yolk sac absorption. Alterations in body balance and cardiac edema were statistically different at concentrations above 0.25 and 0.5 mg/L, respectively. Observed malformations were statistically significants at 1 and 1.5 mg/L of AgNP. In contrast, embryos exposed to AgNP+HA showed a significant decrease in the frequency of the aformentioned alterations. The LC50 value for adult zebrafish exposed to AgNP was 25.0 mg/L, while for groups exposed to AgNP+HA was 40.56 mg/L. DNA fragmentation was not statistically significant (p>0.05) for groups exposed to 10, 20, 30 mg/L of AgNP with or without HA, when compared with the control group. In contrast, NA test showed significant differences of binucleated cells when compared with the control group. Although some gill histological alterations were observed (chloride cell and lamellar epithelial cell hypertrophy, lamellar epithelial lifting, mucosal cell hyperplasia, lamellar fusion, and aneurysms), there were no statistically significant differences for both AgNP and AgNP+HA when compared with the control group. EDX analysis showed the presence of AgNP in the intestinal lumen, but no histological changes were observed in the intestine and liver of fish exposed to AgNP and AgNP+HA. Considering the results obtained in our study, the toxicity and bioavailability of AgNP in zebrafish can decrease in environments with HA, since HA can form strong complexes between its carboxylic and phenolic groups with the AgNP. Thus, the presence of humic acid in aquatic environments appears as a natural attenuator/remediator of water polluted with silver nanoparticles.

O enriquecimento ambiental oferece estímulos sensoriais, sociais e cognitivos possibilitando ao animal bem-estar e comportamentos mais próximos ao seu natural. Alterações ambientais podem gerar mudanças de expressão gênica, bem como de comportamento. Assim, o primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de diferentes protocolos de enriquecimento ambiental sobre o perfil comportamental do peixe-zebra (Danio rerio) adulto. Utilizando pedras ao fundo do aquário, plantas artificiais e os animais em cardume, foram montados três protocolos de enriquecimento ambiental. O “Protocolo 1” foi desenhado para avaliar se um ambiente enriquecido com os componentes básicos de complexidade por sete dias já induziria alterações no comportamento do peixe-zebra. Os resultados obtidos com o teste de open tank demonstraram que os animais do grupo ambiente enriquecido (AE) apresentaram um perfil locomotor diferenciado, com redução de distância percorrida total e velocidade média, quando comparado com animais do grupo ambiente padrão (AP). Entretanto, esta diferença se deve a uma instabilidade comportamental apresentada pelo grupo AP através do aumento de distância percorrida no fundo do aquário. Não foram observadas alterações no comportamento tipo ansiedade e preferência social entre os grupos. Desse modo, desenhamos o “Protocolo 2” a fim de avaliar se a reposta comportamental se manteria durante uma exposição mais longa (quatorze dias) ao enriquecimento ambiental. Entretanto, a diferença no perfil locomotor entre os grupos não foi apresentada neste protocolo. Com esses resultados, demonstrou-se a intensidade do estresse provocado pela simples troca entre aquários idênticos utilizados normalmente em biotérios, necessitando uma ambientação mínima de duas semanas no aquário moradia antes da realização de testes comportamentais Por último, realizamos a avaliação do “Protocolo 3”, com o intuito de estudar se a renovação de itens da complexidade do enriquecimento ambiental dentro do período quatorze dias teria alteração nos resultados já observados. Os animais do grupo AE não apresentaram diferença no perfil comportamental geral mesmo com a inserção de novos objetos, entretanto, houve uma redução de distância percorrida no fundo do aparato. Em peixe-zebra, estudos já demonstraram a indução da plasticidade neuronal e aumento na proliferação neuronal quando submetidos a protocolos de enriquecimento. No modelo de roedores, muitos dos efeitos do enriquecimento ambiental são relacionados ao aumento de neurogênese adulta e de ramificação dendrítica, bem como alteração da funcionalidade de alguns sistemas de neurotransmissores, como o glutamatérgico. Assim, a segunda parte dessa dissertação teve como objetivo a análise da expressão proteica de um dos transportadores vesiculares de glutamato, o vGluT2, em animais expostos aos protocolos citados anteriormente Os vGluTs são expressos em regiões dendríticas dos neurônios e quanto maior sua expressão proteica, maior é a densidade de vesículas sinápticas presentes. Os dados obtidos demonstram que essa resposta é relacionada a consolidação e habituação dos peixes a essa condição por um período mais prolongado no protocolo de enriquecimento ambiental (Protocolo 2). Neste trabalho, foi demonstrado que o protocolo de enriquecimento ambiental altera a resposta comportamental do peixe-zebra adulto, mantendo-a mais regular do que a dos controles e isso, provavelmente, é decorrente da estimulação de processos direcionados a resposta ao estresse da novidade, bem como de vias relacionadas com a adaptabilidade. Ademais, demonstramos que a habituação por um protocolo mais longo à condição de um ambiente enriquecido é mais importante para desencadear o aumento de expressão proteica de vGluT2 em cérebro de peixe-zebra. / Environmental enrichment offers social, sensory and cognitive stimuli making possible animal welfare and behavior closer to its natural. Environmental alterations can generate changes in gene expression as well as in behavior. Thus, first aim of this study was to evaluate the influence of different environmental enrichment protocols in adult zebrafish’s (Danio rerio) behavioral profile. Considering items more commonly described in the literature (stones at tank bottom, artificial plants and shoal), we designed three enriched environment protocols. “Protocol 1” was developed to evaluate if an enriched environment with basics components of complexity for seven days already induce behavior alterations in zebrafish. Results obtained with open tank test demonstrated that animals submitted to environmental enrichment (EE) presented differentiated locomotor profile by a reduction of total distance travelled and average speed when compared with animals in the standard environment (SE). However, this difference was due to a behavioral instability presented by animals of SE group reflected in an increase of distance travelled in last two minutes of the test. There were not alterations in anxiety-like behavior and social preference between the groups. In this way, the “Protocol 2” was designed to evaluate whether these behavioral responses in open tank test remain in a longer exposure (fourteen days) to environmental enrichment. However, the difference in locomotor profile was not significant between groups. With the results of these two first protocols, the intensity of stress provoked by a simple change of equal tanks, normally utilized in facilities, was demonstrated. This also presented the necessity of a minimum of two weeks of habituation in home tank, before conducting any behavioral test Finally, we realized the evaluation of “Protocol 3” in order to study if a renovation of enriched environment items of complexity within the period of fourteen days would change results already observed. Animals of EE group showed no difference in general behavioral profile even with the insertion of new objects in environment, similarly to that observed in Protocol 2, however a reduction of distance travelled was presented by these animals, reflecting a little of Protocol 1. In zebrafish, some studies have already demonstrated the induction of neuronal plasticity and increase of neuronal proliferation when animals were submitted to enriched environment protocols. In rodent models, many of effects of environmental enrichment are related to increased adult neurogenesis and dendritic branching, as well as alteration of functionality of some neurotransmitter system was known – like glutamatergic. Thus, second part of this dissertation had as objective the analyses of protein expression of one of the vesicular glutamate transporter (vGluT), the vGluT2, in those three enriched environment protocols cited previously by Western Blotting technique The vGluTs were expressed in neuronal dendritic regions and more its expression, more density of synaptic vesicles presents in analyzed region. Data obtained demonstrated that the increase of immunocontent of vGluT2 is related with consolidation and habituation of fish to this condition for a longer period in environmental enrichment (Protocol 2). In this study, there was demonstrated that environmental enrichment alters the adult zebrafish’s behavioral response, keeping it more regular than the control group (SE) and, probably, this is due to stimulation of process directed to stress response of novelty as well as of pathways related to adaptability. In addition, we have demonstrated that habituation to the condition by a longer protocol of enriched environment is more important to trigger the increase of vGluT2 protein expression in total brain of adult zebrafish.

Introdução: Os ovos de Zebrafish que não são fertilizados podem ser uma fonte de alimento para o peixe. O objetivo deste estudo é avaliar a influência do acesso aos ovos de Zebrafish no Índice de Massa Corporal, níveis séricos de colesterol e triglicérides e acúmulo de gordura no hepatócito. Materiais e métodos: Zebrafish adultos de ambos sexos foram divididos em dois grupos: grupo 1 com acesso livre aos próprios ovos e grupo 2 com o fundo do aquário coberto de bolas de vidro para evitar o acesso aos ovos por duas semanas. Para a coleta de sangue, ambos os grupos foram mantidos em jejum pelo período de 24 horas antes da coleta. O IMC foi medido em gramas por centímetro quadrado (g/cm²). Para coletar as amostras sanguíneas, os animais foram anestesiados e uma incisão, anterior a cauda, foi realizada para acessar a veia dorsal. Uma pipeta automática foi utilizada para coletar o sangue que foi centrifugado obtendo soro para análises. Os níveis séricos de triglicérides e colesterol foram analisados com testes colorimétricos. O fígado foi coletado para análise histológica. O n utilizado foi 4 para cada grupo. Para as análises bioquímicas foram utilizados pools de 10 peixes. Resultados: Os resultados estão expressos em média ± erro padrão. Não houve diferença significativa no IMC (grupo 1 0,037 ± 0,009 g/cm² e grupo 2 0,035 ± 0,008 g/cm²) nem nos níveis de colesterol (colesterol total: grupo 1 362 ± 73 mg/dL e grupo 2 357 ± 23 mg/dL; HDL – colesterol: grupo 1 91,22 ± 1,79 grupo 2 72,14 ± 2,89; LDL – colesterol: grupo 1 55,68 ± 10,88 grupo 2 44,18 ± 9,84 ). No entanto, houve diferença significativa nos níveis de triglicérides séricos (grupo 1 457 ± 43 mg/dL e grupo 2 292 ± 111 mg/dL P=0,03). Não foi observado acúmulo de lipídeos nos hepatócitos. Conclusões: O acesso aos próprios ovos alterou os níveis de triglicérides sem modificar os níveis de colesterol, alterar o IMC nem acumular gordura nos hepatócitos. / Introduction: The Zebrafish eggs that are not fertilized can be a food source for the fish. The aim of this study was to measure the influence of accessing eggs in Body Mass Index, cholesterol and triglycerides serum levels and lipid accumulation in hepatocyte of Zebrafish. Material and Methods: Adult Zebrafish of both genders were divided into two groups: group 1 free access to their own eggs and group 2 with the bottom of the aquarium filled with glass balls to prevent them to access their eggs for two weeks. To the blood collection, both groups were kept fasting for 24 hours before the blood collection. The body mass index (BMI) was measure in gram per square centimeter (g/cm²). To collect the blood samples, animals were anesthetized and an incision was made before the tail to access the dorsal vein. We used an automatic pipette to collect the blood. It was centrifuged and serum was obtained for analysis. Triglycerides and cholesterol seric levels were analyzed with colorimetric tests. The liver was collected to histological analysis. The n used was 4 for each group. Pools with serum of 10 animals were used to biochemical analysis. Results: The results are expressed in mean ± standard error. There was no significant difference in BMI (group 1 0,037 ± 0,009 g/cm² and group 2 0,035 ± 0,008 g/cm²) neither in cholesterol levels (total cholesterol: group 1 362 ± 73 mg/dL and group 2 357 ± 23 mg/dL; HDL – cholesterol: group 1 91,22 ± 1,79 group 2 72,14 ± 2,89; LDL – cholesterol: group 1 55,68 ± 10,88 group 2 44,18 ± 9,84 ). However, there was a significant difference in triglycerides levels (group 1 457 ± 43 mg/dL and group 2 292 ± 111 mg/dL P=0,03). Lipid accumulation was not observed in hepatocytes. Conclusion: Having access to eggs seams to influence the Zebrafish´s triglycerides serum levels without modifying the BMI and cholesterol serum levels neither lipid accumulation in hepatocytes.

O pentilenotetrazol (PTZ) é um agente convulsivo amplamente utilizado em modelos animais para investigações envolvendo crises convulsivas. Embora haja um crescente número de estudos envolvendo zebrafish adulto e convulsão, não há até o momento uma caracterização comportamental detalhada do modelo de indução de crises por PTZ neste animal. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização detalhada das manifestações comportamentais no modelo de convulsão induzida por PTZ em zebrafish adulto. Grupos de 12 animais foram submetidos, por imersão, a distintas diferentes concentrações de PTZ (5, 7.5, 10 e 15 mM). O comportamento convulsivo foi observado durante 20 minutos. Os animais apresentaram os seguintes escores comportamentais: (0) nados curtos; (1) aumento na atividade natatória e na abertura opercular; (2) movimentos erráticos e acelerados; (3) movimentos circulares; (4) convulsão clônica; (5) convulsão tônica; (6) morte. Os animais expostos a diferentes distintas concentrações de PTZ apresentaram diferentes distintos perfis convulsivos, intensidades de convulsão e latência para chegar aos escores. Apenas os animais imersos na concentração de 15 mM apresentaram maior tempo para retornar ao comportamento normal após a exposição ao PTZ. A mortalidade foi de 33% e 50% para as concentrações de 10 mM e 15 mM, respectivamente. No intuito de avaliar abordagem perfil comportamental frente ao pré-tratamento de um fármaco anticonvulsivo, 12 animais foram expostos a diazepam (DZP) por 40 min e após expostos ao PTZ (10 mM). O tratamento com DZP atenuou a severidade da convulsão, mas não o tempo necessário para retornar ao comportamento normal. Levando em consideração que este modelo baseia-se na imersão direta do animal a uma solução de PTZ, avaliamos também as concentrações cerebrais deste agente convulsivo. Além disso, investigamos também uma possível correlação entre a concentração cerebral de PTZ, o tempo e a concentração de exposição. Os resultados decorrentes da exposição dos animais a 5 e 10 mM de PTZ, apontam para uma correlação tempo e concentração dependentes. Os resultados deste trabalho demonstram uma caracterização comportamental detalhada ao longo do tempo de exposição ao PTZ, além de avaliar pela primeira vez a intensidade de convulsão, tempo de retorno ao comportamento normal e mortalidade dos animais. Além disso, pela primeira vez foram determinadas as concentrações cerebrais deste composto neste modelo de convulsão em zebrafish adulto. Por fim, espera-se que tais ferramentas comportamentais e de quantificação cerebral deste composto possam ser úteis em futuras investigações translacionais e estudos que tenham como objetivo melhor compreender esta desordem. / Pentylenetetrazole (PTZ) is a common convulsant agent used in animal models to investigate the mechanisms of seizures. Although adult zebrafish have been recently used to study epileptic seizures, a thorough characterization of the PTZ-induced seizures in this animal model is missing. The goal of this study was to perform a detailed temporal behavior profile characterization of PTZ-induced seizure in adult zebrafish. The behavioral profile during 20 min of PTZ immersion (5, 7.5, 10, and 15 mM) was characterized by stages defined as scores: (0) short swim, (1) increased swimming activity and high frequency of opercular movement, (2) erratic movements, (3) circular movements, (4) clonic seizure-like behavior, (5) fall to the bottom of the tank and tonic seizure-like behavior, (6) death. Animals exposed to distinct PTZ concentrations presented different seizure profiles, intensities and latencies to reach all scores. Only animals immersed into 15 mM PTZ showed an increased time to return to the normal behavior (score 0), after exposure. Total mortality rate at 10 and 15 mM were 33% and 50%, respectively. Considering all behavioral parameters, 5, 7.5, 10, and 15 mM PTZ, induced seizures with low, intermediate, and high severity, respectively. Pretreatment with diazepam (DZP) significantly attenuated seizure severity. Finally, the brain PTZ levels in adult zebrafish immersed into the chemoconvulsant solution at 5 and 10 mM were comparable to those described for the rodent model, with a peak after a 20-min of exposure. The PTZ brain levels observed after 2.5-min PTZ exposure and after 60-min removal from exposure were similar. Altogether, our results showed a detailed temporal behavioral characterization of a PTZ epileptic seizure model in adult zebrafish. These behavioral analyses and the simple method for PTZ quantification could be considered as important tools for future investigations and translational researches.

Epilepsia é um grupo de desordens neurológicas caracterizada por crises epilépticas recorrentes não provocadas, afligindo 50 milhões de pessoas no mundo. Embora grande parte dos casos possa ser controlada através de medicação um número significativo de pacientes torna-se refratários apesar do tratamento com drogas anticonvulsivantes. Apesar do desenvolvimento bemsucedido de várias novas drogas antiepilépticas, a busca por novas terapias com maior eficácia e tolerabilidade ainda permanece um objetivo importante. O modelo de epilepsia induzido por pilocarpina tem sido amplamente utilizado em roedores para o estudo da patogênese da epilepsia do lobo temporal. Embora estes estudos com modelos animais tenham aumentado nossa compreensão das bases patológicas da epilepsia, os complexos mecanismos epileptogênicas e a geração de crises epilépticas ainda não foram completamente elucidados. Ultimamente, foram desenvolvidos estudos avaliando as características comportamentais de peixe-zebra e peixe-zebra (Danio rerio). Esse vertebrado é um modelo experimental que vem se consolidando em áreas da ciência por ter características bastante atrativas como pequeno custo e espaço requerido para manutenção, homologia genética e anatômica tornando-se de grande valia para uma maior compreensão dos mecanismos envolvidos nas crises epilépticas. A partir disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar e caracterizar comportalmentalmente as crises epilépticas induzidas por pilocarpina em peixezebra adulto. Para isso, os animais foram pré-tratados com uma curva de concentrações de pilocarpina nas doses de 150, 200, 300, 350 e 400 mg/Kg e filmados por 30 minutos. Com a maior dose foi observado um perfil claro de crise tônico-clônica. O uso do anticonvulsivo escopolamina na dose de 1mg/Kg, ip, 30 minutos antes da aplicação de PILO na maior concentração 400mg/Kg mostrou-se capaz de prevenir a crise tônico-clônica induzida pela PILO. A avaliação comportamental pós-crise foi realizada no aparato open-tank três dias após a crise quando os animais foram filmados por 6 minutos. Foram analisados distância percorrida, tempo móvel, tempo no topo e tempo no fundo. Os resultados deste estudo permitiram uma caracterização temporal das manifestações comportamentais das crises epliepticas em peixe-zebra adulto induzidas por diferentes concentrações de pilocarpina. / Epilepsy is a group of neurological disorders characterized by recurrent seizures. It affect about 50 million people worldwide, therefore a public health problem of great importance. While most cases can be controlled through medication, a significant number of patients continue to have seizures despite treatment with anticonvulsant drugs. Despite the successful development of several new antiepileptic drugs, the search for new and more effective therapies and greater tolerability remains an important goal. The pilocarpine model has been extensively used in rodents for the study of neural molecular cascades and mechanisms involved in the pathogenesis of temporal lobe epilepsy. Although studies with animal models have increased our understanding of the pathological bases of epilepsy, the epileptogenic complex mechanisms and the generation of epileptic seizures have not yet been fully elucidated. Lately, studies evaluating behavioral characteristics of zebrafish (Danio rerio) were developed. This vertebrate is an experimental model that has been consolidated in various areas of science for having very attractive features as small cost and space requirements for maintenance, rapid development and life cycle, large offspring, translucent embryos and susceptibility to manipulation and microinjection. Hence, the use of new models becomes of huge value to a greater understanding of the mechanisms involved in this pathology and thus the zebrafish emerges as a complementary alternative for the study of seizures and epilepsy. This study aimed to evaluate and characterize the seizures induced by pilocarpine in adult zebrafish. First, animals were treated with a pilocarpine at different concentrations (150, 200, 300 and 400 mg/kg) and filmed for 30 minutes. Tonic-clonic seizures were observed in the higher dose. When scopolamine, an anticholinergic anticonvulsant, was injected 30 minutes before the higher dose treatment, the pilocarpine-induced seizure was prevented. The post seizure behavioral evaluation was performed in the opentank apparatus three days after injection and filmed for 6 minutes. Measures analyzed in open-tank were distance traveled, moving time and time at the top and in the background. Taken together, our results allowed a temporal characterization of the seizures behavioral manifestations induced by different concentrations of pilocarpine in adult zebrafish.

A hiperprolinemia é uma doença metabólica que pode ser causada por dois distintos erros inatos do metabolismo da prolina. A hiperprolinemia tipo I ocorre por uma deficiência na enzima prolina oxidase, enquanto que a hiperprolinemia tipo II é causada pela ausência da atividade da enzima Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. Os pacientes afetados por essa doença geralmente apresentam manifestações neurológicas, tais como convulsões, déficit cognitivo e retardo mental. Além disso, tem sido descrita uma associação entre a hiperprolinemia moderada e doenças psiquiátricas. Entretanto, os mecanismos neuroquímicos relacionados a esses sintomas neurológicos ainda são pouco compreendidos. Portanto, no presente estudo, investigamos o efeito da exposição aguda e crônica à prolina sobre parâmetros comportamentais em peixe-zebra, tais como: atividade locomotora, ansiedade e interação social. Além disso, avaliamos o efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da acetilcolinesterase (AChE), bem como sobre a atividade e expressão gênica das ectonucleotidases em cérebro de peixe-zebra. Para os estudos in vivo, os animais foram expostos a duas concentrações de prolina (1,5 e 3,0 mM) durante 1 hora ou 7 dias (tratamento agudo e crônico, respectivamente). Para os ensaios in vitro, diferentes concentrações de prolina foram testadas (variando de 3,0 a 1000 μM). A exposição aguda à prolina não promoveu alterações significativas nos parâmetros bioquímicos e comportamentais analisados. Entretanto, a exposição crônica à prolina na concentração de 1,5 mM provocou um aumento na atividade locomotora do peixe-zebra, caracterizada pelo aumento no número de linhas cruzadas (47%), na distância total percorrida (29%) e na velocidade média (33%). Um aumento significativo no tempo gasto na parte superior do aquário (91%) também foi observado após esse mesmo tratamento, o que pode ser interpretado como um comportamento ansiolítico. A prolina na concentração de 1,5 mM também induziu o déficit de interação social (78%), quando comparado ao grupo controle. Além disso, exposição crônica aumentou significativamente a atividade da AChE em ambos os grupos tratados (34% e 39%). Esse mesmo tratamento também aumentou a hidrólise de ATP em ambas as concentrações testadas (14% e 22%, respectivamente), enquanto que a hidrólise de ADP e AMP aumentou apenas na concentração de 3,0 mM (21% e 17%, respectivamente). A expressão gênica da E-NTPDase3 aumentou em ambos os grupos tratados após a exposição crônica à prolina, enquanto que a E-NTPDase1 teve seus níveis de transcritos aumentados apenas na concentração de 3,0 mM. A prolina, quando avaliada in vitro, não promoveu alterações significativas nas atividades das ectonucleotidase e da AChE. Por fim, demonstramos, ainda, que as alterações comportamentais e o aumento da atividade da AChE induzidos pela prolina foram completamente revertidos pela administração aguda de um antipsicótico atípico (sulpirida), mas não por um típico (haloperidol). Em conjunto, estes dados demonstram que a exposição crônica à prolina induz alterações comportamentais, bem como aumenta a atividade da AChE e catabolismo de nucleotídeos em cérebro de peixe-zebra. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados às manifestações neurológicas verificadas em pacientes hiperprolinêmicos, como os transtornos psicóticos e cognitivos. Além disso, este estudo pode facilitar o uso do peixe-zebra como modelo experimental para o estudo de erros inatos do metabolismo que afetam o sistema nervoso central. / Hyperprolinemia is a metabolic disease that may be caused by two distinct inborn errors of proline metabolism. Hyperprolinemia type I occurs by a deficiency in proline oxidase, while the hyperprolinemia type II is caused by an absence of Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid dehydrogenase. Patients affected by this disease usually present neurological manifestations, such as seizures, cognitive impairment, and mental retardation. Moreover, an association between psychiatry disorders and moderate hyperprolinemia has been reported. However, the mechanisms related to these neurological symptoms still remain poorly understood. Therefore, in the present study, we investigated the effect of short- and long-term proline exposure on behavioral parameters in zebrafish, such as locomotor activity, anxiety, and social interaction. In addition, we evaluated the in vivo and in vitro effects of proline on acetylcholinesterase (AChE) activity, as well as on ectonucleotidase activities and gene expression in zebrafish brain. For the in vivo studies, animals were exposed at two proline concentrations (1.5 and 3.0 mM) during 1 hour or 7 days (short- or long-term treatments, respectively). For the in vitro assays, different proline concentrations (ranging from 3.0 μM to 1000 μM) were tested. Short-term proline exposure did not promote significant changes on the behavioral and biochemical parameters analyzed. Long-term exposure at 1.5 mM proline caused an increase in locomotor activity in zebrafish, characterized by an increase in the number of line crossings (47%), in the total distance traveled (29%), and in the mean speed (33%). A significant increase in the time spent in the upper portion of the test tank was also observed after the same treatment (91%), which may be interpreted as an indicator of anxiolytic behavior. Proline at 1.5 mM also induced social interaction impairment (78%), when compared to the untreated group. Moreover, long-term proline exposure significantly increased AChE activity for both treated groups (34% and 39%). This treatment also increased ATP catabolism in both concentrations tested (14% and 22%, respectively), whereas ADP and AMP hydrolysis were increased only at 3.0 mM proline (21% and 17%, respectively). The gene expression of E-NTPDase3 increased in both treated groups after long-term proline, whereas E-NTPDase1 transcript levels increased only at concentration of 3.0 mM. Proline, when assessed in vitro, did not promote significant changes on AChE and ectonucleotidase activities. At last, we demonstrated the proline-induced behavioral changes and increase in AChE activity were completely reversed by acute administration of an atypical antipsychotic drug (sulpiride), but not by a typical (haloperidol). Altogether, these data demonstrate that long-term proline exposure induces behavioral changes as well as increases AChE activity and nucleotide catabolism in zebrafish brain. These findings may contribute, at least in part, to better understand the mechanisms related to the neurological manifestations observed in hyperprolinemic patients, such as the psychotic and cognitive dysfunctions. Moreover, this study might facilitate the use of the zebrafish as experimental model for studying inborn errors of amino acid metabolism that affect the central nervous system.